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문제 정의
- 1에 나타내었다. Bredebach 등(2011) 등이 보고한 바에 따라 Fig. 1과 같은 생합성경로가 가능하며 본 연구를 통해 이러한 4종 화합물의 함량을 평가하고자 하였다. 그리고, 본 연구 중에서 flavone glycosoide의 high-performance liquid chromatography(HPLC)에 의한 동정과 함량분석을 시도하여 뽀리뱅이의 이용가치를 알아보고자 하였다.
- 1과 같은 생합성경로가 가능하며 본 연구를 통해 이러한 4종 화합물의 함량을 평가하고자 하였다. 그리고, 본 연구 중에서 flavone glycosoide의 high-performance liquid chromatography(HPLC)에 의한 동정과 함량분석을 시도하여 뽀리뱅이의 이용가치를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 4종의 화합물(Luteolin, Lut-7-Glc, Lut-7-GlcU, Linarin)을 MeOH에 녹이고 이를 희석방법으로 5가지 다른 농도의 희석액을 제조하여 검량선 작성을 위한 표준액으로 하였다. 또, MeOH 추출물, CHCl3 분획물, BuOH 분획물을 각각 평량한 후 MeOH에 녹인 후 희석하여 분석을 위한 검액으로 하였다.
- 분획, EtOAc분획, BuOH 분획으로 나누었다. TLC 결과 플라보노이드 배당체가 확인되는 EtOAc 분획과 BuOH 분획을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 2종의 화합물을 얻고 이들에 대한 1H- 및 13C-NMR spectrum을 측정하여 문헌치와 비교하여 동정한 후 실험에 사용하였다. Luteolin(Shin et al.
- 화합물 분리에 사용한 고정상으로 실리카겔은 Merck 사에서 구입한 silica gel 60(70-230 mesh, Germany)이었으며, 역상 컬럼 고정상으로 ODS(octadecylsilane)는 YMC사(Kyoto, Japan)의 YMC*GEL ODS-A(150 μm)이었다. TLC는 순상 TLC plate로서 Merck사의 Kieselgel 60F254 plate(20 cm ⅹ 20 cm, 0.25 thickness)과 역상 TLC plate로서 Merck사의 TLC Silica gel 60 RP-18 F254S이었고, TLC 반점은 자외선 하에서 관찰하거나 50% H2SO4의 분무 후 가열에 의해 확인하였다.
- 건조한 식물재료 560 g을 정확히 평량하여 MeOH 6.0L를 이용하여 5시간씩 환류 하에 추출하는 과정을 3회 반복하였다. 이를 여과하고 진공농축기를 이용하여 농축한 다음, 계속해서 동결건조기로 건조하여 분말상의 추출물 25.
- 또, MeOH 추출물, CHCl3 분획물, BuOH 분획물을 각각 평량한 후 MeOH에 녹인 후 희석하여 분석을 위한 검액으로 하였다.
- 이들 용매(H2O-MeOH/CH3CN는 MeOH-H2O나 MeOH-CH3CN보다 나은 분리양상과 피크모양을 보였다. 또, TFA 첨가는 페놀성 화합물의 이온화를 막으므로 피크모양을 향상하였기 때문에 두 용매에서 TFA를 첨가한 산성용액으로 하여 사용하였다.
- 뽀리뱅이 메탄올 추출물을 분획하여 CHCl3 분획, EtOAc분획, BuOH 분획으로 나누었다.
- 8 L로 분배추출하는 과정을 3회 반복하였다. 수층에 같은 방법으로 EtOAc 0.8 L를 가하여 분획하는 과정을 3회 반복하여 EtOAc 가용부를 수득하였다. 남은 수층에 BuOH 0.
- 이 과정에서 얻어진 CHCl3 가용부, EtOAc 가용부 및 BuOH 가용부를 각각 진공농축기에서 농축하였고, 계속하여 동결건조기로 건조한 후 CHCl3 분획(9.42 g), EtOAc 분획(2.54 g)과 BuOH 분획(4.69 g)을 각각 얻었다.
- 50μm syringe filter로 여과하였다. 이동상으로 A 용매로서 0.05% TFA H2O 용액과 B 용매로서 0.05% TFA MeOHCH2CN(60:40)의 혼합용액을 programmed gradient elution 방법으로 용리하였다. Gradient elution system은 (A)/(B) = 85/15(0 min) → 35/65(35 min, hold for 5 min) → 0/100(42 min; hold for 4 min to wash the column) → 85/15(49 min; hold for 6 min to equilibrate the column condition).
- 크로마토그래피 분해능 증가를 위해 컬럼, 이동상, 검출 자외선 파장을 고려하였다. Capcell Pak C18 컬럼이 더 선택적이고 뾰족한 피크를 보였기 때문에 이 컬럼을 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 크로마토그래피 분해능 증가를 위해 컬럼, 이동상, 검출 자외선 파장을 고려하였다. Capcell Pak C18 컬럼이 더 선택적이고 뾰족한 피크를 보였기 때문에 이 컬럼을 실험에 사용하였다. 두 용매 0.
- HPLC 용 컬럼으로는 Shiseido사(Tokyo, Japan)의 Capcell Pak C18 컬럼(5 μm, 250 mm ⅹ 4.6 mm i.d.)이었다.
- 검출을 위한 파장으로는 254, 280, 300, 350 nm를 테스트했을 때 254 nm의 파장에서 감도가 가장 높았으므로 이 파장을 사용하였다. 이것은 검출한계(LOD, limit of detection)와 정량한계(LOQ, limit of quantification)가 더 낮은 농도에서 결정된다는 것을 의미한다.
- , 1995)은 EtOAc 분획에서 분리되었고 linarin(Nazaruk and Gudej, 2003)은 BuOH 분획에서 분리되었다. 나머지 두 화합물은 본 실험실의 표준품으로서 물리화학적 성상 및 1H- 및 13CNMR spectrum과 Lut-7-Glc(Kim et al., 2011), Lut-7-GlcU(Gulluce et al., 2010)와 동일함을 확인된 것을 분석실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 표준 화합물 중 Lut-7-Glc와 Lut-7-GlcU는 본 실험실에 보관중인 표준품을 사용하였다. 다른 두 화합물인 luteolin과 linarin은 직접 뽀리뱅이 추출물로부터 분리하여 사용하였다. Fig.
- 국화과 식물의 flavonoid 성분으로 flavone 혹은 flavone glycoside류가 풍부한 것으로 밝혀지고 있다. 본 실험에서 분석한 4종 flavone 화합물인 luteolin, luteolin 7-O-glucuronide (Lut-7-GlcU), luteolin 7-O-glucoside(Lut-7-Glc) 및 linarin의 화학구조와 함께 그 생합성적 과정을 Fig. 1에 나타내었다. Bredebach 등(2011) 등이 보고한 바에 따라 Fig.
- 실험에 사용된 표준 화합물 중 Lut-7-Glc와 Lut-7-GlcU는 본 실험실에 보관중인 표준품을 사용하였다. 다른 두 화합물인 luteolin과 linarin은 직접 뽀리뱅이 추출물로부터 분리하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 HPLC는 Prostar 210 solvent delivery module과 Prostar 325 UV-Vis detector로 구성된 Varian사의 HPLC system(Varian Inc., Walnut Creek, CA, USA)이었다. HPLC 용 컬럼으로는 Shiseido사(Tokyo, Japan)의 Capcell Pak C18 컬럼(5 μm, 250 mm ⅹ 4.
- 실험에 사용한 식물재료는 강원도 원주시에 야생하는 뽀리뱅이를 개화된 6월경에 채집하여 실험에 사용하였다. 채집된 뽀리뱅이 지상부를 그늘에서 말리고 분쇄한 후 추출에 사용하였다.
- )이었다. 이동상 용매로서 CH3CN, MeOH 그리고 H2O 모두 J.T. Baker사에서 구입한 HPLC급 용매를 사용하였다. 화합물 분리에 사용한 고정상으로 실리카겔은 Merck 사에서 구입한 silica gel 60(70-230 mesh, Germany)이었으며, 역상 컬럼 고정상으로 ODS(octadecylsilane)는 YMC사(Kyoto, Japan)의 YMC*GEL ODS-A(150 μm)이었다.
- 실험에 사용한 식물재료는 강원도 원주시에 야생하는 뽀리뱅이를 개화된 6월경에 채집하여 실험에 사용하였다. 채집된 뽀리뱅이 지상부를 그늘에서 말리고 분쇄한 후 추출에 사용하였다. 뽀리뱅이 식물은 상지대학교 원예조경학과 임상철 교수에 의해 동정되었다.
- 화합물 분리에 사용한 고정상으로 실리카겔은 Merck 사에서 구입한 silica gel 60(70-230 mesh, Germany)이었으며, 역상 컬럼 고정상으로 ODS(octadecylsilane)는 YMC사(Kyoto, Japan)의 YMC*GEL ODS-A(150 μm)이었다.
이론/모형
- Capcell Pak C18 컬럼이 더 선택적이고 뾰족한 피크를 보였기 때문에 이 컬럼을 실험에 사용하였다. 두 용매 0.05% TFA와 0.05% TFA/MeOHCH3CN(60:40)의 용액을 각각 A solvent와 B solvent로 이용하여 programmed gradient elution 방법으로 용리하였다. 이들 용매(H2O-MeOH/CH3CN는 MeOH-H2O나 MeOH-CH3CN보다 나은 분리양상과 피크모양을 보였다.
성능/효과
- 4종 화합물의 검출강도는 BuOH 분획에서 가장 크게 나타나며 그 다음으로 MeOH 추출물 및 CHCl3 분획으로 확인된다.
- Table 2에 나타내었듯이 각 화합물의 함량을 검량선을 이용하여 결정한 결과 메탄올 추출물에는 Lut-7-GlcU의 함량이 10.07 mg/g MeOH extract으로 계산되어 가장 높았으며 그 외 3종 화합물은 1.0 mg/g MeOH extract 이하로 확인되었다. 또, 4종 화합물이 CHCl3 분획과 EtOAc 분획에서는 매우 낮은 함량으로 나타났다.
- 또, 이들 화합물은 CHCl3 분획과 EtOAc 분획 BuOH 분획 중 주로 BuOH 분획에 분포하는 것으로 확인되었다. 따라서, 뽀리뱅이는 4종 플라본 화합물 중 Lut-7-GlcU의 함량이 높으며, linarin이 낮은 함량으로 관찰되는 식물로 특성화할 수 있었다.
- 0 mg/g MeOH extract 이하로 확인되었다. 또, 4종 화합물이 CHCl3 분획과 EtOAc 분획에서는 매우 낮은 함량으로 나타났다. 이와 같이 BuOH 분획에는 대체로 매우 높은 함량이 관찰되나 다른 분획에는 매우 낮은 함량이었다.
- 또, 이들 화합물은 CHCl3 분획과 EtOAc 분획 BuOH 분획 중 주로 BuOH 분획에 분포하는 것으로 확인되었다.
- , 2011). 본 연구 중 4종 플라본 화합물 중 Lut-7-GlcU 농도가 가장 높았으므로 이 화합물 생성경로가 linarin 생성경로보다 우선할 것으로 예상된다. Luteolin에 UDP-glucuronide : luteolin 7-Oglucuronyltransferase의 작용에 의해 Lut-7-GlcU가 합성되고 UDP-glucose : luteolin 7-O-glucosyltransferase의 작용에 의해 Lut-7-Glc가 합성된다고 알려져 있다(Bowles et al.
- 저자들이 국화과 식물의 플라보노이드 성분분석 연구 과정에서 뽀리뱅이(Y. japonica) 성분을 분석한 결과 luteolin, Lut-7-Glc, Lut-7-GlcU, linarin이 확인되며 그 중 Lut-7-GlcU가 10.07 mg/g MeOH extract 수준으로서 그 함량이 가장 높았다. 또, 이들 화합물은 CHCl3 분획과 EtOAc 분획 BuOH 분획 중 주로 BuOH 분획에 분포하는 것으로 확인되었다.
- 이러한 사실은 낮은 농도의 분석물질이 정확히 검출될 수 있고 정량될 수 있다는 것을 의미한다. 특히 실험에 표준용액으로 사용된 4종 플라본계 화합물 분석에 적합하였다. 또, 컬럼 온도는 40℃, 흐름속도는 1.
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