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문제 정의
- 본 연구에서는 750~1000 nm의 근적외선 초분광 반사광 영상시스템을 이용하여 상추의 발아종자와 불발아 종자를 선별하는 기술을 개발하고자 하였다. 초분광 반사광 영상을 이용하여 상추의 발아종자와 불발아 종자를 분류할 수 있는 최적의 반사광 파장 조합을 구명하고 이를 이용하여 구축한 영상에서 퇴화종자를 검출하기 위한 영상처리 알고리즘을 제시하였다.
- 본 연구에서는 초분광 반사광 영상을 이용하여 상추 종자(Lactuca sativa L)의 발아 여부를 비파괴적으로 판단할 수 있는 알고리즘을 개발하고 이를 이용하여 퇴화종자를 기계시각으로 검출할 수 있는 기술을 개발하고자 하였다.
제안 방법
- (1) 초분광 반사광 영상에서 획득한 750~1000 nm의 반사광 스펙트럼을 이용하여 PLS- DA모델을 개발하고 개발된 모델의 성능을 평가하였다. Calibration의 분류 정확도는 81.
- 먼저 832 nm의 파장 영상을 이용하여 상추 종자 영역은 1, 나머지 영역은 0의 값을 가지도록 이진화 영상을 구성하여 종자를 제외한 나머지 부분은 제거되도록 masking image를 만들었다. PLS모델의 beta coefficient를 초분광 영상에 적용하여 파장별 선형조합으로 이루어진 PLS 영상을 구성한 후, masking image에 곱하기 연하여 배경부분을 제거하였다. 마지막으로 개발된 PLS 모델의 판별 기준 상수인 1.
- 가이드는 3개를 1 set로 하였고, 상추종자에 조명을 고르게 조사하기 위해 각 광원 set는 양쪽에서 시료를 비추도록 수직 방향으로 약 15°, 가이드와 가이드 사이는 약 30°정도 기울어지도록 설치하여 반사광의 공간에 따른 불균일성을 최소화하였다(Fig. 3).
- 5를 기준으로 이진화한 영상에서 최종 검출되는 상추종자의 픽셀을 결정하는 식으로 평균 상추종자의 픽셀수에 표준편차를 이용한 3시그마법을 적용하여 상추종자의 평균 픽셀수를 결정하고 여기에 개발된 모델의 판별정확도를 곱하여 최종적으로 검출되는 픽셀 수를 구하였다. 각 검출된 상추종자의 픽셀들 중 식(2)에 의해 계산된 픽셀 수보다 클 경우 해당 상추종자의 픽셀은 검출하도록 개발하였다. 또한 최종적으로 퇴화종자만 검출한 후 모폴로지 기법 중 영역채우기기법을 이용하여 종자의 형태대로 검출되도록 하여 최종 결과영상을 구축하였다.
- 상추의 발아종자와 불발아종자를 판별하는 위한 예측 모델은 부분최소제곱판별법(partial least square-discriminant analysis, PLS-DA)를 이용하여 개발 하였다. 건전종자 144립과 퇴화종자 144립에 대해 초분광 반사광 영상 측정을 실시한 후 발아력 실험을 통해 발아종자와 불발아종자로 구분하여 분석을 실시하였다. 종자의 스펙트럼 데이터는 초분광 영상시스템을 통해 획득한 초분광 반사광 영상에서 수동으로 영역을 선정하여 추출하였으며, 분석에 이용된 스펙트럼 데이터 수는 발아종자 스펙트럼 18,139개와 불발아종자 27,550개 이었다.
- 본 연구에서 종자 선별을 위한 초분광영상 시스템은 영상 획득을 위한 electron multiplying charge-coupled device(EMCCD) camera(Luca RDL-604M, Andor Technology, South Windor CT, USA)와 imaging spectrograph(VNIR, Headwll Photonics, Fitchburg, MA, USA), 그리고 step motor로 구동되는 시료이송부로 구성하였다. 또한 광원은 광량 조절이 가능한 100W급 halogen lamp를 이용하였으며, halogen lamp에 가이드를 설치하여 광의 조사폭 조절이 가능하도록 설계하였다. 가이드는 3개를 1 set로 하였고, 상추종자에 조명을 고르게 조사하기 위해 각 광원 set는 양쪽에서 시료를 비추도록 수직 방향으로 약 15°, 가이드와 가이드 사이는 약 30°정도 기울어지도록 설치하여 반사광의 공간에 따른 불균일성을 최소화하였다(Fig.
- 또한 식(1)에 의해 개발된 PLS 모델의 계수와 상수인 beta coefficient를[13] 초분광 영상에 적용하여각 파장 영상의 선형조합으로 PLS 영상을 구성하고 이 영상을 이용하여 퇴화종자를 검출하기 위한 영상처리 알고리즘을 개발하였다. 모든 데이터 분석은 MATLAB(version 7.
- 각 검출된 상추종자의 픽셀들 중 식(2)에 의해 계산된 픽셀 수보다 클 경우 해당 상추종자의 픽셀은 검출하도록 개발하였다. 또한 최종적으로 퇴화종자만 검출한 후 모폴로지 기법 중 영역채우기기법을 이용하여 종자의 형태대로 검출되도록 하여 최종 결과영상을 구축하였다. Table 3은 본 연구에서 실시한 전체 퇴화종자 검출 정확도를 나타내며, Fig.
- 7과 같다. 먼저 832 nm의 파장 영상을 이용하여 상추 종자 영역은 1, 나머지 영역은 0의 값을 가지도록 이진화 영상을 구성하여 종자를 제외한 나머지 부분은 제거되도록 masking image를 만들었다. PLS모델의 beta coefficient를 초분광 영상에 적용하여 파장별 선형조합으로 이루어진 PLS 영상을 구성한 후, masking image에 곱하기 연하여 배경부분을 제거하였다.
- 발아력 실험 후 식별된 상추의 발아 종자와 불발아 종자의 스펙트럼을 이용하여 PLS-DA를 적용한 발아력 판별예측 모델을 개발하였다. 발아종자와 퇴화종자 구분을 위해 제안된 최적 모델의 beta coefficient를 계산하여 두 그룹의 판별에 많은 영향을 미친 영역을 확인하였다.
- 본 연구에서는 상추의 건전종자와 퇴화종자를 판별하는 기준은 PLS-DA 모델 개발시 발아종자의 스펙트럼 그룹을 가상 변수 ‘1’로, 불발아 종자의 스펙트럼 그룹은 ‘2’로 설정하여 모델을 개발하였으며 그 중간값인 1.5를 발아여부 문턱값으로 설정하여 판별하였다.
- 초분광 영상에 대한 자세한 원리는 여러 연구문헌에 자세히 나타나 있다[10,11]. 본 연구에서는 초분광영상촬영 시 노출시간(exposure time)은 9.5 msec로 하고 step motor의 이동은 0.1 mm 간격으로 2300 step으로 하며 총 23 cm를 이동하여 상추종자의 초분광 영상을 획득하였다. 측정된 스펙트럼 영상의 범위는 400~1000 nm 이였으며, 이중 가시광선의 영역을 제외한 750~1000 nm 범위의 근적외선 스펙트럼 데이터를 분석과 결과 영상 구축에 이용하였다.
- 외부적으로는 건전종자와 퇴화종자의 색과 모양 모두 동일하여 육안으로는 구별할 수 없었다. 시료는 국제종자검정협회(ISTA) 규정에 따라 4℃로 보관하였으며 실험 전에 실내공기에 노출시켜 실내 온도와 동일하게 맞춘 후 초분광 영상 촬영 및 발아력 검증 실험에 이용하였다.
- 종자의 스펙트럼 데이터는 초분광 영상시스템을 통해 획득한 초분광 반사광 영상에서 수동으로 영역을 선정하여 추출하였으며, 분석에 이용된 스펙트럼 데이터 수는 발아종자 스펙트럼 18,139개와 불발아종자 27,550개 이었다. 이 중 75%에 해당하는 발아종자의 13,604개의 스펙트럼과 불발아종자의 20,662개의 스펙트럼을 calibration 그룹으로 설정하고 이를 모델 개발에 사용하였다. 또한 모델 개발에 사용하지 않은 25%의 발아종자 스펙트럼 4,535개와 불발아 종자 스펙트럼 6,888개를 test 그룹으로 설정하여 개발된 모델을 검증하였다.
- 5를 임계값하여 이진화 영상을 구성하였다. 이때 임계값을 적용하면 사라져야할 발아종자 부분에 픽셀잔재가 있는 경우가 발생하는데, 이러한 오검출 픽셀은 상추종자의 평균 크기 즉 상추종자 평균 픽셀 수와 판별 정확도를 고려하여 퇴화 종자만 검출하도록 하는 알고리즘을 개발하였다. 검출되는 픽셀은 아래의 식(2)에 의해 계산하였다.
- 본 연구에서는 750~1000 nm의 근적외선 초분광 반사광 영상시스템을 이용하여 상추의 발아종자와 불발아 종자를 선별하는 기술을 개발하고자 하였다. 초분광 반사광 영상을 이용하여 상추의 발아종자와 불발아 종자를 분류할 수 있는 최적의 반사광 파장 조합을 구명하고 이를 이용하여 구축한 영상에서 퇴화종자를 검출하기 위한 영상처리 알고리즘을 제시하였다. 본 논문의 전체적인 결론을 요약하면 다음과 같다.
- 초분광 영상 시스템은 Visual Basic software를 이용하여 제어하였으며, 렌즈의 노출시간을 설정하면 카메라에서 자동으로 step motor의 이송속도 및 촬영시간을 계산하여 구동 할 수 있도록 하였다. 렌즈에 투사된 영상은 25 ㎛두께의 slit을 통과하면서 line-scan된 1차원의 정보가 spectrograph에 의하여 각 파장별 분광이 생성하여 2차원의 정보로 변환된다.
- 8은 전체 퇴화종자 검출 영상 및 발아테스트 결과를 보여준다. 최종 PLS영상에 나타난 상추종자와 발아 실험이 실시된 후의 상추종자 사진의 위치를 일치시켜 비교한 것이다. PLS 영상을 이용한 검출 정확도는 전체 288 립 중 26립이 오분류 되어 91% 의 정확도를 보였다.
대상 데이터
- 이 중 75%에 해당하는 발아종자의 13,604개의 스펙트럼과 불발아종자의 20,662개의 스펙트럼을 calibration 그룹으로 설정하고 이를 모델 개발에 사용하였다. 또한 모델 개발에 사용하지 않은 25%의 발아종자 스펙트럼 4,535개와 불발아 종자 스펙트럼 6,888개를 test 그룹으로 설정하여 개발된 모델을 검증하였다. PLS 모델은 종속변수인 실제 측정된 농도의 정보를 이용하여 독립변수인 스펙트럼의 정보와의 선형 회귀 모델을 개발하는 방법이다.
- 이 기간 내에 퇴화처리 하지 않은 건전종자는 95%의 발아율을 보였으며, 72시간 퇴화 처리한 종자는 모두 발아되지 않았다. 발아력 실험을 통해 검증된 총 288립 중 137립의 발아종자와 151립의 불발아 종자 그룹 정보는 발아력 실험 전에 측정한 초분광 반사광 영상 데이터의 분석에 사용되었다.
- 본 연구에 사용한 상추종자는 H사에서 제공된 ‘열강적치마’ 품종이다.
- 각 화소의 분광정보 이용하여 물질이 가지고 있는 고유의 광학적 성질을 통해 물리적 및 생화학적 특징을 분석하고 이를 시각화 할 수 있다. 본 연구에서 종자 선별을 위한 초분광영상 시스템은 영상 획득을 위한 electron multiplying charge-coupled device(EMCCD) camera(Luca RDL-604M, Andor Technology, South Windor CT, USA)와 imaging spectrograph(VNIR, Headwll Photonics, Fitchburg, MA, USA), 그리고 step motor로 구동되는 시료이송부로 구성하였다. 또한 광원은 광량 조절이 가능한 100W급 halogen lamp를 이용하였으며, halogen lamp에 가이드를 설치하여 광의 조사폭 조절이 가능하도록 설계하였다.
- 건전종자 144립과 퇴화종자 144립에 대해 초분광 반사광 영상 측정을 실시한 후 발아력 실험을 통해 발아종자와 불발아종자로 구분하여 분석을 실시하였다. 종자의 스펙트럼 데이터는 초분광 영상시스템을 통해 획득한 초분광 반사광 영상에서 수동으로 영역을 선정하여 추출하였으며, 분석에 이용된 스펙트럼 데이터 수는 발아종자 스펙트럼 18,139개와 불발아종자 27,550개 이었다. 이 중 75%에 해당하는 발아종자의 13,604개의 스펙트럼과 불발아종자의 20,662개의 스펙트럼을 calibration 그룹으로 설정하고 이를 모델 개발에 사용하였다.
- 1 mm 간격으로 2300 step으로 하며 총 23 cm를 이동하여 상추종자의 초분광 영상을 획득하였다. 측정된 스펙트럼 영상의 범위는 400~1000 nm 이였으며, 이중 가시광선의 영역을 제외한 750~1000 nm 범위의 근적외선 스펙트럼 데이터를 분석과 결과 영상 구축에 이용하였다.
데이터처리
- 발아력 실험 후 식별된 상추의 발아 종자와 불발아 종자의 스펙트럼을 이용하여 PLS-DA를 적용한 발아력 판별예측 모델을 개발하였다. 발아종자와 퇴화종자 구분을 위해 제안된 최적 모델의 beta coefficient를 계산하여 두 그룹의 판별에 많은 영향을 미친 영역을 확인하였다. Fig 6은 개발된 모델의 beta coefficient를 나타낸 것이다.
- 식(2)은 판별기준인 문턱값 1.5를 기준으로 이진화한 영상에서 최종 검출되는 상추종자의 픽셀을 결정하는 식으로 평균 상추종자의 픽셀수에 표준편차를 이용한 3시그마법을 적용하여 상추종자의 평균 픽셀수를 결정하고 여기에 개발된 모델의 판별정확도를 곱하여 최종적으로 검출되는 픽셀 수를 구하였다. 각 검출된 상추종자의 픽셀들 중 식(2)에 의해 계산된 픽셀 수보다 클 경우 해당 상추종자의 픽셀은 검출하도록 개발하였다.
이론/모형
- 이는 퇴화하는 과정에서 발생하는 색소나 성분물질의 변화에 기인한 것으로 판단되지만 이들의 편차가 심하여 단일파장이나 일부 파장으로는 건전종자와 퇴화종자를 분류하기란 어려움이 있다. 건전종자와 퇴화종자 두 그룹별로 차이를 나타내는 정확한 파장영역의 분석은 PLS-DA 방법을 통해 분석하였다.
- 상추 종자의 초분광 영상을 획득한 후 개별종자에 대한 발아종자와 불발아 종자를 식별하기 위해 국제종자검정협회(ISTA) 규정에 따라 발아 실험을 실시하였다. 발아법은 TP법으로 16립씩 20℃ 조건으로 10일간 발아력 실험을 실시하였는데, 일반적으로 상추종자는 3일 이내에 발아가 끝나는 것으로 확인되었다.
- 상추의 발아종자와 불발아종자를 판별하는 위한 예측 모델은 부분최소제곱판별법(partial least square-discriminant analysis, PLS-DA)를 이용하여 개발 하였다. 건전종자 144립과 퇴화종자 144립에 대해 초분광 반사광 영상 측정을 실시한 후 발아력 실험을 통해 발아종자와 불발아종자로 구분하여 분석을 실시하였다.
성능/효과
- (2) 개발된 모델의 beta coefficients를 통해 상추의 발아종자와 불발아 종자를 분류하는데 중요한 영향을 미치는 파장은 870~880 nm, 910~915 nm, 935~950 nm, 970 nm, 990 nm로 나타났으며, 이는 상추종자의 발아 억제 물질인 abscisic acid(ABA)나 cytokinin, ethylene 등과 수분과 관련성이 높은 것으로 판단되었다.
- (3) 개발된 모델의 beta coefficient PLS 를 적용한 영상을 이용하여 발아종자와 불발아종자를 선별한 결과 판별 정확도 91%로 다량의 종자를 동시에 비파괴적으로 검출 가능함을 확인할 수 있었다.
- 이 값의 절대값이 클수록 해당 영역의 파장이 PLS 모델 개발에 영향을 많이 미친 파장으로 해석할 수 있다. 870~880 nm, 910~915 nm, 935~950 nm 970 nm, 990 nm 파장대가 모델 개발에 주된 영향을 미친 것으로 나타났다. 870~880 nm, 910~915 nm, 935~950 nm 영역대는 C-H structure third overtone의 진동모드에 의한 영향으로 사료되며 이는 CH3 및 protein C-H 등 모두 결합에 의한 화학적 작용기와 관련이 있다.
- Calibration 분류 정확도는 발아종자 72.6%, 불발아 종자 87.5%로 나타났으며 전체적으로 81.6%의 정확도를 보였다. 또한 Table 2는 개발된 모델의 성능을 평가하기 위해 모델 개발에 사용하지 않은 픽셀 스펙트럼의 test 그룹을 이용하여 분류정확도를 계산한 결과이다.
- 최종 PLS영상에 나타난 상추종자와 발아 실험이 실시된 후의 상추종자 사진의 위치를 일치시켜 비교한 것이다. PLS 영상을 이용한 검출 정확도는 전체 288 립 중 26립이 오분류 되어 91% 의 정확도를 보였다. 이 결과를 통해 초분광 반사광 영상 기술이 다량의 종자를 동시에 비파괴적으로 검사하는데 이용될 수 있음을 확인 할 수 있었다.
- 개별 종자의 발아 여부를 식별하기위해 실시한 발아력 실험 결과 일반적인 건전종자는 3일 이내에 발아가 완료되는 것을 확인할 수 있었다. 이 기간 내에 퇴화처리 하지 않은 건전종자는 95%의 발아율을 보였으며, 72시간 퇴화 처리한 종자는 모두 발아되지 않았다.
- 또한 Table 2는 개발된 모델의 성능을 평가하기 위해 모델 개발에 사용하지 않은 픽셀 스펙트럼의 test 그룹을 이용하여 분류정확도를 계산한 결과이다. 결과에 따르면 발아종자는 71.4%이고 불발아 종자는 87.6%로 전체적으로 81.2%의 정확도를 보였다.
- 5보다 높으면 불발아 종자로 판단하였다[12]. 따라서 발아종자의 예측결과값이 1에 가깝고 불발아 종자의 스펙트럼 예측결과 값이 2에 근접할수록 모델의 판별 성능이 우수하다고 볼 수 있다.
- 발아법은 TP법으로 16립씩 20℃ 조건으로 10일간 발아력 실험을 실시하였는데, 일반적으로 상추종자는 3일 이내에 발아가 끝나는 것으로 확인되었다.
- PLS 영상을 이용한 검출 정확도는 전체 288 립 중 26립이 오분류 되어 91% 의 정확도를 보였다. 이 결과를 통해 초분광 반사광 영상 기술이 다량의 종자를 동시에 비파괴적으로 검사하는데 이용될 수 있음을 확인 할 수 있었다.
- 개별 종자의 발아 여부를 식별하기위해 실시한 발아력 실험 결과 일반적인 건전종자는 3일 이내에 발아가 완료되는 것을 확인할 수 있었다. 이 기간 내에 퇴화처리 하지 않은 건전종자는 95%의 발아율을 보였으며, 72시간 퇴화 처리한 종자는 모두 발아되지 않았다. 발아력 실험을 통해 검증된 총 288립 중 137립의 발아종자와 151립의 불발아 종자 그룹 정보는 발아력 실험 전에 측정한 초분광 반사광 영상 데이터의 분석에 사용되었다.
- 측정된 초분광 영상에서 상추종자 영역의 스펙트럼을 추출하였는데 상추의 발아종자와 불발아 종자의 평균스펙트럼은 Fig. 5와 같이 비슷한 패턴을 보였으나 전체적으로 발아종자의 반사광 정도가 높게 나타났다. 이는 퇴화하는 과정에서 발생하는 색소나 성분물질의 변화에 기인한 것으로 판단되지만 이들의 편차가 심하여 단일파장이나 일부 파장으로는 건전종자와 퇴화종자를 분류하기란 어려움이 있다.
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