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제안 방법
- 세균 부유액을 혈액한천배지에 접종한 후 30℃ 배양기에서 18∼24시간 배양 후 집락 및 용혈유무를 관찰하였다.
- Duplex PCR을 위한 PCR 혼합액 dNTP (각기 2.5 mM), 10×PCR buffer 2 μL, primer 2쌍 10 pmol 각각 1 μL씩 넣었고, genomic DNA (25 μg) 1 μL, Taq DNA polymerase (2 unit) 1 μL, 최종 반응액은 증류수로 20 μL 되게끔 실시하였다.
- 접종 배지는 37℃ 항온기에 18시간 배양 후 결과를 판정하였고 minimal inhibitory concentration (MIC)는 MH액체배지에 vancomycin항생제는 400 μg/mL, 350 μg/mL, 300 μg/mL, 250 μg/mL, 200 μg/mL로 희석, teicoplanin항생제는 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL, 8 μg/mL희석하여 균주 접종 후 배양하여 판독하였다.
- 세균 부유액을 Mueller-Hinton Agar (MHA)에 고르게 접종한 후, 배지의 중앙에는 vancomycin (30 μg)디스크와 teicoplanin (30 μg) 있는 디스크를 20 mm 간격으로 놓았다.
- PCR방법은 임상 분리균주의 검출 및 항생제내 성유전자 분석에 특이적이고, 시간적인 소모가 적고 분석력과 재현성이 좋은 방법이다(Monstein 등, 1998). 본 연구에서는 대학병원으로부터 VRE균주를 분리하여 종특이유전자 및 vanA, vanB 유전자를 대상으로 duplex PCR 방법을 실시하여 표현형과 유전자형을 비교 분석하였다.
- 세균 부유액을 혈액한천배지에 접종한 후 30℃ 배양기에서 18∼24시간 배양 후 집락 및 용혈유무를 관찰하였다. 순수분리집락을 도말하여 그람염색을 실시하였다. 생화학적 시험으로 catalase test, bile esculin test, 6.
- 순수분리집락을 도말하여 그람염색을 실시하였다. 생화학적 시험으로 catalase test, bile esculin test, 6.5% NaCl배지에서 성장유무를 관찰하였다.
- 23개의 VRE 균주를 가온법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 순수 분리된 23개 균주를 90℃에서 10분 방치 후 진탕하였다.
- 23개의 VRE 균주를 가온법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 순수 분리된 23개 균주를 90℃에서 10분 방치 후 진탕하였다. 그리고 13,000 rpm에서 5분간 원심 후 상층액을 얻었다.
- 5 mM), 10×PCR buffer 2 μL, primer 2쌍 10 pmol 각각 1 μL씩 넣었고, genomic DNA (25 μg) 1 μL, Taq DNA polymerase (2 unit) 1 μL, 최종 반응액은 증류수로 20 μL 되게끔 실시하였다. DNA thermal cycler (Perkin Elmer, Inc. Wellesley, MA, USA)에서 Enterococcus 종 동정은 94℃에서 2분간 변성, 58℃에서 1분간 접합, 68℃에서 1분간 확장의 순서로 30회를 시행하고 68℃에서 7분간 최종확장 하였다. Van 유전자 검출은 95℃에서 1분간 변성, 64℃에서 2분간 접합, 72℃에서 1분 30초간 확장의 순서로 35회를 시행하고 72℃에서 7분간 최종확장하였다.
- PCR 증폭산물을 1.5% agarose gel에 midori green (2 μL)을 넣어 1× TAE buffer에서 70 volt, 100 mA로 45분 동안 전기영동을 실시한 다음, agarose gel을 UV transilluminator로 관찰하고, Gel Doc (Bio-Red, Inc. Hercules, CA, USA) 이미지 분석장치로 사진 촬영하였다.
대상 데이터
- 2012년 9월부터 11월까지 대전 C 대학병원에서 VITEK (bioMerieux, Inc. Haxelwood, MO, USA)기기로 vancomycinresistance Enterococci 세균으로 동정된 23균주를 대상으로 하였다.
- 분리균주 동정 및 항생제 감수성 검사 정도관리 균주로 Enterococcus faecium ATCC 19434, Enterococcus casseliflavus ATCC 700327 균주를 사용하였다.
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