파밤나방의 생물적 방제를 위한 곤충병원성 곰팡이 Metarhizium anisopliae의 특성 및 병원성 검정 Characteristics and Virulence Assay of Entomopathogenic Fungus Metarhizium anisopliae for the Microbial Control of Spodoptera exigua원문보기
난방제 해충의 하나인 파밤나방의 생물적 방제를 위하여 곤충병원성 곰팡이를 수집, 분리하여 파밤나방에 고병원성인 곰팡이를 선발하는 연구를 수행하였다. 곤충병원성 곰팡이의 수집은 친환경 농업지역인 경기도 양평 지역의 수집된 토양 샘플에 갈색거저리를 넣어 감염된 곤충에서 곰팡이를 분리, 수집하는 insect-bait법을 활용하였다. 분리한 곤충병원성 곰팡이를 파밤나방 3령 유충에 처리한 결과, FT83균주가 파밤나방에 병원성이 높았으며, 현미경을 이용한 형태학적 분석과 18srRNA의 ITS sequencing을 통한 분자생물학적 방법을 이용하여 동정한 결과 Metarhizium anisopliae로 동정되었다. 선발한 M. anisopliae FT83의 온도별 균사생장속도는 $15^{\circ}C$에서 $30^{\circ}C$까지는 온도가 증가할수록 균사의 생장이 촉진되었으나 35에서는 균사가 생장하지 않았다. 선발 균주의 농도별 살충율은 $1{\times}10^6$ conidia/ml에서 $81.6{\pm}9.3%$, $1{\times}10^7$ conidia/ml에서 100%, $1{\times}10^8$conidia/ml에서 100%로 $1{\times}10^7$ conidia/ml 농도가 경제적인 처리농도였다.
난방제 해충의 하나인 파밤나방의 생물적 방제를 위하여 곤충병원성 곰팡이를 수집, 분리하여 파밤나방에 고병원성인 곰팡이를 선발하는 연구를 수행하였다. 곤충병원성 곰팡이의 수집은 친환경 농업지역인 경기도 양평 지역의 수집된 토양 샘플에 갈색거저리를 넣어 감염된 곤충에서 곰팡이를 분리, 수집하는 insect-bait법을 활용하였다. 분리한 곤충병원성 곰팡이를 파밤나방 3령 유충에 처리한 결과, FT83균주가 파밤나방에 병원성이 높았으며, 현미경을 이용한 형태학적 분석과 18srRNA의 ITS sequencing을 통한 분자생물학적 방법을 이용하여 동정한 결과 Metarhizium anisopliae로 동정되었다. 선발한 M. anisopliae FT83의 온도별 균사생장속도는 $15^{\circ}C$에서 $30^{\circ}C$까지는 온도가 증가할수록 균사의 생장이 촉진되었으나 35에서는 균사가 생장하지 않았다. 선발 균주의 농도별 살충율은 $1{\times}10^6$ conidia/ml에서 $81.6{\pm}9.3%$, $1{\times}10^7$ conidia/ml에서 100%, $1{\times}10^8$conidia/ml에서 100%로 $1{\times}10^7$ conidia/ml 농도가 경제적인 처리농도였다.
Beet armyworm, Spodoptera exigua is difficult to control using chemical insecticides because of the fast development of insecticide resistance. For eco-friendly beet armyworm managements, various control agents are required. Entomopathogenic fungus is one of the promise control agents as an alternat...
Beet armyworm, Spodoptera exigua is difficult to control using chemical insecticides because of the fast development of insecticide resistance. For eco-friendly beet armyworm managements, various control agents are required. Entomopathogenic fungus is one of the promise control agents as an alternative to chemical control agent. We isolated entomopathogenic fungi from soil samples of Yangpyeong, Gyeonggi-do by insect-bait method using Tenebio molitor and conducted bioassay to larva of beet armyworm. The result of bioassay, a selected strain FT83 showed 100% mortality against third instar larva of S. exigua. On the basis of morphological characteristics and analysis of 18srRNA sequence for ITS, the strain FT83 was identified as a Metarhizium anisopliae. The mortality of beet armyworm showed $81.6{\pm}9.3%$ at $1{\times}10^6$ conidia/ml, 100% at $1{\times}10^7$ conidia/ml and 100% at $1{\times}10^8$ conidia/ml respectively. Therefore, we recommend to proper control efficacy against S. exigua in which more than $1{\times}10^7$ conidia/ml suspension of M. anisopliae FT83.
Beet armyworm, Spodoptera exigua is difficult to control using chemical insecticides because of the fast development of insecticide resistance. For eco-friendly beet armyworm managements, various control agents are required. Entomopathogenic fungus is one of the promise control agents as an alternative to chemical control agent. We isolated entomopathogenic fungi from soil samples of Yangpyeong, Gyeonggi-do by insect-bait method using Tenebio molitor and conducted bioassay to larva of beet armyworm. The result of bioassay, a selected strain FT83 showed 100% mortality against third instar larva of S. exigua. On the basis of morphological characteristics and analysis of 18srRNA sequence for ITS, the strain FT83 was identified as a Metarhizium anisopliae. The mortality of beet armyworm showed $81.6{\pm}9.3%$ at $1{\times}10^6$ conidia/ml, 100% at $1{\times}10^7$ conidia/ml and 100% at $1{\times}10^8$ conidia/ml respectively. Therefore, we recommend to proper control efficacy against S. exigua in which more than $1{\times}10^7$ conidia/ml suspension of M. anisopliae FT83.
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문제 정의
본 연구에서는 국내 토착 미생물 자원을 활용한 난방제 해충 파밤나방의 친환경 방제를 위해 국내 토양에서 곤충병원성 곰팡이 균주를 수집, 파밤나방에 고병원성 곰팡이 균선발 실험을 수행하였다.
Metarhizium anisopliae는 1879년 Elie Metchnikonoff가 딱정벌레인 Anisoplia austriaca를 방제하기 위한 실험에 최초로 사용된 이래로 넓은 곤충 기주 범위와 더불어 인축 및 환경에 무해하여 해충방제 도구로서 많은 주목을 받아왔다. 본 연구에서는 국내의 토양으로부터 선발한 M. anisopliae FT83균주를 고온성 난방제 해충인 파밤나방을 효과적으로 방제하기 위한 수단으로서의 가능성을 제시하는 바이다
제안 방법
채집한 토양은 2 mm채에 내려 50 ml을 플라스틱 통에 담고 부화 후 60일 가량 된 갈색거저리(Tenebrio molitor) 10마리를 넣어 25 ± 2oC에서 2주간 보관하면서 하루에 한 번씩 7일 동안 뒤집어주었다. 2주 배양 후 이병곤충의 숫자를 기록하고 이병곤충의 표면을 3% 차아염소산나트륨용액으로 3분, 멸균수로 3분간 2회 살균한 후 멸균수로 적신 필터 페이퍼가 깔린 90 mm 패트리디쉬에 넣어 25oC, 7-14일간 배양하며 곰팡이의 포자성장을 유도하였다. 사충의 표피로부터 포자를 취하여 PDA에 옮겨 하나의 콜로니를 분리하였다.
8S-ITS2)부분을 PCR증폭하였다. PCR증폭산물은 1.0% agarose gel을 이용하여 전기영동 후 Power Gel Extraction Kit(Dyne Bio Inc., Korea)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR산물의 염기서열 분석은 제노셀(주)에 의뢰하였고 그 결과를 Clustal X를 이용하여 배열하였고, MEGA 4.
PDA에서 3-4일간 배양된 균체를 2% water agar위에 놓인 두 장의 멸균 커버슬라이드(지름 22 × 30 mm) 사이에 놓고 25oC 에서 7일간 배양 후 위상차 현미경 (400x)을 이용하여 균사 및 포자의 형태를 관찰하였다.
곰팡이의 genome DNA 추출을 위해 PDA에서 2주간 배양한 곰팡이 균체에 fungal DNA extraction buffer[0.2M Tris-Cl; pH 7.5, 0.5 M NaCl, 10 mM EDTA; pH 8.0, and 1% SDS (w/v)]과 phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25 : 24 : 1)을 처리 한 후 원심 분리하여 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA용액은 냉 에탄올을 이용하여 침전시키고 원심분리 후 멸균 증류수에 녹여 실험에 이용하였다.
선발한 FT83의 적정 처리농도를 알아보기 위해 1 × 104 -109 conidia/ml 농도의 포자현탁액을 이용하여 위와 같은 방법으로 생물검정 하였다. 또한 선발한 FT83의 처리 온도별 살충율을 알아보기 위해 107 - 109 conidia/ml 농도의 포자현탁액을 이용하여 위와 같은 방법으로 처리하고 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 광조건 16L : 8D, 습도 90% 이상으로 유지하여 6일 동안 매일 치사충 수를 관찰하였다.
anisopliae FT83를 PDA배지에 접종하여 25oC에서 14일간 배양하였다. 배양된 M. anisopliae FT83균총을 직경 7 mm의 코르크보러로 떼어내어 PDA배지의 중앙에 치상하고 15, 20, 25, 30, 35oC에서 7일간 배양하였다. 실험은 3반복 하였으며 배양 7일 후 균사의 성장을 자(Digimatic Caliper,Mitutoyo corp.
분리 균주의 분자생물학적 동정을 위해 ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3')과 ITS2(5'-TTTCCTCCCGGTCTATG-3') primer를 사용하여 internal transcribed spacer(ITS1-5.8S-ITS2)부분을 PCR증폭하였다.
5 cm의 polyvinyl acetal cone nozzle)를 이용하여 파밤나방 유충이 접종된 배추 잎 앞, 뒷면에 살포하였다. 살포된 잎은 상온에서 한 시간 동안 건조한 후 축축한 필터페이퍼가 깔린 페트리디쉬에 넣고, 25oC, 광조건 16L : 8D, 습도 90% 이상으로 유지하여 6일 동안 매일 치사충 수를 관찰하였다. 치사충은 멸균수로 적신 필터페이퍼가 깔린 페트리디쉬에 옮겨 표피에서 곰팡이가 발생하는지 관찰하였다.
생물 검정을 위한 포자현탁액은 포자가 형성된 배지에 5 ml의 멸균된 0.01% Tween80 용액을 넣고 유리막대로 표면을 긁어 포자를 회수한 후 거즈로 걸러 hemocytometer를 이용하여 계수하고 생물검정에 필요한 농도의 포자현탁액(1 × 108 conidia/ml)을 제조하였다.
01% Tween80 용액만을 처리하였다. 생물검정은 3회 수행되었으며, 매 실험마다 3개의 반복을 두었다. 분리한 곤충병원성 곰팡이 중에 파밤나방에 높은 살충율을 나타내는 FT83 균주를 선발하였다.
01% Tween80 용액을 넣고 유리막대로 표면을 긁어 포자를 회수한 후 거즈로 걸러 hemocytometer를 이용하여 계수하고 생물검정에 필요한 농도의 포자현탁액(1 × 108 conidia/ml)을 제조하였다. 생물검정은 파밤나방 3령(부화 후 7일) 유충 10마리가 접종된 직경 9 cm 배추 잎에 포자 현탁액을 살포하여 실시하였다. 포자현탁액 700 µl를 Plexyglass 스프레이타워(100kPA, 직경 1.
선발한 FT83의 적정 처리농도를 알아보기 위해 1 × 104 -109 conidia/ml 농도의 포자현탁액을 이용하여 위와 같은 방법으로 생물검정 하였다.
anisopliae FT83균총을 직경 7 mm의 코르크보러로 떼어내어 PDA배지의 중앙에 치상하고 15, 20, 25, 30, 35oC에서 7일간 배양하였다. 실험은 3반복 하였으며 배양 7일 후 균사의 성장을 자(Digimatic Caliper,Mitutoyo corp.)를 이용하여 측정하였다.
, Korea)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR산물의 염기서열 분석은 제노셀(주)에 의뢰하였고 그 결과를 Clustal X를 이용하여 배열하였고, MEGA 4.1 프로그램 내의 neighbor-joining 방법을 사용하여 계통분석 및 계통도를 구축하였다.
채집한 토양은 2 mm채에 내려 50 ml을 플라스틱 통에 담고 부화 후 60일 가량 된 갈색거저리(Tenebrio molitor) 10마리를 넣어 25 ± 2oC에서 2주간 보관하면서 하루에 한 번씩 7일 동안 뒤집어주었다.
살포된 잎은 상온에서 한 시간 동안 건조한 후 축축한 필터페이퍼가 깔린 페트리디쉬에 넣고, 25oC, 광조건 16L : 8D, 습도 90% 이상으로 유지하여 6일 동안 매일 치사충 수를 관찰하였다. 치사충은 멸균수로 적신 필터페이퍼가 깔린 페트리디쉬에 옮겨 표피에서 곰팡이가 발생하는지 관찰하였다. 대조구에는 0.
곤충병원성 곰팡이를 분리하기 위해 양평의 파 재배지에서 토양을 채취하였다. 각 토양샘플은 20 m2 내 4 지점을 무작위로 설정하여 지름 7 cm 오거(auger)를 이용하여 5 cm 깊이로 0.5 L의 토양을 채취하였다. 채취한 토양은 지퍼백에 넣어 잘 섞은 후 실험 전까지 4oC에서 보관하였다.
곤충병원성 곰팡이를 분리하기 위해 양평의 파 재배지에서 토양을 채취하였다. 각 토양샘플은 20 m2 내 4 지점을 무작위로 설정하여 지름 7 cm 오거(auger)를 이용하여 5 cm 깊이로 0.
본 실험에 사용된 파밤나방은 국립농업과학원 작물보호과 실험실에서 분양 받아 온도 25oC, 광조건 16L : 8D, 상대습도 70±5% 조건으로 사육하였고 인공사료(bioserve, mixing direction #F9219B)를 공급하여 누대 사육하였다.
생물검정은 3회 수행되었으며, 매 실험마다 3개의 반복을 두었다. 분리한 곤충병원성 곰팡이 중에 파밤나방에 높은 살충율을 나타내는 FT83 균주를 선발하였다. 선발한 FT83의 적정 처리농도를 알아보기 위해 1 × 104 -109 conidia/ml 농도의 포자현탁액을 이용하여 위와 같은 방법으로 생물검정 하였다.
선발된 M. anisopliae FT83를 PDA배지에 접종하여 25oC에서 14일간 배양하였다. 배양된 M.
데이터처리
Means within the same column followed by the same letter are not significantly different by Duncan’s multiple range test.
이론/모형
anisopliae FT83 with related fungal species from NCBI. The tree was constructed by the neighbor-joining method based on genetic distances calculated by the maximum composite likelihood method. Bootstrap values ≥ 70% are labeled.
분리 균주의 형태학적 관찰을 위하여 slide grass culture 방법을 이용하였다.(Lawrence A.
토양샘플을 채집 후 일주일 내에 insect-bait법을 이용하여 곤충병원성 곰팡이를 분리하였다(Meyling. N.V. et al., 2007). 채집한 토양은 2 mm채에 내려 50 ml을 플라스틱 통에 담고 부화 후 60일 가량 된 갈색거저리(Tenebrio molitor) 10마리를 넣어 25 ± 2oC에서 2주간 보관하면서 하루에 한 번씩 7일 동안 뒤집어주었다.
성능/효과
선발 균주의 분자생물학적 동정을 위하여 ITS부분을 증폭하여 T-vector에 cloning 후 염기서열을 결정한 결과 M. anisopliae 균주인 LSVT1 (FJ545318), CNHB3 (FJ545293), CNGU3 (FJ545289), CNGD10 (FJ545285), M1 (EF113330) 균주와 100% 상동성을 나타내었다. 형태학적 및 분자생물학적 동정 결과를 통해 분리 곰팡이는 최종적으로 Metarhizium anisopliae로 동정하였고, M.
선발한 M. anisopliae FT83의 균사 생장 속도(Table 1)는 15oC에서 12.56 ± 0.51 mm, 20℃에서 18.35 ± 0.58 mm, 25oC에서 24.92 ± 0.49 mm, 30oC에서 29.43 ± 0.31 mm으로 온도가 높아질수록 균사의 생장속도가 증가하였으나 35oC에서는 균사의 생장이 이루어지지 않았다.
선발한 M. anisopliae FT83의 포자현탁액(1 × 104 -109 conidia/ml with 0.01% Tween80)을 이용하여 파밤나방 3령 유충에 대하여 살충력을 검정한 결과(Table 2), 포자현탁액 1 × 104 conidia/ml의 농도에서는 43.3 ± 12.71%의 살충율과 6.43일의 반수치사시간으로 파밤나방에 대한 낮은 방제효과를 보였지만 1 × 105, 1 × 106, 1 × 107 conidia/ml의 농도에서는 각각 65.9 ± 4.96%, 81.6 ± 9.3%, 100%의 살충율과 4.73, 3.7일, 2.21일의 반수치사시간을 나타내어 포자현탁액의 농도가 높을수록 살충율도 증가하는 경향을 보였다.
선발한 균주를 PDA에 옮겨 생장을 관찰한 결과 처음에는 흰색으로 균사생장을 하다가 시간이 지나면서 사충에서 분리한 곰팡이의 색깔과 같은 짙은 녹색의 포자를 형성하는 것을 관찰하였으며 현미경적 관찰 결과에서는 분생포자는 장타원형(5~9 µm)으로 녹색의 색깔을 띠며 촛대모양의 분생자 자루위에 연쇄상으로 존재하였다.
토양으로부터 분리한 곤충병원성 곰팡이를 파밤나방에 3령유충에 생물 검정한 결과 파밤나방에 100%의 살충율을 보이는 M. anisopliae FT83 균주를 선발하였다. 선발한 균주를 PDA에 옮겨 생장을 관찰한 결과 처음에는 흰색으로 균사생장을 하다가 시간이 지나면서 사충에서 분리한 곰팡이의 색깔과 같은 짙은 녹색의 포자를 형성하는 것을 관찰하였으며 현미경적 관찰 결과에서는 분생포자는 장타원형(5~9 µm)으로 녹색의 색깔을 띠며 촛대모양의 분생자 자루위에 연쇄상으로 존재하였다.
특히, 일반적인 포자처리 농도인 1 × 108 conidia/ml의 처리구에서는 접종 후 4일 후 100%의 높은 살충율을 보였다.
anisopliae 균주인 LSVT1 (FJ545318), CNHB3 (FJ545293), CNGU3 (FJ545289), CNGD10 (FJ545285), M1 (EF113330) 균주와 100% 상동성을 나타내었다. 형태학적 및 분자생물학적 동정 결과를 통해 분리 곰팡이는 최종적으로 Metarhizium anisopliae로 동정하였고, M. anisopliae FT83으로 명명하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
파밤나방의 원산지는 어디인가?
파밤나방(Spodoptera exigua Hüber)은 동남아시아가 원산지인 해충으로 주로 열대 및 아열대 지역으로 넓게 분포하였으나, 최근에는 온대지역에도 분포하는 등 전 세계적으로 발생하는 주요 농업해충이다. 우리나라에서는 1년에 4-5회 발생하고 남부지방의 경우 6월 초에서 11월 말까지 발생하는데 7월 하순에서 10월 하순에 성충의 발생이 많으며 최성기는 8월 중순으로 알려져 있다(Jin et al.
국내에서 파밤나방은 어떤 농작물에 피해를 주는가?
파밤나방의 기주 범위는 광범위하여 채소, 화훼, 과수 등 40과 200여종에 피해를 입히고 있으며(Gho et al.,1991), 국내에서는 파, 배추, 수박 등 다양한 농작물에 발생하여 큰 피해를 주고 있다. 파밤나방의 어린 유충은 식물 잎의 표피를 갉아먹거나 구멍을 뚫어 가해하며 노숙유충은 불규칙하게 폭식하면서 가해하는 특성이 있다.
우리나라에서 파밤나방의 최성기는 언제인가?
파밤나방(Spodoptera exigua Hüber)은 동남아시아가 원산지인 해충으로 주로 열대 및 아열대 지역으로 넓게 분포하였으나, 최근에는 온대지역에도 분포하는 등 전 세계적으로 발생하는 주요 농업해충이다. 우리나라에서는 1년에 4-5회 발생하고 남부지방의 경우 6월 초에서 11월 말까지 발생하는데 7월 하순에서 10월 하순에 성충의 발생이 많으며 최성기는 8월 중순으로 알려져 있다(Jin et al., 2009).
참고문헌 (14)
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