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문제 정의
- 본 연구에서는 한국형 기후에 맞는 콘크리트 적용을 위해 콘크리트 포장도로로 부터 탄산칼슘형성 미생물을 분리하여 대조군인 Sporosarcina pasteurii KCTC3558과 콘크리트 환경에 대한 생장률을 비교하고자 하였으며, 추가적으로 요소 분해 활성과 탄산칼슘 형성을 확인하였다.
제안 방법
- 온도 스트레스 실험을 위해 24시간 배양한 미생물을 4045 × g에서 5분간 원심 분리 후 PB로 세척하여 O.D600 = 1.0이 되도록 설정하였다.
- 100 µL 멸균 증류수를 첨가한 후 진탕 혼합을 수행하였고, cover glass에 30 µL의 혼합액을 떨어뜨려 50℃에서 완전히 건조시킨 다음 X-선 회절 분석기 (DMAX-2500, Rigaku, Tokyo, Japan)의 10-90°에서 2θ 간격으로 탄산칼슘을 확인하였다.
- 각 미생물의 요소분해 활성 측정을 위해 250 µL 미생물시료, 500 µL urea solution, 그리고 250 µL PB를 혼합하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 phenol-nitroprussid solution과 hydrochlorite solution을 각각 2 mL씩 가하였다.
- 여과액 1 mL에 100 µL의 50 mM CaCl2 멸균 수용액을 첨가하여 침전반응을 통한 탄산칼슘 형성을 확인하였다.
- 형성된 단일 콜로니의 탄산칼슘 형성을 확인하기 위해 액체 배지에 28℃, 200 rpm으로 72시간 동안 배양한 후, 이를 0.2 µm syringe filter로 여과하여 미생물을 제거하였다.
- pasteurii KCTC3558을 대조군으로 사용하였다. 추가적으로 분리된 미생물들 중 요소 분해 활성이 좋은 5종의 미생물을 선택하여 16S rDNA 염기서열분석을 통하여 분자 동정하였다.
- Natarajan et al. [18]이 사용한 요소 효소 측정을 변형하여 요소 분해 활성을 측정, 계산하였다. 분리된 탄산칼슘형성 미생물과 S.
- 전배양이 완료된 후 배양액을 5 mL YA 배지에 1% 접종하여 28℃, 200 rpm 8시간 본배양하였다. 그 후 원심분리기 (VS-550, Vision Scientific Co., LTD, Bucheon, Korea)를 이용, PB로 3회 세척하였고, 분광광도계 (Utrospec 2000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 O.D600 = 0.1이 되도록 미생물 시료를 PB로 희석하였다. 각 미생물의 요소분해 활성 측정을 위해 250 µL 미생물시료, 500 µL urea solution, 그리고 250 µL PB를 혼합하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 phenol-nitroprussid solution과 hydrochlorite solution을 각각 2 mL씩 가하였다.
- D600에서 흡광도를 측정하였다. Standard curve는 0.1 mM-1 M의 NH4Cl을 사용하여 측정하였으며, 시료의 흡광도를 standard curve에 적용시켜 암모늄의 농도를 산출하였다. 실험에 사용된 미생물의 단백질 양을 측정하기 위해 M.
- Park et al. [20]에서 연구된 배지를 일부 변형하여 CaCl2-BPU 고체배지 (BPU media, 1.5% agar, 50 mM CaCl2)에 미생물을 획선도말하여 28℃에서 3일간 배양한 후, 광학현미경(LEICA DMLS, Leica, Weitzlar, German) 으로 탄산칼슘 형성 여부를 확인하였다. 5 mL BPU 액체배지에 탄산칼슘 형성 미생물을 접종하여 24시간 동안 배양한 후, 0.
- 온도 (40-55℃), pH (9.0-13.0), 염분 (0-2.0 M)의 조건에서 미생물의 스트레스 내성을 분석하기 위해 환경 스트레스(pH, 염분, 온도)에 대한 생장률을 비교하였다. pH와 염분 스트레스 실험은 24시간 배양한 미생물을 4045 × g에서 5분간 원심 분리 하여, PB로 O.
- 해당 stress 조건이 처리된 5 mL YA 액체 배지에 미생물을 1% 접종하여, 28℃에서 200 rpm으로 24시간 배양하였다. 그리고 24시간이 지난 후 O.D600에서 흡광도를 측정하여 생장률을 계산하였다 (처리군 배양액의 흡광도/비처리군 배양액의 흡광도).
- 0이 되도록 설정하였다. 그 후 YA 한천 배지에 도말하였고, 각 온도의 조건에서 24시간 동안 배양하여 CFU (Colony Forming Unit)를 측정, 생장률을 계산하였다 (처리군 CFU/28℃ 배양된 CFU).
- 결과적으로 요소 분해효소가 활성화되면, 암모늄이온 방출량이 촉진되어 pH가 높아지게 되므로, 결국 미생물학적 탄산칼슘이 증가하게 된다 [15]. 분리된 탄산칼슘형성 미생물은 총 54종이었으며, 대조군 S. pasteurii KCTC3558과 함께 요소 분해 활성을 측정하였다 (Fig. 1). 그 후 분리 미생물 중 요소 분해 활성이 높은 5종을 선택 하였고, 대조군인 S.
- 1). 그 후 분리 미생물 중 요소 분해 활성이 높은 5종을 선택 하였고, 대조군인 S. pasteurii KCTC3558과 비교하였다. 그 결과, S.
- 콘크리트 환경에 미생물을 적용시키기 위해, 콘크리트 경화 및 양생단계에서 발생되는 열과 pH 증가에 대한 생장률 실험을 하였다. 또한, 추가적으로 해양환경에 적용시키기 위해 염분에 대한 생장률 실험을 하였다.
- 콘크리트 환경에 미생물을 적용시키기 위해, 콘크리트 경화 및 양생단계에서 발생되는 열과 pH 증가에 대한 생장률 실험을 하였다. 또한, 추가적으로 해양환경에 적용시키기 위해 염분에 대한 생장률 실험을 하였다. 대조군과 분리 미생물간 열 스트레스에 대한 생장률은 5개의 분리 미생물 모두 대조군보다 높은 것으로 나타났다 (Fig.
- 해양환경과 같은 높은 삼투압조건에서의 바이오콘크리트 적용을 위해 삼투압 스트레스 조건 (0-2 M NaCl)에 미생물을 노출시켰다. 그 결과 1 M의 NaCl에서, BC 1과 BC 4는 대조군보다 각각 60.
- 본 연구에서는 콘크리트 내 탄산칼슘 형성 바이오콘크리트 개발을 위해 미생물을 분리하여 대조군인 S. pasteurii KCTC3558과 요소 분해 활성 측정, 탄산칼슘형성을 확인하고, 환경 stress에 대한 생존률을 비교 분석하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 시약으로 Phosphate buffer (PB) (NaH2PO4: 0.10 g/L, Na2HPO4: 26.61 g/L, pH 9.0, 1 mM EDTA) [15], urea solution (3 M urea), phenol-nitroprusside solution (C6H5OH: 43.90 ml/L, Na2[Fe(CN)5NO] · 2H2O: 60 mg/L), hydrochlorite solution (NaOH: 20 g/L, 8% NaOCl: 46.875 g/L), Bradford reagent (SIGMA, St. Louis, MO, USA), crystalline bovine serum albumin (TaKaRa, Kyoto, Japan)을 사용하였다.
- Louis, MO, USA), crystalline bovine serum albumin (TaKaRa, Kyoto, Japan)을 사용하였다. 탄산칼슘형성 미생물의 선택 배지는 BPU 배지 (Beef extract: 3 g/L, Peptone: 5 g/L, Urea: 20 g/L, pH: 9.0) [2]를 사용하였고, 성장 배지로는 YA 배지 (Yeast: 20 g/L, (NH4)2SO4: 9.9 g/L, pH 9.0) [14]가 사용되었으며 121℃, 15분의 조건에서 멸균되었다.
- 시료의 채취는 강원도 원주 내 만종분기점 부근 제 7 지구대 전방의 광장영업소 콘크리트 도로 현장을 답사하였고, 도로 중앙, 방벽, 배수구 등 도로와 도로 주변에서 시료를 채취, 멸균 stainless 용기에 담아 냉장 상태로 운반하였다. 채취한 시료는 분말상태로 만들어 10 g을 계량, 10 mL PB에 넣어 진탕하였다.
- 여과액 1 mL에 100 µL의 50 mM CaCl2 멸균 수용액을 첨가하여 침전반응을 통한 탄산칼슘 형성을 확인하였다. 요소 분해 활성, 탄산칼슘 확인, 다양한 환경 스트레스에 대한 생존률 비교를 위해 기존에 연구된 S. pasteurii KCTC3558을 대조군으로 사용하였다. 추가적으로 분리된 미생물들 중 요소 분해 활성이 좋은 5종의 미생물을 선택하여 16S rDNA 염기서열분석을 통하여 분자 동정하였다.
- 고체 배지를 이용하였다. 이 배지에는 Ca2+과 urea가 들어있기 때문에, urea가 탄산칼슘 미생물에 의해 분해 될 경우, CO32-가 방출되어 Ca2+와 반응, 탄산칼슘이 형성된다 [20].
이론/모형
- 1 mM-1 M의 NH4Cl을 사용하여 측정하였으며, 시료의 흡광도를 standard curve에 적용시켜 암모늄의 농도를 산출하였다. 실험에 사용된 미생물의 단백질 양을 측정하기 위해 M. M. Bradford [19]의 protein assay를 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- pasteurii KCTC3558과 비교하였다. 그 결과, S. pasteurii KCTC3558의 요소 분해 활성이 16.1 U으로 높았으며, 나머지 분리한 5종의 미생물 0.5-5 U 사이의 요소 분해 활성으로 측정되었다. 분리 미생물의 16S rDNA 염기서열 분석결과, 4종의 Sporosarcina pasteurii와 1종의 Sporosarcina luteola로 분자동정 되었으며, 이를 BC 1-5로 약칭하였다.
- 5-5 U 사이의 요소 분해 활성으로 측정되었다. 분리 미생물의 16S rDNA 염기서열 분석결과, 4종의 Sporosarcina pasteurii와 1종의 Sporosarcina luteola로 분자동정 되었으며, 이를 BC 1-5로 약칭하였다.
- 이 배지에는 Ca2+과 urea가 들어있기 때문에, urea가 탄산칼슘 미생물에 의해 분해 될 경우, CO32-가 방출되어 Ca2+와 반응, 탄산칼슘이 형성된다 [20]. 광학현미경 (LEICA DMLS, Leica, Weitzlar, German)을 이용하여 콜로니 주변에 형성된 광물결정을 관찰한 결과, 3가지 형태의 탄산칼슘결정이 관찰되었다 (Fig. 2(a)).
- 2(a)). BC 2, BC 4, 그리고 대조군에서 각주형태의 결정모양이 관찰되었고, BC 1과 BC 5에서는 둥근 형태의 결정모양이 관찰되었으며, BC 3의 경우, 다른 광물에 비해 다소 작은 형태의 광물이 관찰되었다 (Fig. 2(a)).
- 이는 다양한 광물결정의 모양과 크기는 콜로니 형태 및 분비되는 외부물질의 분자적 특이성에 기인하기 때문이다 [21]. 또한 X-선 회절분석 결과, 주로 탄산칼슘이 생성됨을 확인하였고, 탄산칼슘의 이성질체인 바테라이트도 미량 발견되었다 (Fig. 2(b)).
- 또한, 추가적으로 해양환경에 적용시키기 위해 염분에 대한 생장률 실험을 하였다. 대조군과 분리 미생물간 열 스트레스에 대한 생장률은 5개의 분리 미생물 모두 대조군보다 높은 것으로 나타났다 (Fig. 3(a)).
- 3(a)). 40℃에서 대조군이 모두 사멸함에도 불구하고 분리 미생물 모두 60-80%의 높은 생장률을 나타냈으며, BC 4와 BC 5의 경우 50℃에서 40%의 생장률을 보였다. 이를 통해 분리 미생물 자체가 수화열 최저 온도인 50℃에서 증식이 가능함을 알 수 있었다.
- 40℃에서 대조군이 모두 사멸함에도 불구하고 분리 미생물 모두 60-80%의 높은 생장률을 나타냈으며, BC 4와 BC 5의 경우 50℃에서 40%의 생장률을 보였다. 이를 통해 분리 미생물 자체가 수화열 최저 온도인 50℃에서 증식이 가능함을 알 수 있었다. 열에 대한 내성이 강한 미생물일수록 포자 형성 시 더 높은 열 저항성을 보유하여 [22] 포자 형성 시 수화열 최고 온도인 60℃ 이상에서 생장할 수 있다는 가능성을 보였다.
- 열에 대한 내성이 강한 미생물일수록 포자 형성 시 더 높은 열 저항성을 보유하여 [22] 포자 형성 시 수화열 최고 온도인 60℃ 이상에서 생장할 수 있다는 가능성을 보였다. pH에 대한 생장률은 분리 미생물 BC 1-3과 BC 5의 경우 pH 10에서 30%의 생장률을 보였으며, BC 4와 대조군에서는 각각 68.1%와 65.9%의 생장률을 보였다 (Fig. 3(b)).
- 그러나 pH 10을 초과한 환경에서는 생장을 확인할 수 없었다. 이 결과, 실험에 사용된 미생물은 콘크리트 환경 (pH 12)에서 사멸하거나 포자를 형성할 것으로 판단된다 [23]. 이에 대한 대책으로는 미생물의 포자 형성을 통해 콘크리트 중성화 시 영양 세포로 전환되어 탄산칼슘 형성 작용을 유지하거나, 미생물을 담체화시킴으로써 고 알카리 (pH 12)에서 미생물의 내성을 높이는 방법, 또는 포자 형성과 담체화 방법을 동시 적용시켜 미생물의 생장을 유지시키는 방법이 있다 [15,24].
- 해양환경과 같은 높은 삼투압조건에서의 바이오콘크리트 적용을 위해 삼투압 스트레스 조건 (0-2 M NaCl)에 미생물을 노출시켰다. 그 결과 1 M의 NaCl에서, BC 1과 BC 4는 대조군보다 각각 60.4%와 70.4%의 높은 생장률을 보였다 (Fig. 3(c)).
- 3(c)). 평균 해수 염도보다 높은 염도 (평균 해수 염도: 3.4-3.5%, 1M NaCl: 5.8%)에서도 위 미생물들이 생장률을 유지함을 고려하면, 해양환경에서도 높은 생장률을 유지할 수 있을 것으로 판단된다.
- 분리된 미생물들은 모두 탄산칼슘 형성 능력을 보였지만, 형성된 광물의 형태는 3가지로 다르게 나타났다. 요소 분해활성 측정에서, 분리 미생물들은 대조군에 비해 3-31%의 낮은 요소 분해 활성을 보였다. 그러나 대조군인 S.
- 이는 포자 형성 시 최고 수화열에 해당되는 60℃에서도 높은 생존률을 보장할 수 있을 것으로 사료된다. 일반적인 해수 염도 3.4%-3.5% 보다 더 높은 염도인 5.8%에서는 대조군인 S. pasteurii KCTC 3558에 비해 BC 1과 BC 4가 높은 생장률을 보여, 해양환경에 대한 바이오 콘크리트 적용에 대한 가능성을 보였다. pH의 경우, 모든 미생물들이 pH 10까지 생장하며, 분리한 미생물인 BC 4와 대조군인 S.
- 9%로 생장률이 비슷하였다. 위의 결과를 통해, BC 4가 온도, pH, 염도에 대해 가장 높은 생장률을 보임을 알 수 있었다. 추후, 분리한 BC 4 미생물을 이용하여 포자 형성 및 담체화를 통해 복합적인 콘크리트 환경을 동시에 적용할 수 있도록 할 계획이다.
후속연구
- 위의 결과를 통해, BC 4가 온도, pH, 염도에 대해 가장 높은 생장률을 보임을 알 수 있었다. 추후, 분리한 BC 4 미생물을 이용하여 포자 형성 및 담체화를 통해 복합적인 콘크리트 환경을 동시에 적용할 수 있도록 할 계획이다.
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