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제안 방법
- Triolein의 농도를 5, 15, 20, 25, 37.5, 50 µg/mL로 nile red로 염색하여 형광값을 측정하였다.
- 전자빔은 주로 오염물질을 산화시키거나 파괴하고, 미생물을 멸균시키는 용도로 많이 이용되어 왔으나[12], 미세조류의 균주 개량에 전자빔을 적용함으로써 전자빔의 새로운 적용 범위 확대에 기여할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 전자빔을 A. platensis에 조사하여 돌연변이 균주를 유도하였고, 확보된 변이주에 대한 특성과 지방산 성분을 분석하였다.
- 균체량은 520 nm에서 UV/Vis 분광기(Optizen 2120 UV, Mecasys Ltd, Korea)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 건조 균체량(Dry cell weight, DCW)은 항량된 종이필터(Whatman filter)를 이용하여 여과된 균체를 건조기에서 105 ℃로 3 h 동안 건조시켜 무게를 측정하였다[15].
- 균체량은 520 nm에서 UV/Vis 분광기(Optizen 2120 UV, Mecasys Ltd, Korea)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 건조 균체량(Dry cell weight, DCW)은 항량된 종이필터(Whatman filter)를 이용하여 여과된 균체를 건조기에서 105 ℃로 3 h 동안 건조시켜 무게를 측정하였다[15].
- 광합성을 통해 증가된 색소 함량 분석을 위해 12일간 배양한 미세 조류 균주의 클로로필 함량을 분석하였다. 클로로필 측정은 세포 1 mL을 13000 rpm에서 3 min간 원심분리 한 뒤 상등액을 제거하고 methanol 1 mL을 첨가하였다.
- 5로 조정한 후 세포 10 µL와 증류수 138 µL, nile red 2 µL 그리고 DMSO 50 µL를 혼합하고 40 ℃ 배양기에서 10 min간 반응하였다. 형광광도계(Infinite F 200 pro, Tecan, Austria)를 이용하여 excitation 495 nm, emission 620 nm에서 형광값(fluorescence intensity)을 측정하였다. nile red로 염색된 세포의 형광값과 미세조류 자체의 형광값을 빼서 나타내었다[10].
- 5, 50 µg/mL로 nile red로 염색하여 형광값을 측정하였다. 각 농도에 따른 형광 강도를 이용하여 표준 검량선을 작성 한 후 세포 내 중성지질 함량을 결정하였다.
- 1 mL의 NaCl을 이용하여 세포 내 염을 제거하고 1 mL의 멸균수를 이용하여 세척하였다. 추출하여 얻은 상등액에 무수 황산 나트륨을 이용하여 건조시킨 후 gas chromatography (GC)를 이용하여 분석하였다. GC 조건으로는 이동상을 helium으로 이용하고 sample 주입온도는 250 ℃, 초기온도는 110 ℃로 1 min간 유지하였다.
- 미세조류 내의 지질 함량을 nile red를 이용한 형광의 강도를 이용하여 측정하였다. EB29의 지질 함량은 야생균주에 비해 약 4배 증가하였다(Figure 2).
- 하지만, 스크리닝 목적으로 형광 강도를 이용한 방법은 그 지질함량을 정확히 알 수 없으므로 중성지질을 정량하기 위해 표준 곡선을 이용하여 시료의 형광 강도와 지질의 함량을 연관시켰다[18]. 지질 표준용액으로 triolein을 이용하여 농도별로 nile red 염색 후 형광 강도를 측정하였다. Triolein의 표준 검량선 작성 결과, triolein 과 형광 강도 사이에 좋은 직선성(R2 = 0.
- EM29 균주의 지방산 함량을 GC를 이용해 분석하였으며, 야생균주와 지방산 함량을 비교하였다(Table 1, Figure 4). A.
- 지질 함량은 세포를 nile red로 염색하여 형광 강도를 측정하였고, 야생균주에 비해 7배 이상 증가하였다. 세포 내 중성지질 정량을 위해 표준 물질로 이용되는 triolein으로 검량선을 작성하였으며 야생균주와 변이주의 지질 함량을 정량하였다. 정량한 결과 야생균주는 41.
- EB29를 12일 동안 배양하면서 3일 간격으로 세포 생장을 측정하였고, 생장률은 야생균주와 거의 비슷하였다(Figure 1
대상 데이터
- 본 연구는 Arthrospira platensis NIES 39 (KCTC AG30033)를 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 분양받아 사용하였다. 알칼리성 무기배지인 SOT배지로 균주를 배양하였다.
- 본 연구는 Arthrospira platensis NIES 39 (KCTC AG30033)를 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 분양받아 사용하였다. 알칼리성 무기배지인 SOT배지로 균주를 배양하였다. SOT 배지는 SOT-1과 -2를 각각 121 ℃에서 15 min간 멸균 및 냉각시켜 혼합 후 10 N NaOH를 이용해 pH 9로 조절하였다[13].
- 0으로 조정하였다. 300 mL의 세포 희석액을 전자빔 가속 장치의 전자빔 조사 챔버에 넣어 조사하였다(한국 원자력연구원, 대전). 0.
- [17]의 방법을 변형하여 측정하였다. 중성지질의 검량선으로는 triolein (Sigma)를 이용하였다. Triolein의 농도를 5, 15, 20, 25, 37.
- 본 연구에서는 미세조류인 A. platensis에 240 kGy의 전자빔을 조사하여 돌연변이를 유도하였고, 지질 함량이 높은 변이주 EB29를 선별하였다. EB29의 생장속도, 세포 건조 중량, 클로로필 함량은 야생균주와 큰 차이를 보이지 않았다.
이론/모형
- 지방산 분석을 위하여 이 등[18]의 방법을 이용하여 분석하였다. 야생균주와 변이주의 동결건조 시료 10 mg을 5 : 100의 비율로 혼합된 acetyl chloride와 methanol 용액 2 mL와 혼합하였다.
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