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문제 정의
- C6 glial 세포에서 H2O2와 眞武湯이 활성산소종에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여 실험을 설계하였다. 그 결과, H2O2에 의하여 세포 내 활성 산소종이 증가되었으며, 이러한 증가는 眞武湯에 의하여 감소됨을 확인하였다.
- 따라서 본 연구에서는 H2O2에 의한 C6 glial 세포의 세포사를 확인하고, 眞武湯 추출물을 전처리한 후 활성산소종, 염증성 사이토카인 및 분자생물학적인 변화를 통해 眞武湯의 C6 glial 세포 보호 효과에 관한 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구는 眞武湯의 뇌신경 세포 보호효과를 알아보기 위하여 H2O2에 의해 유도된 C6 glial 세포에 眞武湯을 전처리한 후 세포 생존율, 활성산소종 생성, DNA 절편 생성, 세포자멸사 관련 단백질의 변화, NF-κB 및 TNF-α의 변화를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 을 개선시킨다는 연구가 있다. 이와 같이 眞武湯의 신경세포의 보호효과에 관한 연구는 부족한 상태이며, 근래 소뇌동맥 경색증 등을 진단받은 중추성 어지러움에 眞武湯을 응용하여 유효한 결과를 얻은 증례들이 보고되어16 이를 실험적으로 확인하고자 본 연구를 진행하였다.
제안 방법
- 50 μL의 MTT 반응용액(5 mg/mL MTT/PBS)을 각 실험군에 250 μg/mL이 되도록 처리한 다음, 4시간 동안 배양하여 반응하지 않은 MTT 용액을 버리고, 생존세포에 의한 MTT 반응결과로 생성된 formazan을 DMSO로 용해하여 세포 생존율을 간접적으로 계산하였다.
- C6 glial 세포를 6 well plate에 계대배양한 후 H2O2 및 眞武湯 24시간 동안 처리 후 serum free 배지로 세포를 세척하고, PI/NP40(50 μg/mL PI, 0.03% tergitol, type NP-40)으로 세포핵을 염색하여 형광현미경 혹은 유세포분석기를 이용하여 정량적 및 정성적으로 분석하였다.
- C6 glial 세포를 6cm 배양용기에 계대배양하고, 24시간 동안 H2O2 및 眞武湯을 처리한 다음, 단백질을 추출하기 위하여 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고, RIPA(radioimmunoprecipitation assay) lysis buffer로 용혈하는 방법으로 총 단백질을 얻었다. SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 상에서 전기영동하여 단백질을 분리한 다음, nitrocellulose membrane에 분리된 단백질을 흡착시키고, 여러 1차 항체(Bax, procaspase-3, PARP(poly(ADP-ribose) polymerase), p-IκBα 및 β-actin(Santa Cruz 社, USA))으로 표지하였다.
- C6 glial 세포를 cover glass에 배양한 후 眞武湯과 H2O2를 24시간 동안 처리하여 0.05% PBS-T(phosphate-buffered saline-tween 20)로 세척한 후 1 μg/mL DAPI로 염색하고, 형광현미경으로 세포핵을 관찰하였다.
- DNA의 분절현상을 PI(propidium iodide, Sigma 社, USA) 염색을 통하여 분석하였다. C6 glial 세포를 6 well plate에 계대배양한 후 H2O2 및 眞武湯 24시간 동안 처리 후 serum free 배지로 세포를 세척하고, PI/NP40(50 μg/mL PI, 0.
- C6 glial 세포를 6 well plate에 계대배양 후 170 ng의 플라스미드(85 ng NF-κB luciferase reporter와 85 ng pcDNA3-β-gal), 1 μL TfxTM-50 reagent 및 200 μL serum free DMEM/HG를 처리하여 1시간 동안 배양한 다음, 정상 배지를 넣고 24시간 동안 배양하였다. H2O2 및 眞武湯을 처리하고, 24시간 후 세포를 PBS로 세척하고 reporter lysis buffer로 용혈한다음, Luciferase assay system(Promega 社, USA)으로 luciferase activity를 분석하였다. 모든 과정은 시약 제조사에서 제공한 표준 protocol을 사용하였으며, 3회 이상 반복한 결과를 통계처리하였다.
- H2O2에 의해 유도된 C6 glial 세포사에 대해 眞武湯의 효과를 알아보기 위하여 C6 glial 세포에 眞武湯을 1시간 동안 전처리한 다음, 100 μM H2O2로 24시간 동안 자극하고, 세포 생존율을 MTT 방법으로 조사하였다.
- NF-κB p65/p50이 활성화되어 핵으로 이동 후 target prometer gene에 결합하는 과정을 확인하기 위하여 luciferase reporter 분석을 수행하였다.
- SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 상에서 전기영동하여 단백질을 분리한 다음, nitrocellulose membrane에 분리된 단백질을 흡착시키고, 여러 1차 항체(Bax, procaspase-3, PARP(poly(ADP-ribose) polymerase), p-IκBα 및 β-actin(Santa Cruz 社, USA))으로 표지하였다.
- SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 상에서 전기영동하여 단백질을 분리한 다음, nitrocellulose membrane에 분리된 단백질을 흡착시키고, 여러 1차 항체(Bax, procaspase-3, PARP(poly(ADP-ribose) polymerase), p-IκBα 및 β-actin(Santa Cruz 社, USA))으로 표지하였다. 다음으로 2차 항체로 다시 표식한 다음, 목적 단백질의 발현 정도를 ECL 용액(enhanced chemiluminescene kit, Roche 社, USA)을 처리하여 분석하였다.
- 및 眞武湯을 처리한 후, 세포를 serum free 배지로 세척한 다음, 10 μM DCF-DA로 30분 동안 염색하고, 유세포분석기(Flow cytometer, BD FACSCaliber, USA)로 관찰하였다. 또한 C6 glial 세포를 cover glass에 배양한 후, 眞武湯 및 H2O2를 처리한 다음, DCF-DA로 염색하고, 형광현미경으로 분석하였다.
- 본 연구에서 이후 모든 실험을 400 μg/mL 농도의 眞武湯을 처리하여 진행하였다.
- 사이토카인 분석은 Quantikine kit(R&D Systems, USA)을 이용하여 분석하였으며, 모든 분석과정은 R&D 社에서 제공한 매뉴얼을 바탕으로 수행하였다.
- 세포 밖으로 분비된 사이토카인을 분석하기 위하여 C6 glial 세포를 24 well plate에 계대배양 후 H2O2 및 眞武湯을 처리하고 24시간이 경과한 다음, 배양 배지에서 사이토카인을 분석하였다. 사이토카인 분석은 Quantikine kit(R&D Systems, USA)을 이용하여 분석하였으며, 모든 분석과정은 R&D 社에서 제공한 매뉴얼을 바탕으로 수행하였다.
- 세포자멸사의 전형적 특징은 DNA의 분절현상으로32 H2O2에 의한 발생한 DNA의 절편과 이에 대한 眞武湯의 영향을 PI 염색을 이용하여 분석하였다. 그 결과, H2O2농도에 따라 DNA 절편이 증가되는 것을 확인하였으며, 眞武湯에 의해 DNA 절편이 감소하여 DNA 분절현상이 억제됨을 확인 하였다.
- 이에 C6 glial 세포사에 대한 眞武湯의 보호효과를 확인하기 위하여 본 연구를 설계하였으며, H2O2 를 처리한 C6 glial 세포에 眞武湯을 전처리하여 세포 생존율을 조사하였고, 세포사의 표지가 되는 활성산소종, DNA 절편, Bax 단백질의 발현, procaspase-3의 진행, PARP 단백질의 분할, NF-κ B의 활성화, 염증성 사이토카인을 관찰하였다.
- 활성산소종은 DCF-DA(2'7'-dichlorofluorescein diacetate, Sigma 社, USA)를 이용하여 정량적 및 정성적 분석이 가능하므로 6 well plate에 C6 glial 세포를 계대배양하고, 24시간 동안 H2O2및 眞武湯을 처리한 후, 세포를 serum free 배지로 세척한 다음, 10 μM DCF-DA로 30분 동안 염색하고, 유세포분석기(Flow cytometer, BD FACSCaliber, USA)로 관찰하였다.
대상 데이터
- H2O2로 유도된 C6 glial 세포 손상을 세포핵의 형태를 통하여 분석하기 위하여 DAPI(2-[4-amidinophenyl]-6-indolecarbamidine dihydrochloride) 염색을 사용하였다. C6 glial 세포를 cover glass에 배양한 후 眞武湯과 H2O2를 24시간 동안 처리하여 0.
- 백서 C6 glial 세포주는 ATCC(American Type Cell Culture, Korambiotech, USA)에서 구입하여 5% CO2/95% air 세포배양기에서 열에 의해서 비활성된 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco 社, USA)와 항생제가 포함된 DMEM /HG(dubellco`s minimum essential medium - high glucose, Sigma 社, USA) 배양액으로 배양하여 실험 목적에 따라 사용하였다.
- 에 의거하였다. 약재는 원광대학교 전주한방병원에서 구입하여 정선한 것으로 사용하였으며, 1 貼의 내용과 분량은 다음과 같다(Table 1)
- 원심분리한 시료의 상층액을 0.2 μm filter에 통과시켜 멸균한 후 냉장보관하면서, 사용 시에는 진공 건조된 眞武湯 시료를 세포배양용 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma 社)에 용해한 후 100 mg/mL의 저장용액을 조제하여 사용하였다.
데이터처리
- H2O2 및 眞武湯을 처리하고, 24시간 후 세포를 PBS로 세척하고 reporter lysis buffer로 용혈한다음, Luciferase assay system(Promega 社, USA)으로 luciferase activity를 분석하였다. 모든 과정은 시약 제조사에서 제공한 표준 protocol을 사용하였으며, 3회 이상 반복한 결과를 통계처리하였다.
- 표시된 실험 결과는 3회 이상의 독립적인 실험의 결과이며, 통계처리는 One-Way ANOVA analysis 방법으로 처리하였고, p-value가 0.05 미만, 0.01 미만(p＜0.05, p＜0.01)의 경우를 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- C6 glial 세포를 24 well plate에 0.05×106 cells/well이 되도록 계대배양하고 H2O2 및 眞武湯을 농도별로 24시간 동안 처리한 다음, CV(crystal violet, Sigma 社, USA) 염색을 수행하여 세포형태학적 분석을 수행하였고, 세포 생존율은 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol -2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma社, USA) 분석방법을 이용하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 분석기로 흡광도 570 nm에서 측정하였다.
- C6 glial 세포에서 IκBα의 인산화에 대해 H2O2 및 眞武湯이 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blot 방법으로 분석하였다.
- JMT was incubated for 24 hr at the indicated concentrations. The cell viability was assessed by MTT assay. Data represent the mean±S.
- at indicated concentrations. The cell viability was measured by MTT assay. Data represent the mean±S.
- 본 실험에 사용된 眞武湯의 처방 내용은 ≪方藥合編≫12에 의거하였다. 약재는 원광대학교 전주한방병원에서 구입하여 정선한 것으로 사용하였으며, 1 貼의 내용과 분량은 다음과 같다(Table 1)
성능/효과
- 3. 眞武湯은 C6 glial 세포에서 H2O2로 유도된 활성 산소종의 생성을 감소시켰다.
- C6 glial 세포에서 H2O2에 의한 활성산소종 생성과 이에 대한 眞武湯의 영향을 조사하기 위하여 DCF-DA 염색하여 유세포분석기로 분석한 결과 H2O2 처리군에서는 대조군에 비하여 38.1% 정도의 활성산소종 증가를 나타내었으며, 眞武湯 및 H2O2를 같이 처리한 군에서는 활성산소종이 10.3%로 감소되었음을 확인할 수 있었다. 眞武湯 단독 처리군에서는 활성산소종이 대조군과 유사한 정도로 나타남을 확인하였다(Fig.
- C6 glial 세포에서 IκBα의 인산화를 조사한 결과, H2O2에 의해 인산화가 증가됨을 확인 하였고, 眞武湯이 이를 억제하는 것으로 확인하였다.
- 그 결과, H2O2농도에 따라 DNA 절편이 증가되는 것을 확인하였으며, 眞武湯에 의해 DNA 절편이 감소하여 DNA 분절현상이 억제됨을 확인 하였다. DAPI 염색을 이용하여 H2O2 및 眞武湯을 처리한 후 세포핵 형태 변화를 관찰한 결과, H2O2 가 처리된 C6 glial 세포는 세포사가 유도되어 핵이 응축되고 나아가 세포자멸 소체(apoptotic body)를 형성하였으며, 이러한 현상이 眞武湯에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 7, 8).
- DCF-DA는 세포 내 활성산소종과 반응하여 녹색 형광을 나타내므로 C6 glial 세포를 DCF-DA로 염색하고 형광현미경으로 분석한 결과 H2O2 처리 군에서는 DCF-DA green fluorescence이 확인되어 다량의 활성산소종이 발견되었으며, 주로 핵보다는 세포기질(cytosol) 부분에서 강하게 발현되는 것을 알 수 있었다. 眞武湯을 H2O2와 같이 처리한 실험군에서는 H2O2 처리군에 비해 활성산소종이 적게 발현되었으며, 대조군과 眞武湯 단독 처리군에서는 basal level의 발현을 나타내었다(Fig.
- 에 의해 유도되는 세포자멸사와 관련하여 현저하게 발현이 증가됨을 확인할 수 있었으며, 이러한 발현 증가가 眞武湯에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다. H2O2 처리 시 procaspase-3가 진행(processing)되어 감소하는 것을 확인할 수 있었고 이러한 감소가 眞武湯에 의해 진행이 억제되어 증가함을 확인할 수 있었다. 동일한 패턴으로 H2O2에 의해 나타나는 PARP 단백질의 분할(cleavage)이 眞武湯에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig.
- H2O2가 C6 glial 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 H2O2를 농도별로 C6 glial 세포에 24시간 동안 처리한 후 MTT 분석 방법을 통하여 세포 생존율을 조사한 결과, 농도 의존적으로 C6 glial 세포의 세포사가 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 1).
- 세포자멸사의 대표적인 단백질로 Bax, procaspase-3, PARP를 고려할 수 있다33. H2O2는 C6 glial 세포에 작용하여 Bax 단백질의 발현, procsapase-3와 PARP 단백질의 진행을 유도하였으며, 이러한 현상은 眞 武湯에 의해 억제되는 것을 확인하였다. H2O2에 의해 활성화된 caspase-3 단백질의 효소 역시 眞武湯 에 의해 활성이 감소되는 것을 확인하였다(Fig.
- H2O2는 IκBα의 인산화를 증가시켰으며, 이러한 증가에 대해 眞武湯은 억제효과를 나타내는 것으로 확인되었다(Fig. 11A).
- H2O2로 유도된 C6 glial 세포 손상을 세포핵의 형태를 통하여 분석하기 위하여 DAPI 염색후 형광현미경으로 세포핵을 관찰한 결과 대조군과 眞 武湯 단독 처리군에서는 정상적인 핵만을 관찰할 수 있었던 반면, H2O2가 처리된 군에서는 정상 세포핵 뿐만 아니라 전형적 세포사 현상의 하나인 핵 응축(nuclei condensation)현상이 나타남을 확인할 수 있었고, H2O2와 眞武湯을 함께 처리한 군에서는 대조군이나 眞武湯 단독 처리군과 유사한 정도로 응축현상이 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 8).
- H2O2로 유도된 C6 glial 세포의 DNA 분절현상을 확인하기 위하여 PI 염색을 통하여 유세포분석 기로 분석한 결과 대조군에서는 PI로 염색된 전형적인 DNA peak를 확인할 수 있었으며, DNA content 103 영역에서 특징적인 cell cycle인 G0/G1 phase 및 G2/M phase가 나타났다. 절편형성된 DNA는 Sub-G0 phase에서 확인할 수 있으므로 H2O2가 처리된 실험군에서는 세포주기에 특이적인 영향은 없었으나 Sub-G0 영역에서 DNA 절편 생성이 23.
- H2O2에 의한 C6 glial 세포의 생존율을 조사한 결과 H2O2 25 μM에서 세포 생존율은 약 80% 이었고, 100 μM에서는 약 50%의 세포 생존율을 나 타내었으며, H2O2 농도에 의존적으로 세포 생존율이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1)
- H2O2에 의해 유도된 Bax, procaspase-3 및 PARP의 변화를 확인하기 위하여 western blot 방법으로 분석한 결과 Bax는 H2O2에 의해 유도되는 세포자멸사와 관련하여 현저하게 발현이 증가됨을 확인할 수 있었으며, 이러한 발현 증가가 眞武湯에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다. H2O2 처리 시 procaspase-3가 진행(processing)되어 감소하는 것을 확인할 수 있었고 이러한 감소가 眞武湯에 의해 진행이 억제되어 증가함을 확인할 수 있었다.
- H2O2에 의해 유도된 C6 glial 세포사에 대해 眞 武湯의 효과를 CV 염색 후 현미경을 통해 조사한 결과 H2O2 처리군은 어떠한 처리도 하지 않은 대조군에 비해 C6 glial 세포의 세포사가 현저하게 증가되었음을 확인할 수 있었으며, H2O2와 眞武湯을 같이 처리한 실험군에서는 대조군이나 眞武湯 단독 처리군과 유사한 세포형태를 나타내는 것을 알 수 있었다(Fig. 4).
- H2O2에 의해 유도된 C6 glial 세포사에 대해 眞 武湯의 효과를 알아보기 위하여 MTT 방법으로 조사한 결과 H2O2를 처리하여 약 50%의 세포 생존율을 나타내었으며, 이러한 조건에서 眞武湯을 전처리한 경우 50 μg/mL에서 60%, 100 μg/mL에서 70%, 200 μg/mL에서 85% 및 400 μg/mL에서 95% 이상의 세포 생존율을 나타내어 농도 의존적으로 H2O2에 의한 세포사를 억제하는 것으로 확인되었다(Fig. 3).
- H2O2는 C6 glial 세포에 작용하여 Bax 단백질의 발현, procsapase-3와 PARP 단백질의 진행을 유도하였으며, 이러한 현상은 眞 武湯에 의해 억제되는 것을 확인하였다. H2O2에 의해 활성화된 caspase-3 단백질의 효소 역시 眞武湯 에 의해 활성이 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 9, 10). 이러한 연구결과를 통해 眞武湯이 지연성 세포사의 주된 경로인 세포자멸사를 억제함을 알 수 있었으며, 眞武湯이 허혈성 뇌졸중의 치료에 응용 될 수 있을 것으로 생각된다.
- NF-κB luciferase reporter 분석을 수행하여 NF-κB의 활성화를 확인한 결과, H2O2처리군은 대조군에 비해 NF-κB의 활성이 증가되는 것을 보였으며, 이러한 증가가 眞武湯에 의해서 현저하게 억제됨을 확인할 수 있었다.
- NF-κB에 의해 활성화되는 대표적 염증성 사이토카인인 TNF-α 생성을 분석하였으며, 그 결과, H2O2는 TNF-α 분비를 촉진시켰으며, 眞武湯은 이러한 TNF-α의 분비를 억제하는 효과를 나타내었다(Fig. 12)
- procaspase-3가 진행되어 생성된 caspase-3의 활성에 眞武湯이 어떤 영향을 미치는지를 조사한 결과 H2O2가 처리된 C6 glial 세포에서는 caspase-3 활성이 증가되는 반면, 眞武湯이 처리된 C6 glial 세포에서는 caspase-3 활성이 감소되는 것을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 Fig. 9에서 확인되었던 眞武湯에 의한 procaspase-3 진행 억제와 상호 연관성 있게 caspase-3 활성을 감소시키는 것을 알 수 있다(Fig. 10).
- 眞武湯 자체의 독성을 조사하기 위하여 세포 생존율을 조사한 결과 眞武湯은 400 μg/mL의 농도까지 C6 glial 세포의 생존율에 영향을 주지 않았으며, 600 및 800 μg/mL에서 약간의 독성을 나타내는 것으로 확인되었다(Fig. 2).
- 眞武湯에 의한 세포 보호효과를 확인하기 위하여 眞武湯을 농도별로 1시간 전처리한 후 100 μM H2O2로 24시간 동안 배양한 결과, 眞武湯이 농도 의존적으로 H2O2에 의한 세포사를 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 400 μg/mL 농도에서 대조군과 유사한 세포 생존율을 나타내었다(Fig. 3, 4).
- 에 의한 발생한 DNA의 절편과 이에 대한 眞武湯의 영향을 PI 염색을 이용하여 분석하였다. 그 결과, H2O2농도에 따라 DNA 절편이 증가되는 것을 확인하였으며, 眞武湯에 의해 DNA 절편이 감소하여 DNA 분절현상이 억제됨을 확인 하였다. DAPI 염색을 이용하여 H2O2 및 眞武湯을 처리한 후 세포핵 형태 변화를 관찰한 결과, H2O2 가 처리된 C6 glial 세포는 세포사가 유도되어 핵이 응축되고 나아가 세포자멸 소체(apoptotic body)를 형성하였으며, 이러한 현상이 眞武湯에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 와 眞武湯이 활성산소종에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여 실험을 설계하였다. 그 결과, H2O2에 의하여 세포 내 활성 산소종이 증가되었으며, 이러한 증가는 眞武湯에 의하여 감소됨을 확인하였다. 활성산소종이 생성되는 주요 세포 내 기관은 미토콘드리아와 원형질막 (plasma membrane)으로 DCF-DA 염색을 통해 세포 내 활성산소종을 형태학적으로 관찰할 수 있었으며, 眞武湯에 의해 발현이 억제됨을 알 수 있었다(Fig.
- H2O2 처리 시 procaspase-3가 진행(processing)되어 감소하는 것을 확인할 수 있었고 이러한 감소가 眞武湯에 의해 진행이 억제되어 증가함을 확인할 수 있었다. 동일한 패턴으로 H2O2에 의해 나타나는 PARP 단백질의 분할(cleavage)이 眞武湯에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 9).
- 또한 H2O2에 의해 증가된 TNF-α의 생성이 眞武湯에 의해 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 11A, 11B, 12).
- ≪傷寒論≫에서는 太陽病 發汗 汗出不解 其人仍發熱 心下悸 頭眩 身瞤動 振振欲擗地者 眞武湯主之라 하여 어지러움에 眞武湯을 응용하였고9, 그 밖에 筋惕身瞤11,24, 虛冷으로 인한 泄瀉, 軟便, 浮腫, 全身困倦, 食慾不振12, 25에 응용하였다. 문헌 고찰을 통하여 眞 武湯이 浮腫, 小便不利를 동반한 眩暈을 치료함을 알 수 있으며, 이를 근거로 임상에서 중추성 어지러움에 眞武湯을 응용하여 유효한 효과를 거둔 사례를 다수 확인할 수 있었다.
- 3%로 증가되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 DNA 절편의 증가는 眞武湯처리에 의하여 대조군이나 眞武湯 단독 처리군과 유사한 정도로 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 7).
- 이상의 결과로부터 眞武湯은 활성산소종 생성 억제, DNA 분절현상 억제, Bax의 발현 억제, procaspase-3의 진행 억제, PARP 단백질의 분할 억제 및 NF-κB 활성화 억제의 경로를 통하여 C6 glial 세포의 보호효과가 있음을 알 수 있었다.
- 이상의 결과에서 眞武湯 추출물의 C6 glial 세포 보호효과는 활성산소종 생성 억제, DNA 분절현상 억제, Bax의 발현 억제, procaspase-3의 진행 억제, PARP 단백질의 분할 억제 및 NF-κB 활성화 억제의 경로를 통하는 것으로 나타났다. 따라서 眞武湯은 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이에 본 연구에서는 활성산소종인 H2O2을 이용하여 뇌세포에서 유래한 C6 glial 세포의 세포사를 유도한 후 眞武湯을 전처치하여 관찰할 결과, 眞武湯이 허혈성 뇌졸중의 다양한 세포사 경로를 억제하는 데에 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
- 로 유도된 C6 glial 세포의 DNA 분절현상을 확인하기 위하여 PI 염색을 통하여 유세포분석 기로 분석한 결과 대조군에서는 PI로 염색된 전형적인 DNA peak를 확인할 수 있었으며, DNA content 103 영역에서 특징적인 cell cycle인 G0/G1 phase 및 G2/M phase가 나타났다. 절편형성된 DNA는 Sub-G0 phase에서 확인할 수 있으므로 H2O2가 처리된 실험군에서는 세포주기에 특이적인 영향은 없었으나 Sub-G0 영역에서 DNA 절편 생성이 23.3%로 증가되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 DNA 절편의 증가는 眞武湯처리에 의하여 대조군이나 眞武湯 단독 처리군과 유사한 정도로 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig.
- 핵 내로 이동한 NF-κB의 활성화에 대한 H2O2 및 眞武湯의 영향을 알아보기 위하여 NF-κB luciferase reporter 분석을 수행한 결과 H2O2 처리군에서는 대조군에 비해 NF-κB의 활성이 증가되었으며, 이러한 증가가 眞武湯에 의해 현저하게 억제됨을 확인할 수 있었다.
- 그 결과, H2O2에 의하여 세포 내 활성 산소종이 증가되었으며, 이러한 증가는 眞武湯에 의하여 감소됨을 확인하였다. 활성산소종이 생성되는 주요 세포 내 기관은 미토콘드리아와 원형질막 (plasma membrane)으로 DCF-DA 염색을 통해 세포 내 활성산소종을 형태학적으로 관찰할 수 있었으며, 眞武湯에 의해 발현이 억제됨을 알 수 있었다(Fig. 5, 6).
후속연구
- NF-κB의 활성화 및 IκB의 인산화를 관찰하여 眞武湯이 전염증 단계에서 광범위하게 염증반응을 억제한다는 사실을 확인하였으나, TNF-α 외에 다른 종류의 염증성 사이토카인에의 영향에 대한 실험이 추가적으로 시행되어야 할 것으로 생각된다.
- 9, 10). 이러한 연구결과를 통해 眞武湯이 지연성 세포사의 주된 경로인 세포자멸사를 억제함을 알 수 있었으며, 眞武湯이 허혈성 뇌졸중의 치료에 응용 될 수 있을 것으로 생각된다.
- 生薑 은 활성산소종 제거능 및 NF-κB 활성 억제 작용 이 있는 것으로 보고되었으며29, 白茯苓은 항산화 작용30 및 백서의 국소 뇌혈류량을 증가시킨다는 보고가 있다31. 이를 통해 H2O2로 유도된 C6 glial 세포사에 대해 眞武湯이 보호효과가 있을 것으로 예상할 수 있으며 항응고 및 혈관확장, 혈류량을 증가를 통해 허혈성 뇌졸중을 치료하는데 유효할 것으로 생각된다.
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