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문제 정의
- 국내에서는 사람의 앵무병은 보고사례가 있으나, 조류의 클라미디아증은 연구나 보고된 것이 없는 실정이다. 따라서 2006년과 2009년에 국내 관상조류 농원의 앵무새 3종에서 확인된 조류 클라미디아균증의 발생과 함께 분리된 Chlamydophila psittaci 균의 유전자형 특성에 대하여 보고하고자 한다.
- 외국의 경우, 야생조류와 관상조류, 가금류의 클라미디아 감염증에 대한 연구논문이 수없이 많이 보고되어 있지만 [3, 4, 17, 18], 국내에서는 앵무류 등에서 발생하고 있는 것으로 알려져 있을 뿐 인체 감염 사례 외에는 조류에서 따로 보고된 논문은 없는 것으로 조사되었다. 따라서 이 논문은 국내 앵무새에서 발생한 클라미디아증과 분리주의 유전자 비교 분석에 대한 최초의 논문으로 생각된다. 국내 동일한 장소에서 사육되는 앵무새로부터 2006년과 2009년에 이 병이 확인되었다는 사실은 공중보건학적 측면에서 중요한 시사성을 가지고 있으며, 다방면에서 더욱 체계적인 조사가 이루어져야 함을 알려주고 있다.
- 그러나 ribosomal DNA에 대한 PCR은 유전자 복제(copy) 수가 많아 민감성은 높은 반면 다른 균과의 교차반응이 많고, ompA 유전자에 대한 PCR은 유전자 복제 수가 적어 민감성이 낮은 반면 특이성(specificity)이 매우 뛰어나다. 이 연구에서는 특이성에 중점을 두고 ompA 유전자를 대상으로 PCR을 실시하였고, 유전자 클로닝에 의하여 분리된 Chlamydophila psittaci의 유전자 서열 분석과 그들간의 상동성 및 분자역학적 근연성을 조사하였다.
제안 방법
- 즉, 정제한 증폭 PCR 산물을 TA Cloning Vector(Real Biotech Corporation, Taiwan)에 삽입한 후 DH5a competent cell(Yeastern Biotech, Taiwan)에 transformation하였다. Cloning 양성으로 판정되는 white colony만을 선택하여 LB broth에 증균시킨 후, DNA-spin Plasmid DNA Purification kit(iNtRON biotechnology)을 이용하여 plasmid DNA만을 순수하게 추출하였다. Plasmid DNA는 Macrogen(Korea)에 분석을 의뢰, ABI PRISM 3730XL Analyzer(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 sequencing을 실시하였다.
- DNA 염기서열은 BioEdit software(ver. 7.0.9; Tom Hall, USA)의 ClustalW Multiple alignment를 이용하여 align한 뒤, MEGA5 software [21]를 이용하여 Neighbor-joining method 로 phylogenetic tree를 작성하였으며, bootstrap 분석은 2,000회 반복하였다.
- PCR 혼합액은 10X PCR buffer 5 µL, 2.5 mM dNTP mixture 5 µL, 10 pmol의 primer CpompA1-F, CpompA1-R 각각 2 µL, genomic DNA 5 µL, 그리고 i-taq DNA polymerase 1 µL를 혼합한 후 멸균된 증류수로 최종 volume을 50 µL로 만들었다.
- PCR로 Chlamydophila psittaci의 ompA 특이유전자를 확인하기 위하여 GenBank database를 참고하여 1쌍의 primer를 제작하였다. Primer의 염기서열은 forward primer는 CPompA1-F, 5’-GACATTTTCTGCACCTTAGG-3’, reverse primer는 CPompA1-R, 5’-ACCTACGCTCCAAGAAAATG3’, PCR 산물의 크기는 195bp이었다.
- PCR로 ompA 특이유전자를 확인한 후, 유전자형(genotype)의 분류를 위하여 Geens 등 [9]과 Vanrompay 등 [24]이 발표한 Chlamydophila psittaci ompA gene의 염기서열 및 GenBank database를 참고하여 1쌍의 primer를 제작하였다. Primer의 염기서열은 forward primer는 CPompA-F, 5’- ATGAAACTCTTGAAATCGG-3’, reverse primer는 CPompA-R, 5’-CCTTAGAATCTGAAWTGAGC-3’, PCR product의 크기는 1211 bp이었다.
- Cloning 양성으로 판정되는 white colony만을 선택하여 LB broth에 증균시킨 후, DNA-spin Plasmid DNA Purification kit(iNtRON biotechnology)을 이용하여 plasmid DNA만을 순수하게 추출하였다. Plasmid DNA는 Macrogen(Korea)에 분석을 의뢰, ABI PRISM 3730XL Analyzer(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 sequencing을 실시하였다.
- 추출한 genomic DNA를 이용하여 94℃에서 5분간 반응 후, 94℃에서 30초간 denaturation, 50℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 35 cycle 진행하였고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. RedSafe Nucleic Acid Staining Solution(iNtRON biotechnology)이 포함된 1.2% agarose gel에서 100 V, 30분간 전기영동한 다음, ultraviolet light transilluminator에서 증폭 산물을 확인하고, QIA quick Gel Extraction kit(QIAGEN, USA)을 이용하여 정제하였다.
- SNU6050은 2006년 폐사한 노랑머리아마존앵무의 간과 장 내용물 시료에서, SNU9038및 SNU9039는 청머리앵무와 붉은이마아마존앵무의 간과 비장 및 장 시료 유제액으로부터 Chlamydophila psittaci를 분리하였고, 전술한 PCR 방법으로 Chlamydophila psittaci에 특이적인 ompA 유전자를 확인하였다(Fig. 3).
- 고정이 된 후 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀에 포매한 다음 hematoxylin & eosin(H&E) 염색을 실시하였다.
- 또한 일부는 항생제가 첨가된 sucrose/phosphate/glutamate(SPG) 완충용액으로 20%로 유제하여 ompA 특이유전자를 확인하였고, 이 유제액을 6일령의 특정병원체 부재(specific pathogen free) 종란의 난황을 통하여 0.2 mL씩 접종한 뒤, 접종 2일 후부터 폐사한 종란으로부터 난황막을 회수한 다음 SPG 완충용액에 20%로 유제하여 –20℃에 보관한 채 ompA유전자 분석에 사용하였다.
- 2006년부터 2009년 사이에 애완조류 농원에서 사육 중이던 노랑머리아마존앵무(Amazona oratrix, Yellow-headed Amazon Parrot), 청머리앵무(Amazona aestiva, Blue-fronted Amazon Parrot)와 붉은이마아마존앵무(Amazona autumnalis, Red-lored Amazon Parrot) 등 총 3마리의 앵무새가 폐사되어 사인분석을 위해서 서울대학교 수의과대학 조류질병학실에 의뢰되었다. 사인분석을 위해서 부검을 실시하였으며, 부검 후 주요 실질장기는 병리조직학적 검사를 위해서 10% 중성 포르말린 용액에 고정하였다. 고정이 된 후 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀에 포매한 다음 hematoxylin & eosin(H&E) 염색을 실시하였다.
- 앵무새 폐사체의 간과 비장으로부터 Viral Gene Spin Viral DNA/RNA Extraction kit(iNtRON biotechnology, Korea)를 이용하여 genomic DNA를 추출한 뒤, i-taq DNA polymerase(iNtRON biotechnology)를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 혼합액은 10X PCR buffer 5 µL, 2.
- 정확한 염기서열의 분석과 유전자형 분류를 위하여 gene cloning을 실시하였다. 즉, 정제한 증폭 PCR 산물을 TA Cloning Vector(Real Biotech Corporation, Taiwan)에 삽입한 후 DH5a competent cell(Yeastern Biotech, Taiwan)에 transformation하였다.
- 정확한 염기서열의 분석과 유전자형 분류를 위하여 gene cloning을 실시하였다. 즉, 정제한 증폭 PCR 산물을 TA Cloning Vector(Real Biotech Corporation, Taiwan)에 삽입한 후 DH5a competent cell(Yeastern Biotech, Taiwan)에 transformation하였다. Cloning 양성으로 판정되는 white colony만을 선택하여 LB broth에 증균시킨 후, DNA-spin Plasmid DNA Purification kit(iNtRON biotechnology)을 이용하여 plasmid DNA만을 순수하게 추출하였다.
- C1000 Thermal cycler(BioRad Laboratories, USA)를 이용하여 94℃에서 5분간 반응 후, 94℃에서 30초간 denaturation, 50℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 40초간 extension을 35 cycle 진행하였고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. 증폭 산물은 RedSafe Nucleic Acid Staining Solution(iNtRON biotechnology)이 포함된 1.2% agarose gel에서 100 V, 30분간 전기영동한 다음, ultraviolet light transilluminator에서 증폭 산물을 확인하였다.
- 진단용 특이 primer로 ompA 특이 유전자가 확인된 분리주는 정확한 염기서열의 분석과 유전자형 분류를 위하여 유전자 클로닝과 염기서열 분석을 실시하였다. SNU9038과 SNU9039는 앵무새 종류만 다를 뿐, 동일한 장소에서 동시에 분리된 균주이므로 분석은 SNU6050과 SNU9038만을 대상으로 하였으며, ompA 유전자 클로닝 후 염기서열 분석 결과 두 분리주의 유전자가 100% 일치함을 확인하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 증폭한 Chlamydophila psittaci ompA gene의 염기서열을 비교 분석하기 위해 GenBank database에서 확보한 염기서열은 다음과 같다: L04980(N352), AY762613(WS/RT/E30), X12647(EAE A22/M), AF269264 (MN Ostriche), AY762611(3759/2), AF269263(MN Rhea), AF269262(MN), AY762610(7344/2), AY762609(41A12), AY762612(7778B15), AF269265(CP3), X56980(6BC), AF269281(MN Zhang), AY762608(90/1051), L25437(GV), AF269268(M56), AF269266(NJ1), AF269267(TT3), Y16562(92/1293), AF269259(VS225), AJ310735(84/2334), AF269260(CT1), AF269261(GD), L25436(Par1), AF269269(WC), AF269282(GPIC), EU856029(SP09) and HM450405(KMZ03).
이론/모형
- Phylogenetic analysis of ompA gene of Chlamydophila psittaci isolated from parrots (nucelotides 61-1098). Nucleotides were analyzed using Clustal W and a phylogenetic tree was constructed by neighbor-joining method.
성능/효과
- SNU9038과 SNU9039는 앵무새 종류만 다를 뿐, 동일한 장소에서 동시에 분리된 균주이므로 분석은 SNU6050과 SNU9038만을 대상으로 하였으며, ompA 유전자 클로닝 후 염기서열 분석 결과 두 분리주의 유전자가 100% 일치함을 확인하였다. Chlamydophila psittaci의 ompA 전체 유전자 염기서열을 Neighbor-joining method로 유전자 근연관계를 비교해 본 결과, SNU6050과 SNU9038은 6BC, MN Zhang, 90/1051, GV, SP09, KMZ03 strain과 같이 genotype A에 속하는 것으로 나타났다(Fig. 4). 따라서 이 농원에서는 2006년과 2009년 앵무류에서 Chlamydophila psittaci의 감염이 있었음이 확인되었고, 분리주의 ompA gene이 100% 일치함을 확인하였다.
- SNU9038과 SNU9039는 앵무새 종류만 다를 뿐, 동일한 장소에서 동시에 분리된 균주이므로 분석은 SNU6050과 SNU9038만을 대상으로 하였으며, ompA 유전자 클로닝 후 염기서열 분석 결과 두 분리주의 유전자가 100% 일치함을 확인하였다.
- 그 결과, 국내 분리주 2주는 유전자가 100% 일치하는 것으로 확인되었고, 분자유전학적 근연관계 조사를 위하여 다른 나라에서 분리, 보고된 Chlamydophila psittaci의 ompA 전체 유전자 염기서열과 비교 분석해 본 결과, SNU6050과 SNU9038은 6BC, MN Zhang, 90/1051, GV, SP09, KMZ03 strain과 같이 genotype A에 속하는 것으로 확인되었다. Genotype A에 속하는 Chlamydophila psittaci는 일반적으로 거의 혈청형 A에 속하는 것으로 보고된 바 있다 [20, 23].
- ompA gene에 대한 PCR 결과 195 bp의 양성 밴드를 확인할 수 있었는데, SNU6050의 경우, 간 조직에서 양성 반응을 나타내었다. 그리고, SNU9038와 SNU9039 모두 간/소장을 합친 시료에서 양성 반응을 확인할 수 있었다.
- 4). 따라서 이 농원에서는 2006년과 2009년 앵무류에서 Chlamydophila psittaci의 감염이 있었음이 확인되었고, 분리주의 ompA gene이 100% 일치함을 확인하였다.
- 세균 검사의 경우, SNU6050의 경우 간에서 대장균이 분리되어, 복합감염이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 또한 부검 및 병리조직 소견과 PCR을 통한 유전자 검출 및 유전자 서열분석으로 Chlamydophila psittaci의 감염이 확인되었고, SNU6050은 대장균 감염이 복합되어 나타난 케이스 임을 확인할 수 있었다.
- 앵무새의 임상증상으로는 원기부족, 사료 섭취량 감소, 호흡기증상 및 폐사 등이 나타날 수 있으며, 병변으로는 맥관 계통(vascular system)의 손상으로 심장, 간 등과 같은 실질 장기와 복강 내에 섬유소성 삼출물이 덮이고, 비장의 종대, 출혈 및 mottling, 폐렴과 기낭염 등이 나타날 수 있다 [3, 4, 17]. 의뢰된 가검물에서도 간헐적 기면증상과 갑작스러운 폐사, 기낭의 염증 및 비후와 염증성 삼출물, 간과 비장의 종대가 있었고, 조직학적으로도 간과 비장에서의 다소성(multifocal) 괴사소가 확인되었다.
- 1). 전체적으로, 기낭염, 간 및 비장의 종대, 다발성 장막염, 그리고 췌장과 선위에 다소성으로 점상 출혈이 나타났다. 청머리앵무는 간 종대와 심장과 간 등의 장막에 하얀 침사가 덮이는 등 통풍에 의한 병변이 확인되었다.
후속연구
- 앵무새가 전국 각 동물원과 애완조류 농장 및 판매상에서 사육되고 있으므로, 비록 이 질병이 사람에게 치명적이지 않지만 인수공통전염병으로서 중요한 위치를 차지하고 있는 점을 감안할 때, 애완조류 농장이나 판매상 등에서 사람과 앵무류가 직, 간접적으로 접촉할 경우 그 감염 위험성은 무시할 수 없는 수준으로 알려져 있다 [8, 14, 16, 22]. 따라서 이 연구 결과는 질병의 전국적 분포, 관상조류 및 애완조류의 감염 실태, 가금류로부터 사람으로의 감염 위험성, 분리주간의 유전적 근연성과 혈청형 분류 등 앞으로 다방면에서 추가 연구가 필요함을 시사하고 있다.
- 그러나 시료의 수도 적었을 뿐만 아니라 의뢰자의 자체적 사정으로 인하여 전반적인 혈청학적 조사가 곤란하였기 때문에 클라미디아 감염증이 지속적으로 발생하고 있는지, 각각 따로 유입되어 발생하였는지에 대하여 알 수는 없었지만 3년의 차이를 두고 분리된 2종의 분리주에서 ompA 유전자가 100% 일치한다는 것은 전자의 가능성이 더 높음을 시사하고 있다. 또한 이 균이 잠복감염하는 특성상 특정한 개체가 지속적인 전염원의 역할을 할 가능성도 배제할 수 없으므로 체계적인 조사 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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