Comparison of Molecular Characteristics of Extended Spectrum ${\\beta}$-lactamase Producing Escherichia coli Strains Isolated from Patients with Urinary Tract Infections between 2 Time Periods of 1989 and 2010 at Gangwon Province in Korea원문보기
Etiological agents of extended spectrum ${\beta}$-lactamase (ESBL) producing uropathogenic Escherichia coli (UPEC) have become a major problem in urinary tract infections. The purpose of this study was to compare the molecular characteristics of ESBL producing UPEC strains isolated from 1...
Etiological agents of extended spectrum ${\beta}$-lactamase (ESBL) producing uropathogenic Escherichia coli (UPEC) have become a major problem in urinary tract infections. The purpose of this study was to compare the molecular characteristics of ESBL producing UPEC strains isolated from 1989 and 2010. A total of 301 strains of UPEC clinical isolates was collected from Korean healthcare facility in 1989 (126 strains) and in 2010 (175 strains). UPEC clinical isolates were analyzed by multiplex polymerase chain reaction method (ESBL related bla genes and phylogenetic groups) and amplified fragment length polymorphism (AFLP). Among 301 isolates, ESBL producing UPEC were 8 strains (6.3%) in 1989 isolates and 35 strains (20%) in 2010 isolates. The rate of bla genes in ESBL producing UPEC from 1989 isolates and 2010 isolates were $bla_{TEM}$ (75% and 85.7%), $bla_{CTX-M}$ (0% and 91.4%), $bla_{OXA}$ (25% and 20%), $bla_{PER}$ (0% and 2.9%). The distribution of phylogenetic groups in 1989 isolates and 2010 isolates were A (37.5% and 11.4%), B2 (12.5% and 51.4%), and D (50% and 37.1%). The most prevalent ESBL related bla gene and phylogenetic group were $bla_{CTX-M}$ (91.4%) and B2 (51.4%) in 2010 isolates, while $bla_{CTX-M}$ was not detected in 1989 isolates. Among 43 ESBL producing UPEC were grouped into 12 clusters up to 76% of genetic similarities by AFLP analysis. During past twenty one years, the rate of the ESBL producing UPEC strains in 2010 isolates was increased than that of in 1989 isolates. Also, the most prevalent ESBL related bla gene has been changed from $bla_{TEM}$ to $bla_{CTX-M}$.
Etiological agents of extended spectrum ${\beta}$-lactamase (ESBL) producing uropathogenic Escherichia coli (UPEC) have become a major problem in urinary tract infections. The purpose of this study was to compare the molecular characteristics of ESBL producing UPEC strains isolated from 1989 and 2010. A total of 301 strains of UPEC clinical isolates was collected from Korean healthcare facility in 1989 (126 strains) and in 2010 (175 strains). UPEC clinical isolates were analyzed by multiplex polymerase chain reaction method (ESBL related bla genes and phylogenetic groups) and amplified fragment length polymorphism (AFLP). Among 301 isolates, ESBL producing UPEC were 8 strains (6.3%) in 1989 isolates and 35 strains (20%) in 2010 isolates. The rate of bla genes in ESBL producing UPEC from 1989 isolates and 2010 isolates were $bla_{TEM}$ (75% and 85.7%), $bla_{CTX-M}$ (0% and 91.4%), $bla_{OXA}$ (25% and 20%), $bla_{PER}$ (0% and 2.9%). The distribution of phylogenetic groups in 1989 isolates and 2010 isolates were A (37.5% and 11.4%), B2 (12.5% and 51.4%), and D (50% and 37.1%). The most prevalent ESBL related bla gene and phylogenetic group were $bla_{CTX-M}$ (91.4%) and B2 (51.4%) in 2010 isolates, while $bla_{CTX-M}$ was not detected in 1989 isolates. Among 43 ESBL producing UPEC were grouped into 12 clusters up to 76% of genetic similarities by AFLP analysis. During past twenty one years, the rate of the ESBL producing UPEC strains in 2010 isolates was increased than that of in 1989 isolates. Also, the most prevalent ESBL related bla gene has been changed from $bla_{TEM}$ to $bla_{CTX-M}$.
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문제 정의
본 연구에서는 강원도 소재의 원주 세브란스 기독병원에서 1989년에 분리한 126주의 요로병원성 대장균(uropathogenic Escherichia coli)과 2010년에 분리한 175주의 요로병원성 대장균의 phylogenetic group과 ESBL 생성 빈도 및 관련 내성 유전자 분포의 변화, 균주간의 유사도를 비교 검토해보고자 하였다. 1989년 3월부터 12월까지 126명의 요로감염 환자의 소변검체에서 분리한 대장균 126주와 2010년 7월부터 2010년 12월까지 요로감염 환자 175명의 소변검체에서 분리한 대장균 175주를 대상으로 항균제 감수성 검사를 실시하여 ESBL 생성 요로병원성 대장균을 선별, 본 실험에 사용하였다.
제안 방법
1989년도와 2010년도에 분리한 ESBL 생성 요로병원성대장균간에 유전자수준에서의 근연관계를 확인하기 위해 amplified fragment length polymorphism(AFLP)을 Janssen 등의 방법을 약간 변형하여 수행하였다(Janssen et al., 1996; Gibson et al., 1998; Lim et al., 2010). AFLP를 수행한 결과 100 bp와 3 kb 사이에서 30개 이내의 DNA band를 확인할 수 있었다.
대상 데이터
본 연구에서는 강원도 소재의 원주 세브란스 기독병원에서 1989년에 분리한 126주의 요로병원성 대장균(uropathogenic Escherichia coli)과 2010년에 분리한 175주의 요로병원성 대장균의 phylogenetic group과 ESBL 생성 빈도 및 관련 내성 유전자 분포의 변화, 균주간의 유사도를 비교 검토해보고자 하였다. 1989년 3월부터 12월까지 126명의 요로감염 환자의 소변검체에서 분리한 대장균 126주와 2010년 7월부터 2010년 12월까지 요로감염 환자 175명의 소변검체에서 분리한 대장균 175주를 대상으로 항균제 감수성 검사를 실시하여 ESBL 생성 요로병원성 대장균을 선별, 본 실험에 사용하였다. 선별된 ESBL 생성 요로병원성 대장균의 항균제 감수성 검사는 Clinical Laboratory Standard Institute(CLSI, 2012)의 기준에 따라 시행하였다(Cockerill et al.
데이터처리
AFLP를 수행한 결과 100 bp와 3 kb 사이에서 30개 이내의 DNA band를 확인할 수 있었다. 확인된 DNA band들은 Quantity One version 5.4.0 program(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 유전자형을 분석하였으며 UPGMA 법을 이용하여 dendrogram을 작성하였다. ESBL을 생성하는 요로병원성 대장균의 유전자형 유사성을 비교해 본 결과 몇몇의 균주를 제외하고 각기 다른 유전자 지문형을 나타내었고 유사도 65% 수준에서 크게 3개의 group를 형성하였고 세부적으로 유사도 76% 이상의 수준에서 유사성을 가지는 12개의 group을 형성하였다(Fig.
이론/모형
1989년 3월부터 12월까지 126명의 요로감염 환자의 소변검체에서 분리한 대장균 126주와 2010년 7월부터 2010년 12월까지 요로감염 환자 175명의 소변검체에서 분리한 대장균 175주를 대상으로 항균제 감수성 검사를 실시하여 ESBL 생성 요로병원성 대장균을 선별, 본 실험에 사용하였다. 선별된 ESBL 생성 요로병원성 대장균의 항균제 감수성 검사는 Clinical Laboratory Standard Institute(CLSI, 2012)의 기준에 따라 시행하였다(Cockerill et al., 2012). 항균제 감수성 패턴을 확인하기 위해 disk diffusion method를 실시하였고, ESBL 생성 여부를 확인하기 위해 double disk synergy(DDS) test를 실시하였다(Lee et al.
요로병원성 대장균의 phylogenetic group를 확인하기 위해 다중중합효소연쇄반응을 이용하였다(Clermont et al., 2000). 1989년 분리주의 경우 D군이 50%로 가장 많았던 반면, 2010년 분리주의 경우 B2군이 51.
, 2012). 항균제 감수성 패턴을 확인하기 위해 disk diffusion method를 실시하였고, ESBL 생성 여부를 확인하기 위해 double disk synergy(DDS) test를 실시하였다(Lee et al., 2004). Disk diffusion method를 이용한 항균제 감수성 검사 결과는 Table 1과 같다.
성능/효과
, 2010)을 실시한 결과는 Table 2와 같다. 1989년에 분리한 ESBL 생성 요로병원성 대장균의 ESBL 유전자형은 blaTEM이 75%, blaOXA가 25%였고 blaSHV 및 blaCTX-M, blaPER는 검출되지 않은 반면, 2010년에 분리한 ESBL 생성 요로병원성 대장균의 ESBL 유전자형은 blaCTX-M이 전체의 91.4%였고, 1989년도 분리주와 다르게 35주 중 3주(8.6%)만이 blaTEM을 단독으로 보유하고 있었다. 또한 blaTEM과 함께 blaCTX-M을 동시에 지니고 있는 경우가 31주(88.
, 2010). AFLP를 수행한 결과 100 bp와 3 kb 사이에서 30개 이내의 DNA band를 확인할 수 있었다. 확인된 DNA band들은 Quantity One version 5.
1989년도와 2010년도에 분리된 ESBL 생성 요로병원성 대장균은 ampicillin, cefalotin 및 cefamandole에 모두 내성이었다. Cefotaxime에 대한 항균제 감수성 결과는 1989년도 분리주에서 모두 내성 결과를 보였고, 2010년도 분리주의 경우 전체 35주 중 중간 결과를 보인 1주를 제외한 나머지 34주(97.1%)에서 내성 결과를 보였으며 특히 세균성 요로감염에 경험적 1차 치료제로 많이 사용되고 있는 fluoroquinolone계 항생제인(Lee et al., 2003) ciprofloxacin에 대한 항균제 감수성 결과는 1989년 분리주의 경우 내성 균주가 없었던 반면 2010년 분리주의 경우 28주(80%)가 내성으로 확인이 되었다. DDS 검사 결과 1989년도에 분리된 요로병원성 대장균 중 ESBL 양성인 균주는 126주 중 8주(6.
, 2003) ciprofloxacin에 대한 항균제 감수성 결과는 1989년 분리주의 경우 내성 균주가 없었던 반면 2010년 분리주의 경우 28주(80%)가 내성으로 확인이 되었다. DDS 검사 결과 1989년도에 분리된 요로병원성 대장균 중 ESBL 양성인 균주는 126주 중 8주(6.3%)였다. 2009년 국내 요로병원성 대장균의 항생제 내성에 관한 연구에서는 요로병원성 대장균이 ESBL 양성률이 10.
0 program(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 유전자형을 분석하였으며 UPGMA 법을 이용하여 dendrogram을 작성하였다. ESBL을 생성하는 요로병원성 대장균의 유전자형 유사성을 비교해 본 결과 몇몇의 균주를 제외하고 각기 다른 유전자 지문형을 나타내었고 유사도 65% 수준에서 크게 3개의 group를 형성하였고 세부적으로 유사도 76% 이상의 수준에서 유사성을 가지는 12개의 group을 형성하였다(Fig. 1). Group 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12의 AFLP pattern을 살펴보면 분리된 시기에 따라 80%에서 96%수준까지 유사도가 높은 group을 형성하였고, group 4, 5, 6, 7, 12의 경우 phylogenetic group에 따라 같은 group으로 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
1). Group 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12의 AFLP pattern을 살펴보면 분리된 시기에 따라 80%에서 96%수준까지 유사도가 높은 group을 형성하였고, group 4, 5, 6, 7, 12의 경우 phylogenetic group에 따라 같은 group으로 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, group 4, 5, 6의 경우 phylogenetic group과 ESBL genotype이 완벽히 일치했고, group 1을 제외한 다른 group의 경우 phylogenetic group과 ESBL genotype이 완벽히 일치하지는 않지만, 유사도 65% 이상에서 phylogenetic group 및 ESBL genotype이 비슷하였다.
, 1999). 본 연구에서는 강원도 원주지역에서, 지속적으로 분리된 균주를 대상으로 하지 않았지만, 과거(1989년)에는 TEM 형의 유전자를 가지는 요로병원성 대장균이 주를 이루었으나 현재(2010년)에는 TEM 형 유전자와 CTX-M 형 유전자를 함께 가지는 요로병원성 대장균이 주를 이루어, 만연하고 있는 ESBL 생성 요로병원성 대장균의 내성 유전자의 분포가 단독 TEM 형에서 TEM과 CTX-M을 함께 가지는 유형으로 바뀐 것을 확인 할 수 있었다. 한편 항생제 감수성 검사 결과 ceftazidime의 내성률이 2010년에 28.
Group 1의 경우 유일하게 CTX-M 형의 ESBL 관련 유전자만을 가지고 있었으며 단독 group이 형성되었다. 주목할 점은 전체 세균 중 41.9%를 차지하는 11과 12 group은 phylogenetic group B2군에 속하면서 73%의 높은 유사도를 형성하였는데, 같은 지역에서 분리시기만이 다른 균주를 대상으로 조사한 점으로 미루어 보았을 때 ESBL 생성 요로병원성 대장균들 중 B2군의 확산은 클론 확산(clonal spread)에 의한 것으로 보인다.
Group 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12의 AFLP pattern을 살펴보면 분리된 시기에 따라 80%에서 96%수준까지 유사도가 높은 group을 형성하였고, group 4, 5, 6, 7, 12의 경우 phylogenetic group에 따라 같은 group으로 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, group 4, 5, 6의 경우 phylogenetic group과 ESBL genotype이 완벽히 일치했고, group 1을 제외한 다른 group의 경우 phylogenetic group과 ESBL genotype이 완벽히 일치하지는 않지만, 유사도 65% 이상에서 phylogenetic group 및 ESBL genotype이 비슷하였다. Group 1의 경우 유일하게 CTX-M 형의 ESBL 관련 유전자만을 가지고 있었으며 단독 group이 형성되었다.
본 연구에서는 강원도 원주지역에서, 지속적으로 분리된 균주를 대상으로 하지 않았지만, 과거(1989년)에는 TEM 형의 유전자를 가지는 요로병원성 대장균이 주를 이루었으나 현재(2010년)에는 TEM 형 유전자와 CTX-M 형 유전자를 함께 가지는 요로병원성 대장균이 주를 이루어, 만연하고 있는 ESBL 생성 요로병원성 대장균의 내성 유전자의 분포가 단독 TEM 형에서 TEM과 CTX-M을 함께 가지는 유형으로 바뀐 것을 확인 할 수 있었다. 한편 항생제 감수성 검사 결과 ceftazidime의 내성률이 2010년에 28.6%로 줄고, cefotaxime의 내성률이 97.1%로 증가하였는데, 이는 blaCTX-M을 보유한 균주의 증가에 의한 것으로 사료된다.
후속연구
하지만 ESBL 생성 요로병원성 대장균은 시간이 지남에 따라 지속적으로 증가하였다. 따라서 1차적인 경험적 치료제의 선택이 3세대 cephalosporin계 항생제로 국한되지 않고 다른 항생제로의 대체도 고려할 필요성이 있으리라 생각이 되며, 앞으로도 ESBL 생성 요로병원성 대장균에 대한 지속적인 모니터링이 실시된다면 요로병원성 대장균에 의한 요로감염의 치료 방향을 결정 하는데 있어 도움이 되리라 사료된다.
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