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문제 정의
- 17,18) 본 연구는 알레르기와 과민반응 억제 효과가 보고된 지실이 피지선에서 지질 합성을 촉진하는 효과를 확인하고 지질 합성을 촉진하는 전사인자 sterol regulatory elementbinding protein-1(SREBP-1)와 peroxisome proliferator- activated receptors(PPARs) 및 fatty acis synthase(FAS)의 변화를 조사하였다.
- 20,21) 그러므로 지실 추출물이 SZ95 세포에서 PPAR들의 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 지실 추출물을 처리하고 3일간 배양한 후 PPAR-α, -β, -γ 단백질 발현을 조사한 결과 PPAR-β와 -γ의 발현이 확인 되었으며 농도의존적인 단백질 발현 증가를 보여주었다(Fig.
- 19,20) SREBP-1은 유전자 이식 생쥐의 간에서 squalene synthase의 전사를 증가시키고, squalene synthase mRNA는 SZ95 세포에서 발현되고 있음이 보고되었다. 따라서 본 실험에서 지실이 SZ95 세포의 SREBP-1과 FAS의 발현에 관여하는지 조사하였다. 지실 추출물을 농도별로 처리하고 3일간 배양한 후 단백질 발현을 조사한 결과 SREBP-1과 FAS 단백질 발현이 증가됨을 관찰할 수 있었고, 양성 대조군으로 사용한 linoleic acid 또한 단백질 발현이 증가되었다(Fig.
제안 방법
- 4 − Lipid contents were analyzed by HPTLC to assess the SZ95 sebocyte lipid profile. Analysis of lipid by HPTLC was performed to investigated SZ95 sebocyte lipid induced by EPF and linoleic acid. EPF and linoleic acid (100 µM) increased synthesis of squalene, comparing with control.
- 3차 증류수로 2회 세척한 후 Harris hematoxylin 염색하였다. Glass slide를 glycerin jelly로 봉입하여 현미경으로 SZ95 세포의 지방소적을 관찰하였다. 지질 정량은 Nile red로 염색 후 유세포 분석기(Flow cytometry)로 측정하였다.
- SZ95 세포는 10% fetal bovine serum(FBS), 5 ng/ml human epidermal growth factor, 1 mM CaCl2가 첨가된 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)/F12(1 : 1)을 사용하여 CO2 incubator(37℃, 5% CO2)에서 배양했고, 배지는 2~3일 주기로 교체하였다.
- SZ95 세포로부터 지질을 추출하기 위하여 15 cm dish에 2×106개씩 분주하고 시료를 처리하여 3일간 배양하였다.
- SZ95 세포를 10cm 배양용기에 1.2×106 세포/dish의 밀도로 분주하여 부착시키고 지실에탄올추출물을 3일간 처리하였다.
- SZ95 세포를 chamber slide에 분주 후 3일 동안 배양하고 세포내 지방소적(lipid droplet)을 관찰하기 위해 propylene glycol에 녹인 0.8% Oil red O 용액에 1시간 염색하고 85% propylene glycol 용액에 1분간 처리하였다. 3차 증류수로 2회 세척한 후 Harris hematoxylin 염색하였다.
- SZ95 세포에서 생성된 지질 성분들의 변화를 확인하기 위하여 지질을 추출 하고, HPTLC를 이용하여 지질 성분을 분석하였다. 표준물질은 squalene, cholesterol, fatty acid, ceramide를 사용하였다.
- TBST로 세척한 후 이차항체 anti-rabbit, anti-mouse IgG conjugated horseradish peroxidase와 1시간 반응시킨 후 WEST-ZOL®(plus) Western blot detection system(iNtRON, Korea)을 사용하여 ChemiDoc으로 band의 사진을 촬영하였다.
- 24 well plate에 SZ95 세포 2×104개를 분주하여 24시간 동안 배양한 후 지실 추출물을 농도별로 처리한 다음 3일 배양하였다. 배양완료 후 0.5 mg/ml MTT 용액을 넣어 2시간 동안 37oC에서 배양한 다음 상층액을 제거하고 formazan 침전물에 1ml의 DMSO를 넣어 약 15분간 실온에서 방치한 후 570 nm의 파장에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하여 세포생존율을 계산하였다.
- 유세포 분석기로 측정하기 위하여 배양된 세포를 수거하고 PBS에 1 µg/ml로 희석된 Nile red 용액에 15분간 반응시켰다. 염색된 세포는 PBS로 씻어준 다음 유세포 분석기를 이용하여 세포내 지질의 양을 측정하였다.
- 배양된 세포는 PBS로 3회 씻어준 후 formaldegyde 4% 용액으로 5분간 고정하고, Nile red 용액으로 15분간 실온에서 염색한 다음 PBS로 3회 씻어 주었다. 염색된 세포는 형광현미경(fluorescence microscopy)를 사용하여 관찰하였다. 유세포 분석기로 측정하기 위하여 배양된 세포를 수거하고 PBS에 1 µg/ml로 희석된 Nile red 용액에 15분간 반응시켰다.
- 지실이 lipid 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 지실 12.5와 25 µg/ml 농도에서 Oil red O 염색을 실시하여 세포내 지방소적의 변화를 관찰하였다.
- Glass slide를 glycerin jelly로 봉입하여 현미경으로 SZ95 세포의 지방소적을 관찰하였다. 지질 정량은 Nile red로 염색 후 유세포 분석기(Flow cytometry)로 측정하였다. Nile red는 DMSO에 1 mg/ml로 녹인 것을 -70℃ 에 보관하고, PBS에 1 µg/ml로 희석하여 사용하였다.
대상 데이터
- The proportion of survival cells was measured by MTT assay. The experiments were performed in triplicate. Data presented as means±S.
- 본 실험에 사용된 지실(ponciri Fructus)은 경북 영천시에서 채취한 국산 규격품을 정선하여 사용하였다. 지실 200 g에 EtOH 2 l를 가하고 2일 후 거즈와 여과지(No.
- 사람의 피지선세포주인 SZ95 세포는 독일 베를린자유대학의 대학의학센타 벤자민 프랭크린(The Free University of Berlin, University Medical Center Benjamin Franklin)의 Dr. Zouboulis로부터 분양받았다. SZ95 세포는 10% fetal bovine serum(FBS), 5 ng/ml human epidermal growth factor, 1 mM CaCl2가 첨가된 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)/F12(1 : 1)을 사용하여 CO2 incubator(37℃, 5% CO2)에서 배양했고, 배지는 2~3일 주기로 교체하였다.
- SZ95 세포에서 생성된 지질 성분들의 변화를 확인하기 위하여 지질을 추출 하고, HPTLC를 이용하여 지질 성분을 분석하였다. 표준물질은 squalene, cholesterol, fatty acid, ceramide를 사용하였다. 실험 결과 SZ95 세포로부터 추출된 지질 중 squalene과 cholesterol이 확인되었고, 지실 처리군에서 squalene의 양이 증가되었다.
이론/모형
- 2×106 세포/dish의 밀도로 분주하여 부착시키고 지실에탄올추출물을 3일간 처리하였다. 배양된 세포를 모두 수거하여 lysis buffer로 4℃에서 30분간 용해시킨 후, 15,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 얻은 세포 용해액은 Bradford 방법을 이용하여 단백질정량을 하였다. 세포 용해액은 2×sample buffer와 혼합하여 95℃에서 5분간 끓인 후 7.
- 지실 에탄올추출물이 SZ95 세포의 생존율에 미치는 영향은 MTT assay로 측정하였다. 24 well plate에 SZ95 세포 2×104개를 분주하여 24시간 동안 배양한 후 지실 추출물을 농도별로 처리한 다음 3일 배양하였다.
성능/효과
- 34) 특히 PPAR-γ는 UVB가 조사된 SZ95 세포에서 발현되고 활성화되며, PPAR-γ agonist 처리 후 COX2 mRNA와 단백질 발현이 증가했고 PGE2 생성이 확인되었다.
- 35) 본 연구 결과 지실 추출물은 PPAR-β와 PPAR-γ 단백질 발현을 농도 의존적으로 증가시켰고, 이는 지실 추출물이 SZ95 세포의 분화와 지질생성 조절에 PPAR-β, -γ와 연관되어 있음을 나타낸다.
- 5와 25 µg/ml 농도에서 Oil red O 염색을 실시하여 세포내 지방소적의 변화를 관찰하였다. SZ95 세포에서 지방소적이 핵 주위의 세포질에서 관찰 되었고, 지실을 처리한 군에서 지방소적이 증가됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 2A). 또한 Nile red 염색 결과에서도 지실을 처리한 군에서 지질 생성이 증가하였으며, 양성 대조군으로 사용한 linoleic acid에서도 지질 생성이 현저하게 증가되었다(Fig.
- 2A). 또한 Nile red 염색 결과에서도 지실을 처리한 군에서 지질 생성이 증가하였으며, 양성 대조군으로 사용한 linoleic acid에서도 지질 생성이 현저하게 증가되었다(Fig. 2B). 한편 유세포 분석기를 이용한 지방소적 분석에서도 대조군은 46.
- 이상의 결과를 종합하면 지실 추출물은 세포 독성을 나타내지 않았으며, 세포내 지질 소구의 축적을 유도하였다. 또한 Nile red 염색 후 flow cytometry로 측정한 결과 지질생성이 증가되었다. 지실 추출물에 의해 증가된 지질 성분을 HPTLC를 이용하여 분석한 결과 squalene의 생성이 증가되었다.
- 실험 결과 SZ95 세포로부터 추출된 지질 중 squalene과 cholesterol이 확인되었고, 지실 처리군에서 squalene의 양이 증가되었다. 또한 양성 대조군으로 사용한 linoleic acid 처리군은 squalene의 양이 현저하게 증가되었다(Fig. 4).
- 25-27) 이러한 지질 생성에 지실 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 조사한 결과 지실 추출물은 SZ95세포의 세포질에 지질 소구의 축적을 증가시킴으로써 지질생성을 증가시켰다. 본 연구에서 양성 대조군으로 사용한 linoleic acid는 인체 피지선 세포에서 PPAR의 리간드로 작용하여 지질 생성을 조절한다고 알려져 있는데,28) 본 연구 결과에서도 linoleic acid는 SZ95 세포의 지질생성을 증가시켰다.
- 지실 추출물에 의해 증가된 지질 성분을 HPTLC를 이용하여 분석한 결과 squalene의 생성이 증가되었다. 선행된 연구 결과들에서 지질생성에 관여하는 것으로 보고된 SREBP-1, FAS, PPAR-β, PPAR-γ가 지실 추출물에 의해 단백질 발현이 증가되었다. 따라서 지실 추출물은 피부 지질생성 감소로 인한 피부 질환과 피부 보습을 개선시켜줄 소재로서 개발 할 수 있을 것으로 기대되며 보다 깊이 있는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 표준물질은 squalene, cholesterol, fatty acid, ceramide를 사용하였다. 실험 결과 SZ95 세포로부터 추출된 지질 중 squalene과 cholesterol이 확인되었고, 지실 처리군에서 squalene의 양이 증가되었다. 또한 양성 대조군으로 사용한 linoleic acid 처리군은 squalene의 양이 현저하게 증가되었다(Fig.
- 이상의 결과를 종합하면 지실 추출물은 세포 독성을 나타내지 않았으며, 세포내 지질 소구의 축적을 유도하였다. 또한 Nile red 염색 후 flow cytometry로 측정한 결과 지질생성이 증가되었다.
- 또한 Nile red 염색 후 flow cytometry로 측정한 결과 지질생성이 증가되었다. 지실 추출물에 의해 증가된 지질 성분을 HPTLC를 이용하여 분석한 결과 squalene의 생성이 증가되었다. 선행된 연구 결과들에서 지질생성에 관여하는 것으로 보고된 SREBP-1, FAS, PPAR-β, PPAR-γ가 지실 추출물에 의해 단백질 발현이 증가되었다.
- 따라서 본 실험에서 지실이 SZ95 세포의 SREBP-1과 FAS의 발현에 관여하는지 조사하였다. 지실 추출물을 농도별로 처리하고 3일간 배양한 후 단백질 발현을 조사한 결과 SREBP-1과 FAS 단백질 발현이 증가됨을 관찰할 수 있었고, 양성 대조군으로 사용한 linoleic acid 또한 단백질 발현이 증가되었다(Fig. 5A).
- 지실 추출물을 처리하고 3일간 배양한 후 PPAR-α, -β, -γ 단백질 발현을 조사한 결과 PPAR-β와 -γ의 발현이 확인 되었으며 농도의존적인 단백질 발현 증가를 보여주었다(Fig. 5B).
- 지실이 SZ95 세포 생존율에 미치는 영향은 12.5 µg/ml에서 96.8±9.0%, 25 µg/ml에서 93.0±13.9%, 50 µg/ml에서 91.7±6.0%, 100 µg/ml에서 89.8±8.5% 로 측정되었다(Fig. 1).
- 한편 유세포 분석기를 이용한 지방소적 분석에서도 대조군은 46.14%, 양성 대조군으로 사용한 linoleic acid는 95.98%, 지실 25 µg/ml 처리군은 61.27%로 측정되었다(Fig. 3).
후속연구
- 선행된 연구 결과들에서 지질생성에 관여하는 것으로 보고된 SREBP-1, FAS, PPAR-β, PPAR-γ가 지실 추출물에 의해 단백질 발현이 증가되었다. 따라서 지실 추출물은 피부 지질생성 감소로 인한 피부 질환과 피부 보습을 개선시켜줄 소재로서 개발 할 수 있을 것으로 기대되며 보다 깊이 있는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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