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문제 정의
- 본 연구는 사람에 위암 및 위궤양을 유발하여 심각한 임상결과를 초래하는 H. pylori에 효과적인 천연물 유래 항균물질을 개발하고자 천련자 추출물의 H. pylori 항균효과 연구가 수행되었다.
- pylori는 사람의 병태생리와 유사하게 만성으로 진행되어 위염, 위궤양과 위암을 유발하는 것으로 알려져 있다 [5]. 본 연구자들은 사람의 H. pylori 감염 동물모델인 Mongolian gerbil을 이용하여 H. pylori 감염 후 천련자 추출물 적용에 의한 치료효과를 확인하고자 하였다. 사육기간 중 온도는 23 ± 1℃, 습도 50 ± 5%, 소음 60 phone 이하, 조명시간 08:00~20:00(1일 12시간), 조도 150~300 Lux, 환기는 시간당 10~12회의 환경에서 사육되었으며, 사료는 실험동물 전용사료(샘타코, 한국)를 2.
- 천련자 추출물을 오랜 기간 섭취함으로 인해 독성발현으로 의심되는 세포 손상이 있는지 알아보기 위한 독성 평가 실험을 수행하였다. 실험은 9주령 수컷 Mongolian gerbil을 사용하여 수행되었으며, 28일 동안 매일 400 mg/kg 용량으로 시험물질을 경구 투여하였다.
제안 방법
- 9주령에서 13주령까지, 즉 H. pylori 감염이 유지되는 시점으로부터 4주간의 시험물질 투여 기간, 각 시험군의 동물들은 1주에 1회 체중을 측정하고 실험 종료일인 13주령에 각 개체를 12시간 절식한 후 에테르 마취 하에 안락사 시킨 후 위를 적출하여 육안병변점수를 구하였다. 또한 신속요소분해효소검사를 통하여 감염 여부를 확인하였으며, 추가적인 병리조직학적 검사를 통하여 병리조직점수를 구하여 천련자 추출물 투여가 헬리코박터 세균 감염에 미치는 영향을 평가하였다.
- H. pylori 균주를 10% calf serum이 첨가된 브루셀라 한천 배지 플레이트에 도말(streak)하고 대조를 위한 항생제 디스크 겐타마이신(바이엘동물약품, 한국), 가나마이신(바이엘동물약품, 한국) 및 엔로플록사신(바이엘동물약품, 한국)을 적용용량으로는 각각 0.25 mg, 0.5 mg, 0.25 mg씩 적용하였다. 천련자 추출물 30 mg을 dimethyl sulfoxide(DMSO; Sigma, USA) 100 µL에 녹여 300 mg/mL 농도로 디스크 여과지에 5 µL씩 100(1.
- 절식 동안에 음수는 자유 급이 할 수 있도록 하였다. H. pylori 또는 PBS를 투여한 I군과 III군의 동물들은 2주일 후인 9주령부터 천련자 추출물을 체중 기준으로 400 mg/kg 용량으로 경구 투여를 4주간, 즉 13주령까지 연일 투여하였다. 이 기간 동안 II군 및 IV군의 동물들은 다른 처치 없이 사료와 음수를 자유 급여하였다.
- pylori 감염을 유발하였다. III군 및 IV군의 동물들은 12시간 절식 후 멸균 PBS(pH 7.2)를 0.5 mL씩 경구로 투여하였다. 투여 후 각 군의 동물들은 12시간의 절식 후 사료를 급여하였다.
- Polymerase chain reaction(PCR) 검사는 실험 종료 후 공시동물들의 위 날문부위(pyloric region) 점막 일부를 무균 채취하여 DNA를 추출한 후 H. pylori 존재 유무를 확인하기 위한 PCR을 수행하였다. DNA 추출은 bead beater-phenol extraction method를 사용하였다 [19].
- 본 연구에서 항균효능이 기대되는 천련자 추출물의 anti-H. pylori 효능을 평가 결과 in vitro 실험에서 확인하였다. 또한 천련자 추출물을 이용하여 실험동물을 이용한 in vivo 실험으로 H.
- 1주일간 순화 사육한 7주령의 건강한 수컷 Mongolian gerbil 40두를 실험에 사용하였다. 각 군당 10두의 동물들을 사용하여 H. pylori 감염 후 천련자 추출물 적용군(I군), H. pylori 감염 후 천련자 추출물 무처치 적용군(II군) 및 H. pylori 감염 없이 천련자 추출물 적용군(III군), H. pylori 감염 없이 천련자 추출물 무처치 적용군(IV군)의 4개 군으로 나누어 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 7주령 Mongolian gerbil 을 12시간 절식 시킨 후, I 군 및 II군의 동물들은 1 mL 당 2.
- 각 시험 군별로 시험 종료일에 적출된 위(stomach)는 큰굽이(great curvature)를 따라 절개하여 펼친 후에 실체현미경(× 10)을 사용하여 병변을 관찰하고, 육안 병변의 점수를 산정하였다.
- 선정된 부위들의 조직들은 병리조직학적 검사를 위한 통상적인 방법을 사용하여 파라핀 포매한 후, 4 µm 두께로 절편하여 hematoxylin and eosin(H&E) 염색 후 병리조직학적인 검사를 수행하였다. 각 조직 소견의 병변에 대한 평가를 수행하여 0: no lesion, 1: mild, 2: moderate, 3: severe로 등급을 점수로 환산하여 기록하고, 개체당 3개 부위의 점수의 합을 구하여 개체의 조직병변점수를 구한 후, 각 군의 평균 점수를 구하였다. 신속요소분해효소검사(rapid urease test)는 CLO 검사시약인 ASAN Helicobacter Test(Asan Pharmaceutical, Korea)를 이용하여 수행되었다.
- 무균적으로 적출한 위날문부위(pyloric region) 점막의 조직을 채취하여 ASAN Helicobacter Test에 각각을 넣고 제조회사의 설명서에 따라 배양하여 노란색 배지가 적색으로 변하는 경우를 양성으로 판정하였다. 검사과정을 간략히 설명하면 미리 실온에 방치한 시약을 노란색 한천 겔이 보이도록 스티커를 벗긴 후 무균 바늘을 사용하여 위점막 조직을 겔 속에 밀어 넣고 스티커를 다시 덮은 후 동물번호와 시간을 기입하고 incubator를 이용하여 37℃로 12시간 배양 후에 판독하였다. 판독의 결과 노란색에서 적색으로 배지의 색깔이 바뀐 경우를 양성으로 판정하였다.
- 검체를 1 mL 멸균 증류수가 들어있는 Mini-Bead Beater(Biospec product, USA) 전용 2 mL tube에 무균 채취하여 세절한 후 멸균 3차 증류수에 부유시킨 glass bead(0.1 mm size; Biospec product, USA) 200 µL와 phenolchlorform-isoamyl alcohol 용액(50 : 49 : 1) 200 µL를 넣어 Mini-Bead Beater(Biospec product, USA)로 30초간 5,000 rpm으로 진탕하였다.
- 고정이 완료된 조직들은 병리조직학적 검사를 위한 통상적인 방법을 사용하여 파라핀 포매한 후, 4 µm 두께로 절편하여 H&E 염색 후 병리조직학적인 검사를 수행하였다.
- 본 실험에서는 균이 접종된 배지에 멸균된 디스크를 배치하고, 이후 10% CO2, 100% 습도가 유지되는 항온기에서 배양하고 4일 후 평가하였다. 균을 접종한 후 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 및 60시간 후 각각 표준자를 이용하여 clear zone의 지름으로 표현되는 억제범위(the zone of inhibition)를 측정하여 균이 자라지 않은 clear zone을 관찰하였다. 디스크는 각 시료 당 3개씩 검사하여 억제 범위의 평균값과 표준편차를 구하였다.
- pylori 감염이 유지되는 시점으로부터 4주간의 시험물질 투여 기간, 각 시험군의 동물들은 1주에 1회 체중을 측정하고 실험 종료일인 13주령에 각 개체를 12시간 절식한 후 에테르 마취 하에 안락사 시킨 후 위를 적출하여 육안병변점수를 구하였다. 또한 신속요소분해효소검사를 통하여 감염 여부를 확인하였으며, 추가적인 병리조직학적 검사를 통하여 병리조직점수를 구하여 천련자 추출물 투여가 헬리코박터 세균 감염에 미치는 영향을 평가하였다.
- 신속요소분해효소검사(rapid urease test)는 CLO 검사시약인 ASAN Helicobacter Test(Asan Pharmaceutical, Korea)를 이용하여 수행되었다. 무균적으로 적출한 위날문부위(pyloric region) 점막의 조직을 채취하여 ASAN Helicobacter Test에 각각을 넣고 제조회사의 설명서에 따라 배양하여 노란색 배지가 적색으로 변하는 경우를 양성으로 판정하였다. 검사과정을 간략히 설명하면 미리 실온에 방치한 시약을 노란색 한천 겔이 보이도록 스티커를 벗긴 후 무균 바늘을 사용하여 위점막 조직을 겔 속에 밀어 넣고 스티커를 다시 덮은 후 동물번호와 시간을 기입하고 incubator를 이용하여 37℃로 12시간 배양 후에 판독하였다.
- 시험방법을 간략히 서술하면 다음과 같다. 병리조직학적 검사를 위하여 적출된 위의 일부를 10% 중성 포르말린에 고정하고, 선위(glandular stomach) 부위를 가로 방향으로 5 mm 간격으로 잘라, 개체 당 3개 부위를 선정하였고, 이 때 선별된 부위들은 다른 개체들 간에 서로 동일한 부위가 되도록 주의하여 선정하였다. 선정된 부위들의 조직들은 병리조직학적 검사를 위한 통상적인 방법을 사용하여 파라핀 포매한 후, 4 µm 두께로 절편하여 hematoxylin and eosin(H&E) 염색 후 병리조직학적인 검사를 수행하였다.
- 0015 mg)과 용매대조를 위한 DMSO를 각각 적용하였다. 본 실험에서는 균이 접종된 배지에 멸균된 디스크를 배치하고, 이후 10% CO2, 100% 습도가 유지되는 항온기에서 배양하고 4일 후 평가하였다. 균을 접종한 후 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 및 60시간 후 각각 표준자를 이용하여 clear zone의 지름으로 표현되는 억제범위(the zone of inhibition)를 측정하여 균이 자라지 않은 clear zone을 관찰하였다.
- 사육기간 중 온도는 23 ± 1℃, 습도 50 ± 5%, 소음 60 phone 이하, 조명시간 08:00~20:00(1일 12시간), 조도 150~300 Lux, 환기는 시간당 10~12회의 환경에서 사육되었으며, 사료는 실험동물 전용사료(샘타코, 한국)를 2.0 Mrad의 방사선으로 멸균시켜 자유급식 시켰으며, 음수는 filter 여과 후 자외선 멸균수를 자유 급수 하였다.
- 선정된 부위들의 조직들은 병리조직학적 검사를 위한 통상적인 방법을 사용하여 파라핀 포매한 후, 4 µm 두께로 절편하여 hematoxylin and eosin(H&E) 염색 후 병리조직학적인 검사를 수행하였다.
- 신속요소분해효소검사는 천련자 추출물을 H. pylori 세균 감염과 비감염 동물에 투여하고 H. pylori 세균의 치료에 의한 제거 효과를 확인하기 위하여 수행되었으며, 실험결과는 Table 4와 같았다. 신속요소효소분해검사인 CLO test의 결과는 검체에 감염된 헬리코박터 세균 성장 시 요소효소분해와 제공된 배지의 요소와의 반응 결과로 유도되는 색깔 변화로 감염 여부를 손쉽게 알 수 있는 방법이다 [19].
- 판독의 결과 노란색에서 적색으로 배지의 색깔이 바뀐 경우를 양성으로 판정하였다. 실험 종료 후 양성 판정된 개체의 수를 백분율로 구하여 양성율(Positive percent)을 구하였고 음성 개체수를 군 전체수로 나누어 백분율을 구하여 치료율(Therapeutic percent)을 구하였다.
- 실험은 9주령 수컷 Mongolian gerbil을 사용하여 수행되었으며, 28일 동안 매일 400 mg/kg 용량으로 시험물질을 경구 투여하였다. 실험 종료일 에테르 마취 하에 안락사하여 부검을 실시하고 각 실질 장기의 육안병변을 관찰한 후, 대뇌(cerebrum), 소뇌(cerebellum), 연수(pons), 고환(Testis), 심장(Heart), 간(Liver), 폐장(Lung), 신장(Kidney), 근육(Muscle), 비장((Spleen), 전립선(Prostate), 췌장(Pancreas), 흉선(Thymus), 부신(Adrenal gland), 소장(Small Intestine), 대장(Large Intestine), 골수(Bone marrow), 갑상선(Thyroid gland) 및 정낭(seminal vesicle)을 적출하여 10% 중성완충 포르말린용액(neutral buffered formalin)에 고정하였다. 고정이 완료된 조직들은 병리조직학적 검사를 위한 통상적인 방법을 사용하여 파라핀 포매한 후, 4 µm 두께로 절편하여 H&E 염색 후 병리조직학적인 검사를 수행하였다.
- 실험에 사용된 7주령 Mongolian gerbil 을 12시간 절식 시킨 후, I 군 및 II군의 동물들은 1 mL 당 2.0 × 109 CFU의 H. pylori 균 수가 포함되게 준비된 배양액을 두당 0.5 mL씩 마우스용 존대를 이용하여 경구로 투여하여 H. pylori 감염을 유발하였다.
- 천련자 추출물 30 mg을 dimethyl sulfoxide(DMSO; Sigma, USA) 100 µL에 녹여 300 mg/mL 농도로 디스크 여과지에 5 µL씩 100(1.5 mg), 10−1(0.15 mg), 10−2(0.015 mg), 10−3(0.0015 mg)과 용매대조를 위한 DMSO를 각각 적용하였다.
- 추출된 DNA를 template로 50 ng, 각 primer 20 pmol을 AccuPower PCR Premix tube에 넣고 멸균 증류수로 최종 부피를 20 µL로 맞춘 후, 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 45초의 30 cycle의 PCR을 수행한 후, 1.2% agarose gel에서 458 bp의 특이 밴드의 유무를 확인하였다.
대상 데이터
- 1주일간 순화 사육한 7주령의 건강한 수컷 Mongolian gerbil 40두를 실험에 사용하였다. 각 군당 10두의 동물들을 사용하여 H.
- H. pylori(ATCC 43504; American Tissue Culture Collection, USA) 균주를 10% calf serum이 첨가된 브루셀라 한천배지에 접종 후, 10% CO2 및 100% 습도가 유지되는 37℃ incubator에서 3일간 배양 하였다. 배양된 H.
- 배양된 H. pylori를 멸균된 PBS(pH 7.2)가 들어 있는 튜브에 모은 후, 1 mL당 2.0 × 109 colony-forming unit(CFU)의 균 수를 포함하게 준비하여 실험에 사용하였다.
- 시험에 사용된 천련자는 익산시 대학한약국으로부터 한국산으로 판매되고 있는 건조된 천련자(Meliae fructus)를 구입하여 분쇄기(DA700; 대성아트론, 한국)로 입자 크기가 30메시 이하가 되도록 분쇄하여 천연물 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 천연물 분말(1 kg) 질량의 3배(v/w)에 해당하는 증류수를 포함하는 70% 에틸알콜 수용액을 가하여 100℃에서 3시간 동안 환류 냉각 추출하고 환류 냉각 추출한 후 추출물을 거어즈로 1차 여과하고 3,000 × g에서 3분간 원심 분리하였다.
- 식품의약품안전청 실험동물자원과에서 Specificpathogen free(SPF) 상태로 계통이 유지되고 있는 Mongolian gerbil(Meriones unguiculatus)을 공급받아 원광대학교 동물자원개발연구센터 실험동물사육실(II)에서 일주일 동안 순화 사육한 후 실험에 사용하였다. Mongolian gerbil에 H.
- 천련자 추출물을 오랜 기간 섭취함으로 인해 독성발현으로 의심되는 세포 손상이 있는지 알아보기 위한 독성 평가 실험을 수행하였다. 실험은 9주령 수컷 Mongolian gerbil을 사용하여 수행되었으며, 28일 동안 매일 400 mg/kg 용량으로 시험물질을 경구 투여하였다. 실험 종료일 에테르 마취 하에 안락사하여 부검을 실시하고 각 실질 장기의 육안병변을 관찰한 후, 대뇌(cerebrum), 소뇌(cerebellum), 연수(pons), 고환(Testis), 심장(Heart), 간(Liver), 폐장(Lung), 신장(Kidney), 근육(Muscle), 비장((Spleen), 전립선(Prostate), 췌장(Pancreas), 흉선(Thymus), 부신(Adrenal gland), 소장(Small Intestine), 대장(Large Intestine), 골수(Bone marrow), 갑상선(Thyroid gland) 및 정낭(seminal vesicle)을 적출하여 10% 중성완충 포르말린용액(neutral buffered formalin)에 고정하였다.
데이터처리
- 05 이하 일 때 통계적으로 유의한 것으로 판단되었다. Rapid urease 검사인 CLO test의 각 시험 군의 양성율과 치료율에 대한 95% confidential interval(CI)이 MINITAB software(Minitab, USA)를 사용하여 구해졌다. 각 군의 양성률에 대한 CI가 차이가 있으면 통계적으로 유의한 것으로 판단되었다.
- 육안병변점수는 각 병변의 가로 × 세로 길이(mm2)의 총합으로 계산하였다. 각 개체의 점수를 구한 후 각 군별로 평균 점수를 구하였다.
- 각 시험군의 양성률에 대한 통계는 Repeated Measured ANOVA SPSS(ver. 12, USA)(Duncan’s multiple range test)을 실시하였으며 p < 0.05 이하 일 때 통계적으로 유의한 것으로 판단되었다.
- 균을 접종한 후 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 및 60시간 후 각각 표준자를 이용하여 clear zone의 지름으로 표현되는 억제범위(the zone of inhibition)를 측정하여 균이 자라지 않은 clear zone을 관찰하였다. 디스크는 각 시료 당 3개씩 검사하여 억제 범위의 평균값과 표준편차를 구하였다. 결과의 평가는 항생제 디스크 각각의 주변 clear zone 형성 관찰하고 형성된 clear zone의 지름을 측정하여 지름이 클수록 항균 효과가 높은 것으로 판정하였다.
이론/모형
- pylori 존재 유무를 확인하기 위한 PCR을 수행하였다. DNA 추출은 bead beater-phenol extraction method를 사용하였다 [19]. 검체를 1 mL 멸균 증류수가 들어있는 Mini-Bead Beater(Biospec product, USA) 전용 2 mL tube에 무균 채취하여 세절한 후 멸균 3차 증류수에 부유시킨 glass bead(0.
- Genus Helicobacter의 rpoB DNA 분절을 증폭시킬 수 있는 PCR은 Oh 등 [19]의 방법에 따라 primer 쌍으로 Forward primer(HF; 5' ACTTTAACGCATGAAGATAT 3')와 Reverse primer (HR; 5' ATATTTTGACCTTCTGGGGT 3')를 사용하여 PCR은 Taq DNA polymerase 1 U, 각 dNTP 250 µM, 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2를 포함하는 AccuPower PCR Premix(Bioneer, Korea)를 이용하였다.
- 각 조직 소견의 병변에 대한 평가를 수행하여 0: no lesion, 1: mild, 2: moderate, 3: severe로 등급을 점수로 환산하여 기록하고, 개체당 3개 부위의 점수의 합을 구하여 개체의 조직병변점수를 구한 후, 각 군의 평균 점수를 구하였다. 신속요소분해효소검사(rapid urease test)는 CLO 검사시약인 ASAN Helicobacter Test(Asan Pharmaceutical, Korea)를 이용하여 수행되었다. 무균적으로 적출한 위날문부위(pyloric region) 점막의 조직을 채취하여 ASAN Helicobacter Test에 각각을 넣고 제조회사의 설명서에 따라 배양하여 노란색 배지가 적색으로 변하는 경우를 양성으로 판정하였다.
- 위 점막의 조직병변점수(histological lesion score) 산정은 Yam 등 [28]의 방법에 따라 수행하였다. 시험방법을 간략히 서술하면 다음과 같다.
- 점막의 육안병변점수(gross lesion score) 산정은 Yam 등 [28]의 방법에 따라 수행하였다. 시험방법을 간략히 서술하면 다음과 같다.
성능/효과
- H. pylori 감염 후 천련자 추출물 적용군(I군)은 10두 모두에서 음성의 결과를 보여 H. pylori 감염 양성대조군 II군과 유의한 변화를 보였다(p < 0.05).
- H. pylori 세균 감염 후 천련자 추출물 투여군(I군)은 비투여군(II군)과 비교하여 유의한 체중 증가를 보였다(p < 0.05).
- H. pylori 세균 배양 플레이트에 적용한 대조 항생제 디스크들과 천련자 추출물을 적용한 후 37℃ incubator에서 추가 배양 하면서 적용 디스크 주변 clear zone의 지름 크기를 측정한 결과 각각의 디스크 주변에 H. pylori 세균이 증식하지 못하는 clear zone을 관찰할 수 있었다. 실험결과 Table 1과 같이 적용 후 12시간째 가장 큰 clear zone의 지름을 관찰할 수 있었는데, DMSO는 clear zone의 크기를 관찰할 수 없었고, 대조군으로 사용된 겐타마이신은 8.
- pylori 감염 여부를 판정할 수 있었다(Table 4). H. pylori 양성 검체는 특이 밴드 유무로 확인할 수 있었다. 실험결과, H.
- PCR 검사를 통하여 H. pylori에 특이적인 밴드를 확인함으로써 검사된 위조직 내에 H. pylori 감염 여부를 판정할 수 있었다(Table 4). H.
- 또한, 우수한 anti-H. pylori 효능을 확인한 천련자 추출물에 대한 28일 투여 안전성 평가를 수행한 결과, 천련자 추출물의 400 mg/kg 연일 투여에 의하여 유의한 독성 변화는 관찰되지 않았다. 따라서 천련자 추출물은 안전성이 높은 것으로 판단되었다.
- Rapid urease 검사인 CLO test의 각 시험 군의 양성율과 치료율에 대한 95% confidential interval(CI)이 MINITAB software(Minitab, USA)를 사용하여 구해졌다. 각 군의 양성률에 대한 CI가 차이가 있으면 통계적으로 유의한 것으로 판단되었다.
- 디스크는 각 시료 당 3개씩 검사하여 억제 범위의 평균값과 표준편차를 구하였다. 결과의 평가는 항생제 디스크 각각의 주변 clear zone 형성 관찰하고 형성된 clear zone의 지름을 측정하여 지름이 클수록 항균 효과가 높은 것으로 판정하였다.
- pylori 효능을 평가 결과 in vitro 실험에서 확인하였다. 또한 천련자 추출물을 이용하여 실험동물을 이용한 in vivo 실험으로 H. pylori 감염치료 효능 연구를 수행한 결과 천련자 추출물은 H. pylori 감염을 억제하고 감염에 의한 병변을 완화시켜주는 것을 알 수 있었다. 천련자 추출물을 적용한 H.
- pylori 세균에 음성 결과를 보였다. 반면, H. pylori 감염 후 천련자 추출물 무처치 적용군(II군)은 10마리 개체 모두에서 강한 적색의 H. pylori 세균 양성반응이 검출되었다. H.
- 반면, H. pylori 감염 후 천련자 추출물 적용군(I군)은 10두 모두에서 음성의 결과를 보여 H. pylori 감염 양성대조군 II군과 유의한 변화를 보였다(p < 0.05).
- 반면, 헬리코박터 파일로리 감염 후 천련자 추출물 무처치 적용군(II군)은 천련자 추출물 적용군(I군) 보다 육안병변점수 및 조직병변점수가 유의하게 높은 점수를 보였다(p < 0.05).
- pylori 효능에 대한 보고는 없었다. 본 연구 결과 천련자는 in vitro와 in vivo 실험 둘 다에서 우수한 anti-H. pylori 효능이 있음이 확인되었다.
- 본 연구의 결과를 종합한다면, 항생제 내성문제가 없으며 섭취에 안전성이 높은 천연물 유래 H. pylori 항균물질로서 천련자 추출물은 in vitro 및 in vivo 실험에서 모두 우수한 anti-H. pylori 효능이 확인되었기 때문에 향후 H.
- 실험결과 Table 1과 같이 적용 후 12시간째 가장 큰 clear zone의 지름을 관찰할 수 있었는데, DMSO는 clear zone의 크기를 관찰할 수 없었고, 대조군으로 사용된 겐타마이신은 8.53 ± 0.58 mm, 가나마이신은 9.5 ± 0.58 mm, 엔로플록사신은 15.5 ± 1.15 mm이었으며, 천련자 추출물 1.5 mg은 12.5 ± 0.58 mm, 천련자 추출물 0.15 mg은 9.5 ± 0.58 mm, 천련자 추출물 0.015 mg은 6.5 ± 1.00 mm이었고, 천련자 추출물 0.0015 mg은 clear zone을 관찰할 수 없었다.
- 신속요소효소분해검사인 CLO test의 결과는 검체에 감염된 헬리코박터 세균 성장 시 요소효소분해와 제공된 배지의 요소와의 반응 결과로 유도되는 색깔 변화로 감염 여부를 손쉽게 알 수 있는 방법이다 [19]. 실험결과, H. pylori 감염 없이 천련자 추출물 적용군(III군), H. pylori 감염 없이 천련자 추출물 무처치 적용군(IV군)의 경우에 신속요소분해효소검사에 의하여 H. pylori 세균에 음성 결과를 보였다. 반면, H.
- pylori 양성 검체는 특이 밴드 유무로 확인할 수 있었다. 실험결과, H. pylori 감염 후 천련자 추출물 무처치 적용군(II군)은 10마리 개체 모두에서 양성반응이 검출되었다(Table 4). 반면, H.
- pylori의 높은 유병율과 연관된 결과임을 알 수 있다 [7]. 이러한 연구 결과들에 의하면 H. pylori는 위암의 유발 인자로서 H. pylori 치료 및 감염대책 마련이 시급한 것을 알 수 있다.
- 천련자 추출물을 오랜 기간 섭취함으로 인해 독성발현으로 의심되는 세포 손상이 있는지 알아보기 위해 9주령 수컷 Mongolian gerbil을 사용하여 28일 동안 매일 400 mg/kg용량으로 시험물질을 경구 투여하고 지유의 독성 발현 유무를 평가한 결과 대조군 및 천련자 추출물 투여군의 모든 개체에서 폐사 또는 특이 임상증상은 관찰되지 않았다. 실험 종료일 에테르 마취 하에 안락사하여 부검을 실시하고 각 실질 장기의 육안병변을 관찰한 결과 유의한 병변은 관찰할 수 없었다.
- pylori 감염을 억제하고 감염에 의한 병변을 완화시켜주는 것을 알 수 있었다. 천련자 추출물을 적용한 H. pylori 감염에 대한 in vivo 치료효과 실험결과 위 점막의 H. pylori 제거 효과는 rapid urease CLO test와 PCR 결과로 확인할 수 있었다. 또한, 우수한 anti-H.
- 검사과정을 간략히 설명하면 미리 실온에 방치한 시약을 노란색 한천 겔이 보이도록 스티커를 벗긴 후 무균 바늘을 사용하여 위점막 조직을 겔 속에 밀어 넣고 스티커를 다시 덮은 후 동물번호와 시간을 기입하고 incubator를 이용하여 37℃로 12시간 배양 후에 판독하였다. 판독의 결과 노란색에서 적색으로 배지의 색깔이 바뀐 경우를 양성으로 판정하였다. 실험 종료 후 양성 판정된 개체의 수를 백분율로 구하여 양성율(Positive percent)을 구하였고 음성 개체수를 군 전체수로 나누어 백분율을 구하여 치료율(Therapeutic percent)을 구하였다.
후속연구
- pylori 항균물질로서 천련자 추출물은 in vitro 및 in vivo 실험에서 모두 우수한 anti-H. pylori 효능이 확인되었기 때문에 향후 H. pylori 치료제 개발의 우수한 후보물질로서 이용될 수 있을 것으로 판단되었다.
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