근육세포 내 Glucose 농도와 AICAR에 의한 단백질 합성 저해 AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribonucleoside) Decreases Protein Synthesis in C2C12 Myotubes Cultured in High Glucose Media원문보기
AMP-activated protein kinase (AMPK)는 체내 에너지 수준을 감지하고 당과 지방의 대사를 조절하는 인자로 밝혀졌다. 이러한 에너지 센서로서 AMPK의 역할은 심혈관계 및 비만과 당뇨 등의 대사성 질환에 밀접한 관계가 있다. 영양적 관점에서 AMPK는 지방산의 합성 및 분해를 통해 간에서 지방대사 조절에 중요한 역할을 한다. 특히 근육의 경우 glucose 흡수를 관장하며, 근육세포 내 glucose의 유입을 증가 시킨다. 하지만, AMPK의 활성이 대사기질의 흡수와 이용에 미치는 영향에 대한 정확한 기전은 아직까지 불분명하다. 또한 영양적 수준 차이에 따른 AMPK의 활성이 단백질 합성에 미치는 영향은 아직 보고된 바 없다. 따라서 본 연구의 목적은 C2C12 myotube에서 AMPK 활성물로 알려진 5-aminoimidazole-4-carbozamide-1-${\beta}$-D-ribonucleoside (AICAR)가 glucose 농도차이에 따른 AMPK 활성과 단백질함량에 미치는 영향을 알아보기 위함이다. 배양된 C2C12 근육세포에서 AICAR는 glucose의 함량에 관계없이 AMPK를 활성화 시켰다. 단백질 농도는 낮은 수준 (LG)에 비해 높은 수준의 glucose (HG)가 처리된 myotube에서 증가되었고, AICAR에 의해 그 효과는 더욱 증대 되었다. C2C12 myotube에서 HG 처리는 AMPK와 acetyl CoA carboxylase (ACC)의 인산화에 영향을 주지 않았지만, LG의 처리로 인해 AMPK와 ACC의 인산화가 증가되었다 (p<0.05). 또한, AICAR (2mM)의 처리는 glucose의 수준과는 관계없이 AMPK와 ACC의 인산화를 증가시켰다. 총 단백질 수준은 HG 처리에 의해 증가 되었고, 이는 AICAR의 처리에 의해서 더 높게 증가되었다. Proteasome 활성은 HG 처리구에서 LG에 비해 7.5% 낮게 나타났고, AICAR 처리는 proteasome 활성을 LG와 HG 처리구에서 각각 63%와 54% 감소 시켰다. Glucose의 수준은 mTOR의 인산화 수준에 영향을 주지 않았다. 하지만, AICAR는 LG 처리구에서 만 mTOR의 인산화 수준을 유의적으로 증가시켰고, HG 처리구에는 mTOR에 영향을 주지 않았다. 따라서, glucose 처리는 단백질을 proteasome으로부터 보호 하거나, glucose가 AMPK의 단백질 합성 저해 기능을 방해하여 세포내 단백질 합성을 중가 시키는 것으로 사료 된다. 결론적으로, 영양적 수준에 의해 AMPK 활성 및 단백질 합성과 분해가 조절된다는 것을 의미한다.
AMP-activated protein kinase (AMPK)는 체내 에너지 수준을 감지하고 당과 지방의 대사를 조절하는 인자로 밝혀졌다. 이러한 에너지 센서로서 AMPK의 역할은 심혈관계 및 비만과 당뇨 등의 대사성 질환에 밀접한 관계가 있다. 영양적 관점에서 AMPK는 지방산의 합성 및 분해를 통해 간에서 지방대사 조절에 중요한 역할을 한다. 특히 근육의 경우 glucose 흡수를 관장하며, 근육세포 내 glucose의 유입을 증가 시킨다. 하지만, AMPK의 활성이 대사기질의 흡수와 이용에 미치는 영향에 대한 정확한 기전은 아직까지 불분명하다. 또한 영양적 수준 차이에 따른 AMPK의 활성이 단백질 합성에 미치는 영향은 아직 보고된 바 없다. 따라서 본 연구의 목적은 C2C12 myotube에서 AMPK 활성물로 알려진 5-aminoimidazole-4-carbozamide-1-${\beta}$-D-ribonucleoside (AICAR)가 glucose 농도차이에 따른 AMPK 활성과 단백질함량에 미치는 영향을 알아보기 위함이다. 배양된 C2C12 근육세포에서 AICAR는 glucose의 함량에 관계없이 AMPK를 활성화 시켰다. 단백질 농도는 낮은 수준 (LG)에 비해 높은 수준의 glucose (HG)가 처리된 myotube에서 증가되었고, AICAR에 의해 그 효과는 더욱 증대 되었다. C2C12 myotube에서 HG 처리는 AMPK와 acetyl CoA carboxylase (ACC)의 인산화에 영향을 주지 않았지만, LG의 처리로 인해 AMPK와 ACC의 인산화가 증가되었다 (p<0.05). 또한, AICAR (2mM)의 처리는 glucose의 수준과는 관계없이 AMPK와 ACC의 인산화를 증가시켰다. 총 단백질 수준은 HG 처리에 의해 증가 되었고, 이는 AICAR의 처리에 의해서 더 높게 증가되었다. Proteasome 활성은 HG 처리구에서 LG에 비해 7.5% 낮게 나타났고, AICAR 처리는 proteasome 활성을 LG와 HG 처리구에서 각각 63%와 54% 감소 시켰다. Glucose의 수준은 mTOR의 인산화 수준에 영향을 주지 않았다. 하지만, AICAR는 LG 처리구에서 만 mTOR의 인산화 수준을 유의적으로 증가시켰고, HG 처리구에는 mTOR에 영향을 주지 않았다. 따라서, glucose 처리는 단백질을 proteasome으로부터 보호 하거나, glucose가 AMPK의 단백질 합성 저해 기능을 방해하여 세포내 단백질 합성을 중가 시키는 것으로 사료 된다. 결론적으로, 영양적 수준에 의해 AMPK 활성 및 단백질 합성과 분해가 조절된다는 것을 의미한다.
AMP-activated protein kinase (AMPK) maintains energy homeostasis in skeletal muscle. Nonetheless, its functional role on protein synthesis with different nutrient availability has not been elucidated. Therefore, the purpose of this study is to examine the effect of AMPK activity on protein content i...
AMP-activated protein kinase (AMPK) maintains energy homeostasis in skeletal muscle. Nonetheless, its functional role on protein synthesis with different nutrient availability has not been elucidated. Therefore, the purpose of this study is to examine the effect of AMPK activity on protein content in C2C12 myotubes incubated with low (5 mM; LG) or high (25 mM; HG) glucose media. LG stimulated (p<0.05) AMPK and acetyl CoA carboxylase (ACC) activity compare to those in HG group. Total protein content was higher in myotubes cultured with HG than in those cultured with LG and further increased by AICAR (5-amino-1-${\beta}$-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide). Myotubes cultured with HG showed 7.5% lower UbFL (Ubiquitin Firefly Luciferase)-to-SV40 (Simian virus40) ratio compared to those in LG. Glucose level did not change the phosphorylation level of mammalian target of rapamycin (mTOR). Interestingly, administration of AICAR significantly increased phosphorylation level of mTOR in myotubes cultured with LG but not in those with HG. Overall, this data indicate that AMPK activity and protein turnover are finely regulated in response to different glucose concentration.
AMP-activated protein kinase (AMPK) maintains energy homeostasis in skeletal muscle. Nonetheless, its functional role on protein synthesis with different nutrient availability has not been elucidated. Therefore, the purpose of this study is to examine the effect of AMPK activity on protein content in C2C12 myotubes incubated with low (5 mM; LG) or high (25 mM; HG) glucose media. LG stimulated (p<0.05) AMPK and acetyl CoA carboxylase (ACC) activity compare to those in HG group. Total protein content was higher in myotubes cultured with HG than in those cultured with LG and further increased by AICAR (5-amino-1-${\beta}$-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide). Myotubes cultured with HG showed 7.5% lower UbFL (Ubiquitin Firefly Luciferase)-to-SV40 (Simian virus40) ratio compared to those in LG. Glucose level did not change the phosphorylation level of mammalian target of rapamycin (mTOR). Interestingly, administration of AICAR significantly increased phosphorylation level of mTOR in myotubes cultured with LG but not in those with HG. Overall, this data indicate that AMPK activity and protein turnover are finely regulated in response to different glucose concentration.
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문제 정의
따라서 본 연구의 목적은 C2C12 myotube에서 AMPK 활성물로 알려진 5-aminoimidazole-4-carbozamide-1-β-D-ribonucleoside (AICAR)가 glucose 농도차이에 따른 AMPK 활성과 단백질함량에 미치는 영향을 알아보기 위함이다.
, 2006). 이러한 결과들은 AMPK와 mTOR는 서로 상호 작용한다는 것을 의미하고, AMPK가 대사적 스트레스 상태에서 어떻게 에너지 센서로서 항상성을 유지하는지를 보여주는 것이다. 한편 골격근 위축은 다양한 단백질 가수분해 경로에 관여하며, ATP 수준에 의해 영향을 받는 ubiquitin-proteasome 체계에 의해 조절된다(Glickman and Ciechanover, 2002).
하지만, 영양적 수준 차이에 따른 AMPK의 활성은 mTOR 신호전달을 통해서인지 ubiquitin-proteasome 체계인지 아직 구명되지 않고 있다. 이번 연구는 C2C12 myotubes 배양에서 다른 수준의 glucose 처리와 AICAR에 의한 AMPK의 활성이 mTOR 인산화 및 단백질 합성에 미치는 영향을 구명하고자 수행되었다.
제안 방법
C2C12 세포가 80% 정도 자랐을 때 26S firefly luciferase와 Renilla luciferase (pRL-SV40)를 포함한 proteasome activity reporter plasmid (UbFL-luc)를 Lipopectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 co-transfect 하였다. pRL-SV40는 transfection 효율측정을 위한 control로 이용하였다.
1% getamycin[Gibco, Grand Island, NY, USA])를 처리한 후 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. C2C12가 80% 자랐을 때 분화유도를 위해 2% horse serum과 항생제를 첨가한 DMEM으로 교체하였다(differentiation media; DM). 분화유도 5일 후(분화 완료시점) myotube에 낮은 수준(5 mM; low glucose, LG)과 높은 수준(25 mM; high glucose, HG)의 glucose를 처리하고, 2 mM AICAR를 처리하였다.
Tranfection 24시간 후 DM 배양액을 이용하여 분화를 유도하였다. 근육세포의 분화가 이루어지면 AICAR와 glucose를 처리하고 세포 내 luciferase 활성을 luciferase assay kit (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 분석하였다.
이후 membrane은 PBS에 3번 씻어낸 후 horseradish peroxidase에 접목된 secondary antibody (1:1000)에 1시간 배양시키고 다시 PBS에 씻어냈다. 단백질 발현정도 확인을 위해 chemiluminescence(ECL; GE Healthcare Bioscience, Pittsburgh, PA, USA)을 이용하여 시각화 하였고, 밴드는 NIH의 Image J를 통해 비교하였다.
마우스 C2C12 근육세포를 각각 40,000 cell/22 mm well로 분주하고 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 10% FBS (fetal bovine serum)와 항생제(1% antibiotic antimycotic solution [Sigma, St. Louis, MO, USA] and 0.1% getamycin[Gibco, Grand Island, NY, USA])를 처리한 후 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다.
C2C12가 80% 자랐을 때 분화유도를 위해 2% horse serum과 항생제를 첨가한 DMEM으로 교체하였다(differentiation media; DM). 분화유도 5일 후(분화 완료시점) myotube에 낮은 수준(5 mM; low glucose, LG)과 높은 수준(25 mM; high glucose, HG)의 glucose를 처리하고, 2 mM AICAR를 처리하였다.
이 실험에서 우리는 AMPK 활성을 위해 AMP analog인 AICAR를 이용하였고, 다른 glucose 농도(high glucose; HG vs. low glucose; LG) 처리에서 AMPK가 mTOR 신호체계 및 ubiquitin-proteasome 활성에 미치는 영향을 조사 하였다. AMPK 의 인산화는 LG 함유 myotube 배양에서 유의적으로 높게 나타났다(Fig.
, 2007). 이러한 AMPK의 단백질 분해 기능 확인을 위해, 우리는 firefly luciferase와 plasmid expressing Renilla luciferase (SV40)이 첨가된 reporter plasmid (UbFL)의 사용으로 세포 내 ubiquitin proteasome의 활성을 확인하였다. UbFL-to-SV40 비율로 측정된 ubiquitin-proteasome 활성은 HG 처리구에서 7.
데이터처리
데이터는 mean ± S.E.으로 표시 되었고, SAS 프로그램(Cary, NC, USA)의 analysis of variance (ANOVA)와 Tukey 다중비교를 이용하여 분석 하였다.
성능/효과
low glucose; LG) 처리에서 AMPK가 mTOR 신호체계 및 ubiquitin-proteasome 활성에 미치는 영향을 조사 하였다. AMPK 의 인산화는 LG 함유 myotube 배양에서 유의적으로 높게 나타났다(Fig. 1). 이 결과는 낮은 수준의 glucose에 의한 ATP 농도의 감소가 AMPK를 활성화 시킨다는 결과와 일치한다(Fulco et al.
총 단백질 수준은 HG 처리에 의해 증가 되 었고, 이는 AICAR의 처리에 의해서 더 높게 증가되었다. Proteasome 활성은 HG 처리구에서 LG에 비해 7.5% 낮게 나타났고, AICAR 처리는 proteasome 활성을 LG와 HG 처리구에서 각각 63%와 54% 감소 시켰다. Glucose의 수준은 mTOR의 인산화 수준에 영향을 주지 않았다.
이러한 AMPK의 단백질 분해 기능 확인을 위해, 우리는 firefly luciferase와 plasmid expressing Renilla luciferase (SV40)이 첨가된 reporter plasmid (UbFL)의 사용으로 세포 내 ubiquitin proteasome의 활성을 확인하였다. UbFL-to-SV40 비율로 측정된 ubiquitin-proteasome 활성은 HG 처리구에서 7.5% 감소하였다(Fig. 4). AICAR는 HG와 LG 처리구에서 모두 ubiquitin-proteasome 활성을 50% 이상 감소 시켰다(p<0.
하지만 AICAR가 높은 수준의 glucose에서 조차 AMPK 활성을 유도 한다는 결과는 여전히 설명되지 않는다. 결론적으로 이번 연구 결과는 단백질의 합성과 분해를 조절하는 AMPK와 mTOR의 활성이 에너지 수준에 따라 세밀하고 역동적으로 조절된다고 보여진다.
따라서, glucose 처리는 단백질을 proteasome으로부터 보호 하거나, glucose가 AMPK의 단백질 합성 저해 기능을 방해하여 세포내 단백질 합성을 중가 시키는 것으로 사료 된다. 결론적으로, 영양적 수준에 의해 AMPK 활성 및 단백질 합성과 분해가 조절된다는 것을 의미한다.
배양된 C2C12 근육세포에서 AICAR는 glucose의 함량에 관계 없이 AMPK를 활성화 시켰다. 단백질 농도는 낮은 수준(LG)에 비해 높은 수준의 glucose (HG)가 처리된 myotube에서 증가되었고, AICAR에 의해 그 효과는 더욱 증대 되었다. C2C12 myotube에서 HG 처리는 AMPK와 acetyl CoA carboxylase(ACC)의 인산화에 영향을 주지 않았지만, LG의 처리로 인해 AMPK와 ACC의 인산화가 증가되었다(p<0.
05). 또한, AICAR (2 mM)의 처리는 glucose의 수준과는 관계없이 AMPK와 ACC의 인산화를 증가시켰다. 총 단백질 수준은 HG 처리에 의해 증가 되 었고, 이는 AICAR의 처리에 의해서 더 높게 증가되었다.
분화된 근육 세포의 총 단백질 농도는 HG 처리에 의해 유의적(p<0.05)으로 증가되었다(Fig. 3).
05). 이 결과는 HG 처리가 ubiquitin-proteasome 활성을 감소시킴으로써 단백질 분해를 저해하고 궁극적으로 단백질 수준을 높인다는 것을 의미한다.
Glucose의 수준은 mTOR의 인산화 수준에 영향을 주지 않았다. 하지만, AICAR는 LG 처리구에서만 mTOR의 인산화 수준을 유의적으로 증가시켰고, HG 처리구에는 mTOR에 영향을 주지 않았다. 따라서, glucose 처리는 단백질을 proteasome으로부터 보호 하거나, glucose가 AMPK의 단백질 합성 저해 기능을 방해하여 세포내 단백질 합성을 중가 시키는 것으로 사료 된다.
후속연구
, 1996). 좀 더 정확한 결과 도출을 위해 실제 glucose와 지방산의 흡수 및 산화에 관한 보충 실험이 필요하다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
AMPK는 세포 내에서 어떤 역할을 하는가?
AMPK는 세포 내에서 에너지 센서의 역할을 하고 그 활성은 에너지 수준에 의해 조절된다. AMPK의 활성은 제공되는 세포 내 ATP, ADP와 AMP의 수준에 관계없이 5-aminoimidazole-4- carboxamide-1-β-D-ribonucleoside (AICAR)에 의해서 촉진되어질 수 있다(Merrill et al.
AMPK의 활성은 무엇에 의해 촉진되는가?
AMPK는 세포 내에서 에너지 센서의 역할을 하고 그 활성은 에너지 수준에 의해 조절된다. AMPK의 활성은 제공되는 세포 내 ATP, ADP와 AMP의 수준에 관계없이 5-aminoimidazole-4- carboxamide-1-β-D-ribonucleoside (AICAR)에 의해서 촉진되어질 수 있다(Merrill et al., 1997).
AMPK와 mTOR가 서로 상호 작용 한다는 것을 보여준 연구는?
, 2006). 최근 흰쥐를 이용한 연구에서 AMPK는 mTOR의 상위조절 인자의 역할을 하고 AICAR에 의한 AMPK의 활성은 mTOR를 억제하여 단백질 합성을 저감시킨다고 알려졌다(Bolster et al., 2002 Williamson et al.
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