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문제 정의
- 그러나, 여러 소독 공정적용을 통한 내성유전자 제어에 대한 국내외 조직적인 연구는 극히 드문 편이다. 따라서, 본 연구의 목적은 바이오 오염물질 중의 하나인 항생제 내성균 및 유전자 제어를 위해 다양한 소독 공정의 소독능을 비교하는 것이다.
제안 방법
- 염소소독은 batch와 continuous 두 형태로 실험하였다. Batch test는 E.coli(pB10) 시료에 농도별(염소주입량 0, 3, 6, 7.5, 10, 20, 30 mg/L)로 차아염소산 나트륨을 주입하고, 접촉 후 샘플은 염산(HCl 1+500)을 이용하여 pH 7.6을 맞추었다(Table 1). 각 시료마다 접촉시간을 15분으로 하였으며 접촉시간동안에는 20 ℃ Incubator에서 150 rpm으로 지속적으로 shaking을 시켜주었다.
- Continuous test는 시료에 농도별(염소주입량 0, 3, 6, 7.5, 10, 20, 30 mg/L)로 차아염소산 나트륨을 주입하고 시간별(0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 15 min)로 샘플을 추출하여 측정하였다. 접촉시간동안 반응조의 온도는 20 ℃를 유지 하였으며, 염산(HCl 1+500)을 이용하여 반응조의 pH가 7.
- E.coli(pB10)의 사멸 정도는 LB+Agar 배지에 살균된 시료를 도말하여 16시간동안 37 ℃ incubator에서 배양을 하고 자라난 콜로니(colony)수를 개수하여, 살균되지 않은 콜로니 수와 비교하여 사멸 정도(%)를 판단하였다. pB10 플라스미드의 제거 여부는 살균된 시료 50 mL에서 DNA를 추출하여 quantative PCR (qPCR)을 통해 살균하지 않은 pB10과 비교 정량화(%)하였다.
- coli(pB10)의 사멸 정도는 LB+Agar 배지에 살균된 시료를 도말하여 16시간동안 37 ℃ incubator에서 배양을 하고 자라난 콜로니(colony)수를 개수하여, 살균되지 않은 콜로니 수와 비교하여 사멸 정도(%)를 판단하였다. pB10 플라스미드의 제거 여부는 살균된 시료 50 mL에서 DNA를 추출하여 quantative PCR (qPCR)을 통해 살균하지 않은 pB10과 비교 정량화(%)하였다. pB10 플라스미드를 정량화하는 방법은 다음과 같다.
- pB10은 다제 내성(amoxicillin, streptomycin, sulfamethoxazole, tetracycline) 및 중금속 내성(mercury)플라스미드 이다. pB10은 실제 하수 처리장에서 분리 동정 되었고 여러 다른 종류의 환경 미생물들에 전달될 수 있기에 본 연구에 적용하였다. (Schluter et al.
- 또한 kinetic 실험을 통하여 구해진 각각의 1 log, 2 log와 3 log 까지의 제거율에 필요한 CT 값을 염소와 오존 공법에 대해 각각 산출하였다(Table 3). 전체적으로 항생제 내성균의 제어 보다 항생제 내성 유전자 제어를 위한 CT 값이 높았다.
- 먼저 각 시간별로 소독에 의해 생존한 항생제 내성균 및 내성 유전자와 내성 유전자의 전달율(Nt) 대비 소독에 영향을 받지 않은 항생제 내성균 및 내성 유전자와 내성 전달율(N0)에 –자연로그 ln을 곱하여 시간별 –ln(Nt/N0) 값의 그래프를 그렸다.
- 본 연구에서는 각 소독 기법별 소독 제어능을 산정하기 위하여 두 가지 방법이 사용되었다. 첫째는 소독에 의한 대장균 E.
- 염소소독은 batch와 continuous 두 형태로 실험하였다. Batch test는 E.
- 이후 시료(106 ∼107 CFU/mL)를 반응조에 주입하여 시간별(0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 15 min)로 반응조에서 샘플을 추출하여 측정하였다.
- coli(pB10)을 WHIRL PAK 안에 놓고 질소로 충진 하여 산소로 인한 영향을 최소한으로 하였다. 전자가속기는 이비테크(주)의 전자가속기 ELV-8을 이용하였고, 전자빔 에너지는 2.5 MeV로 하여 0 / 0.5 / 1 / 2.5 / 5 / 10 / 25 / 50 / 100 DOSE 별로 전자빔을 쏘여 실험하였다. 선량은 10 m/min으로 하여 진행하였다.
- 전자빔 소독 실험은 준비된 E.coli(pB10)을 WHIRL PAK 안에 놓고 질소로 충진 하여 산소로 인한 영향을 최소한으로 하였다. 전자가속기는 이비테크(주)의 전자가속기 ELV-8을 이용하였고, 전자빔 에너지는 2.
- 순산소의 가스 유량은 4 ∼ 5 L/min 으로, 10 psi 가압상태로 60분 동안 오존을 발생시켰으며, 이때 잔류 오존 농도는 10 mg/L 였다. 준비된 10 mg/L의 오존 용액을 3차 증류수로 희석을 하여 다양한 오존 주입량(오존농도 0, 3, 5, 7, 10 mg/L)을 만들어 사용 하였다. 각 시료마다 접촉시간을 15분으로 하였고, 접촉시간동안에는 지속적으로 shaking을 시켜주었다.
- 이를 위해 pB10 플라스미드를 10배씩 연차적으로 희석시켜 검량 샘플을 준비하였다. 준비된 48개 플라스틱 template에 SYBR Green PCR Master Mix(PKT) 10 ul와 P1 primer 1 ul, P2 Primer 1 ul를 주입하고 마지막으로 희석된 sample과 standard solution을 각각 8 ul 씩 주입하여 template의 각 셀에 총 20 ul가 되도록 하였다. 이후 1,500 rpm으로 약 20초간 centrifuge를 시킨 후 qPCR을 진행하였다.
- 각 시료마다 접촉시간을 15분으로 하였고, 접촉시간동안에는 지속적으로 shaking을 시켜주었다. 추가적으로 오존의 경우 높은 반응성과 휘발에 의한 손실이 보정하기 지속적으로 반응조에 오존을 투입하여 오존농도가 유지될 수 있도록 하였다(Fig. 1).
- 흡광도 분석을 위해 인디고 시액을 5 mL 씩 50 mL Conical tube에 각각 넣었다. 흡광도 기기는 DR2010 (HACH)를 이용하여 600 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 한편 3차 증류수만으로 50 mL 되도록 Conical tube를 채운 시료를 blank로 사용하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 Escherichia coli DH5ɑ는 다제 내성 플라스미드 pB10을 포함한 미생물로 본 연구의 항생제 내성 전달 모델 미생물로 선정되었다. pB10은 다제 내성(amoxicillin, streptomycin, sulfamethoxazole, tetracycline) 및 중금속 내성(mercury)플라스미드 이다.
- 절대 정량화를 위하여 검량선(standard curve)을 사용하였다. 이를 위해 pB10 플라스미드를 10배씩 연차적으로 희석시켜 검량 샘플을 준비하였다. 준비된 48개 플라스틱 template에 SYBR Green PCR Master Mix(PKT) 10 ul와 P1 primer 1 ul, P2 Primer 1 ul를 주입하고 마지막으로 희석된 sample과 standard solution을 각각 8 ul 씩 주입하여 template의 각 셀에 총 20 ul가 되도록 하였다.
이론/모형
- 실험 후의 잔류 오존농도를 확인하기 위하여 수용액상의 오존의 농도 측정은 Indigo Method의 방법을 사용하였다(Bader and Higne, 1981). 인디고 표준용액은 0.
- 이에 항생제 내성균, 항생제 내성 유전자를 90 % 제어하는데 필요한 CT (농도 * 접촉시간) 값을 산출하기 위하여 본 실험에서는 continous 상태에서 실험하였고 Chick & Waston equation을 사용하였다 (Table 2).
- 플라스미드 sample을 동일한 농도인 5 ug/ul로 총 부피가 15 ul되도록 희석을 시켰다. 절대 정량화를 위하여 검량선(standard curve)을 사용하였다. 이를 위해 pB10 플라스미드를 10배씩 연차적으로 희석시켜 검량 샘플을 준비하였다.
- 항생제 내성균, 항생제 내성 유전자를 제어하는데 필요한 CT (농도 * 접촉시간) 값을 산출하기 위하여 Chick & Waston equation을 이용하였다.
성능/효과
- 1) 실제 하수처리장에서 적용 가능한 범위의 소독농도에서 항생제 내성균(E.coli DH5ɑ)제거에 대한 염소 및 오존, 전자빔의 소독능을 비교 산정해 본 결과, 전자빔과 오존은 최대 99 %까지의 제거가 가능하였고, 염소소독의 경우 83 %제어가 가능하였다.
- 2) 유해유전전염물질인 pB10 플라스미드에 대한 제거 효율을 소독 간 비교해 본 결과, 항생제 내성균과 마찬가지로 오존과 전자빔이 염소살균에 높은 산화력을 보여주었다. 하지만 내성균의 살균 능력에 비해 내성 유전자의 살균을 위해서는 좀 더 높은 소독 강도가 필요함이 밝혀졌다.
- 3) 항생제 내성균 및 내성유전자의 제거능(1 ∼ 3 log)을 만족하는 CT 값을 염소와 오존으로 비교하면 염소의 CT값이 오존의 CT값에 비해 월등히 높았으며(Table 3), 같은 소독 농도를 사용 시 항생제 내성균 뿐만 아니라 항생제 내성 유전자를 제어 할 수 있는 오존의 소독 공법이 염소에 비해 좋은 효율을 가지고 있다고 판단된다.
- 각각 염소 30 mg/L Cl2 (접촉 시간 15분), 전자빔 0.5 DOSE(선량 10 m/min), 오존 3 mg/LO3 (접촉 시간 15분)의 조건으로 소독하였을 경우, 항생제 내성균(106 ∼ 107 CFU/mL)을 90 % (1 Log)까지 제거할 수 있었다.
- 그에 비해 본 연구에서 구해진 CT 값은 높은데, 이는 본 실험에서 사용된 시료는 항생제 내성을 가지고 있는 균이기 때문이라고 판단된다. 각각의 제거능을 만족하는 CT 값을 염소와 오존으로 비교하면 염소의 CT값이 오존의 CT값에 비해 월등히 높았으며, 항생제 내성 유전자를 제어 하는데 필요한 CT값이 염소의 경우 항생제 내성균의 제어보다 높은 반면 오존은 제거능 결과가 비슷하다. 따라서 같은 소독 Dose를 사용 시 항생제 내성균 뿐만 아니라 항생제 내성 유전자 제어를 할 수 있는 오존의 소독 공법이 염소에 비해 좋은 효율을 가지고 있다고 판단된다.
- 각각의 제거능을 만족하는 CT 값을 염소와 오존으로 비교하면 염소의 CT값이 오존의 CT값에 비해 월등히 높았으며, 항생제 내성 유전자를 제어 하는데 필요한 CT값이 염소의 경우 항생제 내성균의 제어보다 높은 반면 오존은 제거능 결과가 비슷하다. 따라서 같은 소독 Dose를 사용 시 항생제 내성균 뿐만 아니라 항생제 내성 유전자 제어를 할 수 있는 오존의 소독 공법이 염소에 비해 좋은 효율을 가지고 있다고 판단된다.
- 전체적으로 항생제 내성균의 제어 보다 항생제 내성 유전자 제어를 위한 CT 값이 높았다. 이는 앞서 얘기한 바와 같이, 항생제 내성 유전자 및 내성 유전자 전달률 제어를 위해서는 기존의 항생제 내성균에 사용된 소독능 보다 높은 소독능이 필요함을 알 수 있었다. 일반적으로 하수처리장의 박테리아를 2 log 까지 제거하는데 필요한 CT 값은 각각 염소 12 ∼ 20 mg · min/L, 오존 3 ∼ 4 mg · min/L 정도이다(Metcalf & Eddy, 2004).
- 이를 현 하수처리에 사용되는 소독강도(염소 10 ∼ 20 mg/L, 전자빔 1 ∼ 2 DOSE, 오존 7 ∼ 8 mg/L)를 이용하여 비교해 보면, 90 %의 항생제 내성균을 제거하는데 만족하는 소독 기법은 전자빔과 오존임을 알 수 있었다.
- 또한 kinetic 실험을 통하여 구해진 각각의 1 log, 2 log와 3 log 까지의 제거율에 필요한 CT 값을 염소와 오존 공법에 대해 각각 산출하였다(Table 3). 전체적으로 항생제 내성균의 제어 보다 항생제 내성 유전자 제어를 위한 CT 값이 높았다. 이는 앞서 얘기한 바와 같이, 항생제 내성 유전자 및 내성 유전자 전달률 제어를 위해서는 기존의 항생제 내성균에 사용된 소독능 보다 높은 소독능이 필요함을 알 수 있었다.
후속연구
- 허나, 오존과 전자빔과 같은 경우 염소소독에 비해 운영상 비용문제가 부담이 될 수 있다. 따라서, 실제 적용 시에는 대규모 시설보다는 소규모의 운영, 하천 유지 용수나 지하수 충전 같은 공공보건과 관련될 수 있는 부분에 고급산화 기법 설치를 우선 고려해야 할 것으로 판단된다.
- 본 연구의 결론은 이러한 유해유전물질을 제어하는데 있어서는 전통적인 처리 기법인 염소소독 처리만으로는 부족할 수 있으며, 향후 고급산화 기법을 이용한 바이오 형태의 미량오염물질제어가 필요할 것으로 판단된다. 허나, 오존과 전자빔과 같은 경우 염소소독에 비해 운영상 비용문제가 부담이 될 수 있다.
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