비단백질 구성 아미노산인 gamma amino butyric acid(GABA)는 뇌에서 억제성 신경전달물질로 작용하며 혈압 저하, 신경 안정, 이뇨 작용 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 김치로부터 두유에서 커드를 형성하는 40개 균주를 분리하였다. GABA 생산력이 높은 균주를 선별하기 위하여 분리된 균주들을 두유에 접종하여 $37^{\circ}C$에서 48시간동안 발효하였다. 분리된 균주들 가운데 발효두부에서 가장 높은 GABA 를 생산하는 383 균주는 API 분석과 16S rDNA sequence를 통하여L. sakei로 동정되었으며 L. sakei 383으로 명명하였다. L. sakei 383은 MRS 배지에서 $35^{\circ}C$, 24시간 배양할 때 가장 높은 생육을 나타내었으며 두유에 균을 접종하여 $35^{\circ}C$에서 18시간 발효 했을 때를 GABA 생산을 위한 최적 배양 조건으로 정하였으며 최대 GABA 함량은 8.65 mg/100 g이었다.
비단백질 구성 아미노산인 gamma amino butyric acid(GABA)는 뇌에서 억제성 신경전달물질로 작용하며 혈압 저하, 신경 안정, 이뇨 작용 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 김치로부터 두유에서 커드를 형성하는 40개 균주를 분리하였다. GABA 생산력이 높은 균주를 선별하기 위하여 분리된 균주들을 두유에 접종하여 $37^{\circ}C$에서 48시간동안 발효하였다. 분리된 균주들 가운데 발효두부에서 가장 높은 GABA 를 생산하는 383 균주는 API 분석과 16S rDNA sequence를 통하여L. sakei로 동정되었으며 L. sakei 383으로 명명하였다. L. sakei 383은 MRS 배지에서 $35^{\circ}C$, 24시간 배양할 때 가장 높은 생육을 나타내었으며 두유에 균을 접종하여 $35^{\circ}C$에서 18시간 발효 했을 때를 GABA 생산을 위한 최적 배양 조건으로 정하였으며 최대 GABA 함량은 8.65 mg/100 g이었다.
Gamma amino butyric acid (GABA), known as a non-protein amino acid and major inhibitory neurotransmitter in the brain, has several functional properties such as neurotransmission, induction of hypotension, tranquilizer, and diuretic effects. The purpose of this study was to isolate and identify lact...
Gamma amino butyric acid (GABA), known as a non-protein amino acid and major inhibitory neurotransmitter in the brain, has several functional properties such as neurotransmission, induction of hypotension, tranquilizer, and diuretic effects. The purpose of this study was to isolate and identify lactic acid bacteria, producing high GABA in fermented soy curd. Thirty-two strains of tofu-forming lactic acid bacteria were isolated from kimchi which a traditional Korean food fermented with many kind of microorganism. Among 32 strains, four strains (strain No. 10, 104, 214, 249) formed firm soycurd. In order to select lactic acid bacteria having high GABA producing potential, the isolated strains were cultured in the soymilk and fermented for 48 hr at $37^{\circ}C$. A strain No. 383, which showed highest GABA contents in fermented soycurd, was identified as L. sakei by 16S rDNA sequencing and API analysis, and named as L. sakei 383. L. sakei 383 showed optimal growth up to 24 hr at $35^{\circ}C$ in MRS broth. The optimal time and temperature for GABA production were 18 hr and $35^{\circ}C$ in soymilk. In the optimal condition time and temperature, GABA content of fermented soycurd by L. sakei 383 was 8.65 mg/100 g.
Gamma amino butyric acid (GABA), known as a non-protein amino acid and major inhibitory neurotransmitter in the brain, has several functional properties such as neurotransmission, induction of hypotension, tranquilizer, and diuretic effects. The purpose of this study was to isolate and identify lactic acid bacteria, producing high GABA in fermented soy curd. Thirty-two strains of tofu-forming lactic acid bacteria were isolated from kimchi which a traditional Korean food fermented with many kind of microorganism. Among 32 strains, four strains (strain No. 10, 104, 214, 249) formed firm soycurd. In order to select lactic acid bacteria having high GABA producing potential, the isolated strains were cultured in the soymilk and fermented for 48 hr at $37^{\circ}C$. A strain No. 383, which showed highest GABA contents in fermented soycurd, was identified as L. sakei by 16S rDNA sequencing and API analysis, and named as L. sakei 383. L. sakei 383 showed optimal growth up to 24 hr at $35^{\circ}C$ in MRS broth. The optimal time and temperature for GABA production were 18 hr and $35^{\circ}C$ in soymilk. In the optimal condition time and temperature, GABA content of fermented soycurd by L. sakei 383 was 8.65 mg/100 g.
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문제 정의
최근에는 GABA를 건강 기능성 식품 소재로 이용할 목적으로 GABA를 첨가한 식품이나 음료가 개발되어 판매되고 있으나 미생물에 의해 생성된 GABA를 식품에 적용한 연구는 거의 없다. 본 연구에서는 김치유산균을 이용한 GABA 함유 soycurd 제조를 통해 전통 식품의 새로운 기능성 식품으로의 개발 가능성을 제시하고자 하였다. 따라서 전통 발효 식품인 김치로부터 유산균을 분리한 후 GABA 생산성이 우수한 균주를 선발하여 동정하고 고농도의 GABA 생산을 위한 최적 배양 조건을 확립하였다.
제안 방법
1차 선별된 균주에 의해 형성된 curd는 texture analyzer로 경도를 측정하여 단단한 정도를 비교하였다. 김치로부터 분리한 300개의 균주 중 37개의 균주는 curd를 형성하지 않거나 부패되었고 12개의 균주는 curd는 형성하였으나 너무 물러 경도 측정이 불가능하여 나머지 251개의 균주에 대해 경도를 측정하였다.
2차 선별 균주에 의해 형성된 curd의 경도는 texture analyzer(TA-XT2plus, Stable Micro Systems Ltd., Surrey, UK)를 이용하여 pre test speed 5 mm/sec, distance 15 mm, test speed 1 mm/sec, post test speed 10 mm/sec, return test dist. 1 mm, force 0.040 kg, time 0.09 sec, count 5 조건으로 하여 측정하였다.
0 mg/100 g 이상 되는 GABA를 생성함을 확인하였다. 383균주로 soycurd 제조 시 경도수치가 0.5 N 이상으로 측정되어 형태를 유지할 정도의 비교적 단단한 curd를 형성하였으며 선별 균주 중 GABA 생성 능력이 가장 우수하다고 판단되어 최종 선발 균주로 정하였다.
API CHL kit(API bioMerieux, Marcy l'Etoil, France)를 이용하여 49개의 탄소원에 대하여 37℃에서 24시간 및 48시간 동안 배양하면서 미생물 증식에 의한 색의 변화 여부를 관찰하여 각 탄소원 이용 여부를 관찰하였고 동정 결과는 Apilab Plus Software를 이용하여 확인하였다.
L. sakei 383의 최적 생장 온도를 알기 위하여 MRS 배지에서 온도 별로 배양한 후 생육을 확인하였다(Fig. 3). L.
김치로부터 분리한 300개의 균주 중 37개의 균주는 curd를 형성하지 않거나 부패되었고 12개의 균주는 curd는 형성하였으나 너무 물러 경도 측정이 불가능하여 나머지 251개의 균주에 대해 경도를 측정하였다. 경도 측정 결과 비교적 단단한 curd를 형성한 32개의 균주를 2차 선별 균주로 정하였다(Table 1). 경도수치가 0.
brevis와 유사한 것으로 판정되었다. 균의 상태에 따라 탄소원을 기질로 발효가 일어나는 조건이 조금씩 다를 수 있으므로 보다 정확한 결과를 확인하기 위해 16S rDNA sequence를 결정하고 이를 GeneBank에 등록된 여러 유산균들과 상동성을 비교하였다. 그 결과 383균주의 16S rDNA sequence는 Lactobacillus sakei와 99% 상동성을 보였다.
김치국물시료 1 mL를 시험관에 넣고, 멸균된 증류수를 가하여 10-5 ∼10-6의 농도로 희석하여 2% CaCO3가 첨가된 MRS(Difico, Sparks, MD, USA) 21152, USA) 한천평판배지에 도말한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하여 균락 주위에 투명환을 형성하는 균을 1차 선별하였다.
1차 선별된 균주에 의해 형성된 curd는 texture analyzer로 경도를 측정하여 단단한 정도를 비교하였다. 김치로부터 분리한 300개의 균주 중 37개의 균주는 curd를 형성하지 않거나 부패되었고 12개의 균주는 curd는 형성하였으나 너무 물러 경도 측정이 불가능하여 나머지 251개의 균주에 대해 경도를 측정하였다. 경도 측정 결과 비교적 단단한 curd를 형성한 32개의 균주를 2차 선별 균주로 정하였다(Table 1).
대두 100 g을 6시간 동안 물에 침지하여 불린 다음 물기를 제거하고 증류수 800 mL를 넣고 마쇄하여 비지를 제거한 콩즙을 autoclave에서 121℃에서 15분간 살균시켜 두유를 제조하였다. 두유는 상온에서 40～45℃로 냉각시키고 게르마늄 컵에 50 mL씩 넣어 1차 선별 균주를 2% 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 발효시켜 curd를 형성하는 균을 2차 선별하였다.
두유에서 L. sakei 383의 배양을 통한 GABA 생산의 최적 조건을 검토하기 위해 발효 온도 및 시간에 따른 GABA함량을 조사하였다. 최대 GABA 함량을 100%로 하여 조건 별로 생성된 GABA의 상대적인 함량을 백분율로 나타내었다.
본 연구에서는 김치유산균을 이용한 GABA 함유 soycurd 제조를 통해 전통 식품의 새로운 기능성 식품으로의 개발 가능성을 제시하고자 하였다. 따라서 전통 발효 식품인 김치로부터 유산균을 분리한 후 GABA 생산성이 우수한 균주를 선발하여 동정하고 고농도의 GABA 생산을 위한 최적 배양 조건을 확립하였다.
발효 시간에 따른 GABA 함량을 알아보기 위해 최적 발효 온도인 35℃에서 24시간 동안 발효하며 GABA 함량을 측정하였다(Fig. 6).
최종 선발된 균주를 MRS 배지에서 2회 이상 계대 배양하여 활성을 높인 후 실험에 사용하였다. 순수 분리된 균주는 gram 염색과 catalase test를 실시하였으며 포자생성, gas 생성유무를 확인하였다. API CHL kit(API bioMerieux, Marcy l'Etoil, France)를 이용하여 49개의 탄소원에 대하여 37℃에서 24시간 및 48시간 동안 배양하면서 미생물 증식에 의한 색의 변화 여부를 관찰하여 각 탄소원 이용 여부를 관찰하였고 동정 결과는 Apilab Plus Software를 이용하여 확인하였다.
최적 배양 시간을 확립하기 위하여 선택 균주를 24시간 배양한 종 배양액을 최적 배지에 1% 접종한 후 최적 온도에서 24시간 동안 배양하면서 3시간 간격으로 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
최적 배양 온도를 확립하기 위하여 선택 균주를 24시간 배양한 종 배양액을 최적 배지에 1% 접종한 후 25, 30, 35, 40℃에서 24시간 동안 계대 배양하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 최적 배양 시간을 확립하기 위하여 선택 균주를 24시간 배양한 종 배양액을 최적 배지에 1% 접종한 후 최적 온도에서 24시간 동안 배양하면서 3시간 간격으로 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
API CHL kit(API bioMerieux, Marcy l'Etoil, France)를 이용하여 49개의 탄소원에 대하여 37℃에서 24시간 및 48시간 동안 배양하면서 미생물 증식에 의한 색의 변화 여부를 관찰하여 각 탄소원 이용 여부를 관찰하였고 동정 결과는 Apilab Plus Software를 이용하여 확인하였다. 최종적으로 16S rDNA sequence를 분석하여 BLASTN program을 이용하여 GeneBank의 ribosomal DNA sequence와 비교하였으며 sequence의 상동성을 ClustalW program을 이용하여 비교 분석하였다.
0 unit/mL GABase 50 μL를 혼합하여 340 nm에서 흡광도를 측정하였으며(initial A), 20 mM α-ketoglutarate를 50 μL 넣고 25℃에서 60분 동안 반응시킨 후 340 nm에서 흡광도를 측정(final A)하였다. 표준곡선으로부터 측정된 흡광도(final A - initial A)를 대입하여 생성된 GABA량을 측정하였다.
대상 데이터
가 2% 첨가된 MRS 한천평판배지에서 균락 주변에 투명환을 형성하며 크기, 모양, 색이 다른 300개의 균락을 분리하였다. 1차 선별된 균주는 MRS 배지에 배양한 후, 2% CaCO3가 첨가된 MRS 한천평판배지에 여러 번 획선 도말하여 순수 분리한 후 실험에 사용하였다.
CaCO3가 2% 첨가된 MRS 한천평판배지에서 균락 주변에 투명환을 형성하며 크기, 모양, 색이 다른 300개의 균락을 분리하였다. 1차 선별된 균주는 MRS 배지에 배양한 후, 2% CaCO3가 첨가된 MRS 한천평판배지에 여러 번 획선 도말하여 순수 분리한 후 실험에 사용하였다.
비단백질 구성 아미노산인 gamma amino butyric acid(GABA)는 뇌에서 억제성 신경전달물질로 작용하며 혈압 저하, 신경 안정, 이뇨 작용 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 김치로부터 두유에서 커드를 형성하는 40개 균주를 분리하였다. GABA 생산력이 높은 균주를 선별하기 위하여 분리된 균주들을 두유에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 발효하였다.
시중에 구입한 김치와 가정에서 섭취하고 있는 김치를 수집하여 시료로 사용하였다. 김치국물시료 1 mL를 시험관에 넣고, 멸균된 증류수를 가하여 10-5 ∼10-6의 농도로 희석하여 2% CaCO3가 첨가된 MRS(Difico, Sparks, MD, USA) 21152, USA) 한천평판배지에 도말한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하여 균락 주위에 투명환을 형성하는 균을 1차 선별하였다.
최종 선발된 균주를 MRS 배지에서 2회 이상 계대 배양하여 활성을 높인 후 실험에 사용하였다. 순수 분리된 균주는 gram 염색과 catalase test를 실시하였으며 포자생성, gas 생성유무를 확인하였다.
데이터처리
통계처리는 SPSS Ver. 21.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 ANOVA 분석 후 p<0.05에서 Duncan’s multiple range test를 실시하여 유의성 검정을 하였다.
이론/모형
The blanching pattern was generated by neighbor-joining method. Bar, 0.
제조된 soycurd의 GABA 함량을 정량분석하기 위해 효소분석 방법을 이용하였다(21). 동결 건조 시료 0.
성능/효과
sakei 383의 생육은 25～40℃의 온도범위에서 커다란 차이를 보이지 않고 비슷한 생육을 보였으나 균체의 최대 생육도를 비교해 보았을 때 L. sakei 383의 최적 배양온도는 35℃인 것을 확인할 수 있었다.
sakei 383으로 명명하였다. L. sakei 383은 MRS 배지에서 35℃, 24시간 배양할 때 가장 높은 생육을 나타내었으며 두유에 균을 접종하여 35℃에서 18시간 발효 했을 때를 GABA 생산을 위한 최적 배양 조건으로 정하였으며 최대 GABA 함량은 8.65 mg/100 g이었다.
최대 GABA 함량을 100%로 하여 조건 별로 생성된 GABA의 상대적인 함량을 백분율로 나타내었다. L. sakei 383을 두유에 접종하여 24시간 발효한 후 온도에 따른 GABA 함량을 측정한 결과 25, 30, 40℃에 따른 GABA 함량은 큰 차이가 없이 비슷한 수치를 나타내었으며 35℃에서 가장 높은 GABA 함량을 나타내었다(Fig. 5). 이는 L.
L. sakei 383의 배양 시간에 의한 변화를 확인하기 위하여 MRS 배지에 접종하여 35℃에서 24시간 배양하여 균체 생육을 확인한 결과(Fig. 4), 배양 3시간까지 유도기를 보이다가 3시간 이후부터 대수기가 시작되어 6시간 사이에 급격히 증가하였으며 6시간 이후에는 생장이 점차 감소하여 24시간에서 가장 높은 생육을 나타내었다.
경도 측정 결과 비교적 단단한 curd를 형성한 32개의 균주를 2차 선별 균주로 정하였다(Table 1). 경도수치가 0.5 N 이상 되면 형태를 유지할 정도로 단단한 curd를 형성함을 알 수 있었으며 특히 4개의 균주(Strain No. 10, 104, 214, 249)는 경도 수치가 0.6 N 이상으로 측정되어 가장 단단한 curd를 형성하는 것으로 나타났다. 경도 수치가 높은 curd는 대부분 표면이 매끄럽고 발효 용기를 뒤집어 부었을 때 형태를 유지하였으나 경도 수치가 낮은 curd는 표면이 갈라지거나 수분이 많았고 쉽게 부서지며 흩어지는 것을 볼 수 있었다(Fig.
균의 상태에 따라 탄소원을 기질로 발효가 일어나는 조건이 조금씩 다를 수 있으므로 보다 정확한 결과를 확인하기 위해 16S rDNA sequence를 결정하고 이를 GeneBank에 등록된 여러 유산균들과 상동성을 비교하였다. 그 결과 383균주의 16S rDNA sequence는 Lactobacillus sakei와 99% 상동성을 보였다. 이는 API 50 CHL kit 결과와 차이가 있는 것으로 탄소원 이용성을 통한 동정과 16S rDNA sequence를 이용한 분자유전학적 동정 결과가 일치하지 않은 결과였다.
발효 시간이 증가함에 따라 점차 GABA 함량이 증가하여 18시간 발효 시 최대 함량을 나타내었다가 18시간 이후에는 다소 감소하는 것으로 나타났다.
GABA 생산력이 높은 균주를 선별하기 위하여 분리된 균주들을 두유에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 발효하였다. 분리된 균주들 가운데 발효두부에서 가장 높은 GABA를 생산하는 383 균주는 API 분석과 16S rDNA sequence를 통하여 L. sakei로 동정되었으며 L. sakei 383으로 명명하였다. L.
선별된 32개 균주에 따른 soycurd의 GABA 함량은 약간씩 차이가 있었지만 2.5 mg/100 g 이상으로 대부분이 높은 함량을 나타내었다.
위의 결과를 종합해 볼 때, L. sakei 383은 MRS배지에 접종하여 35℃에서 24시간 배양하였을 때 최적의 생장률을 보인 것을 확인할 수 있었다. Park(24)은 김치에서 분리한 L.
이러한 문제를 보완하기 위해 GABA 생산 능력이 있는 미생물을 탐색한 결과, 쌀, 콩, 김치의 발효 식품에서 분리한 유산균이 매우 높은 GABA 생산 능력을 가지는 것이 밝혀졌다.
sakei 383의 배양을 통한 GABA 생산의 최적 조건을 검토하기 위해 발효 온도 및 시간에 따른 GABA함량을 조사하였다. 최대 GABA 함량을 100%로 하여 조건 별로 생성된 GABA의 상대적인 함량을 백분율로 나타내었다. L.
최대 GABA 함량을 나타내는 soycurd 발효 조건을 탐색한 결과 최적 배양 조건으로 35℃에서 18시간 발효하는 것이 가장 적절하였고 최대 GABA 함량을 아미노산 분석기로 측정한 결과 8.65 mg/100 g으로 나타났다. GABA 함량은 다양한 미생물의 발효에 의해 증가한다고 알려져 있는데(26), Shin(27)의 보고에 따르면 L.
최종 선발 균주인 383균주를 동정하기 위하여 형태학적, 생화학적 특성을 검토한 결과 383균주는 Gram 양성, catalase 음성 그리고 포자를 형성하지 않는 간균 형태로 관찰되었다. API 50 CHL kit를 이용하여 49개 탄소원에 대한 이용성(Table 3)을 통한 균 동정을 시도한 결과, L.
후속연구
sakei 383이 GABA 함량이 높은 soycurd 제조를 위한 우수한 starter임을 확인하였다. 따라서 L. sakei 383으로 발효한 soycurd는 GABA함량이 높은 기능성 식품으로 개발이 가능할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
대두 이용에 어떤 장애 요인이 있는가?
대두는 육류자원이 부족한 우리 민족에게 곡류에서 부족되기 쉬운 필수 아미노산과 필수지방산의 주된 공급원이며 mineral, oligosaccharide, dietary fiber, isoflavone, phytate, saponin, lecithin, phenolic acids 등의 다양한 생리 활성 물질들이 함유되어 있어 골다공증 예방, 혈중 콜레스테롤 저하, 혈압 강하, 항산화, 항암, 항비만, 고지혈증 등에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다(3-5). 이렇듯 풍부한 영양학적인 가치를 지니는 대두도 콩비린내를 유발하는 lipoxygenease, 위와 장에서 gas를 생산하는 flatulence 뿐만 아니라 trypsin inhibitor, phytic acid 등의 장애요인이 있어 이용에 제한을 받고 있으며 이를 해결하기 위한 일환으로 발효에 관한 연구가 진행되고 있다(6).
γ-Aminobutyric acid는 어떤 식품에 함유되어 있는가?
그 밖에도 성장 호르몬의 분비 조절(12), 통증 완화(13), ACE 저해 활성(14) 등이 있어 생리학적으로 매우 유익한 물질이다. GABA는 혐기적으로 처리한 녹차, 발아 시킨 쌀, 김치, 홍국, 치즈, 발효유 등 다양한 식품에 함유되어 있으나(15-17) 함량이 낮아 생리 작용을 나타내는 농도를 얻기 어렵다고 알려져 있다. 최근에는 발효 제법을 이용한 GABA의 생산이 연구되고 있으나 아직은 수율이 낮은 형편이며 합성 GABA의 경우 식욕 부진, 설사, 변비 등의 부작용이 보고되고 있다(18).
대두의 특징은?
최근 건강에 대한 관심이 증가함에 따라 영양과 기능성을 강조한 건강 보조식품들이 각광받고 있고 생리활성물질이 풍부한 식물성 재료에 관한 연구가 활발해 지면서 대두가 건강식품으로 주목 받고 있다(1,2). 대두는 육류자원이 부족한 우리 민족에게 곡류에서 부족되기 쉬운 필수 아미노산과 필수지방산의 주된 공급원이며 mineral, oligosaccharide, dietary fiber, isoflavone, phytate, saponin, lecithin, phenolic acids 등의 다양한 생리 활성 물질들이 함유되어 있어 골다공증 예방, 혈중 콜레스테롤 저하, 혈압 강하, 항산화, 항암, 항비만, 고지혈증 등에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다(3-5). 이렇듯 풍부한 영양학적인 가치를 지니는 대두도 콩비린내를 유발하는 lipoxygenease, 위와 장에서 gas를 생산하는 flatulence 뿐만 아니라 trypsin inhibitor, phytic acid 등의 장애요인이 있어 이용에 제한을 받고 있으며 이를 해결하기 위한 일환으로 발효에 관한 연구가 진행되고 있다(6).
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