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문제 정의
- , 2006)에 대한 생리활성과 영양학적 분석으로는 gallic acid 및 chlorogenic acid, vanillin 등 총 7가지의 phenolic compound가 함유되어 있다는 보고(Yoon et al, 2011)와 vitamin D의 전구체인 ergosterol을 함유하는 것이 보고되어 있다(Kim, 1979). 따라서, 본 연구에서는 다른 버섯 류에 비해 생리활성 및 영양 성분에 대한 연구가 다양하지 않은 것으로 판단되어 국내에서 개발된 잣버섯 품종인 솔향과 곤지 10호의 영양, 생리학적 특성을 비교 분석하였다.
제안 방법
- 농축액을 3차 증류수 200 µl에 용해한 후 syringe filter(JSiscientific, INC. Nylon syringe filter 17 mm, 0.45 µm)로 여과하여 HPLC 분석시료로 사용하였다.
- 여기에 20% Na2CO3 용액 150 µl를 가하여 실온에서 1시간 방치하고 UV spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro, Amersham Diosciences, Sweden)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 가수 분해액을 200 mM의 sodium acetate buffer(pH 5.0)로 희석한 후 원심분리하고 상층액 100 µl을 취하여 exo 1,3-β-glucanase와B-glucosidase를 첨가한 후 glucose determination reagent (Megazyme, Ireland)를 첨가하고, 510 nm에서 흡광도를 측정하여 total glucan과 β-glucan 이외의 당 함량을 분석하였다.
- 즉, β-glucan의 함량은 total glucan과 β-glucan의 당 함량을 구한 후, 두개의 당 함량 차이로 β-glucan을 측정하였다.
- Agilent HPLC와 Agilent Diode Array detector, ChemStation software 를 사용하였으며, column은 Eclipse AAA 3.55u (150x 4.6 mm)를 사용하였고 이동상은 A용매로 40 mM NaH2PO4 용액, B용매는 ACN : MeOH : DW = 4.5: 4.5 : 1 용액을 gradient mode로 흘려주면서 시료 0.5 µl를 주입한 후 UV detector(=338, 262 nm, 40℃)를 사용하여 검출하였다.
- 형광유도체 반응은 AccQ fluor reagent : borate buffer : sample(standard) = 2 : 7 : 1로 total volume이 100 µl가 되게 혼합한 후 55에서 반응시켜서 HPLC 분석 시료로 사용하였다.
- 버섯 자실체를 동결 건조하여 분쇄한 후 건조 시료에 20배의 100% 및 80% 메탄올을 가하여 30에서 24시간 동안 shaking incubator를 이용하여 교반하면서 추출하였다. 이 과정을 한 번 더 진행하여 추출한 상등액을 흡입 여과한 후 감압 농축하여 각각 100% 및 80% 메탄올 추출물을 제조하였다.
- 버섯 자실체를 동결 건조하여 분쇄한 후 건조 시료에 20배의 100% 및 80% 메탄올을 가하여 30에서 24시간 동안 shaking incubator를 이용하여 교반하면서 추출하였다. 이 과정을 한 번 더 진행하여 추출한 상등액을 흡입 여과한 후 감압 농축하여 각각 100% 및 80% 메탄올 추출물을 제조하였다. 또한, 열수추출물 제조를 위하여 건조 시료 20배의 3차 증류수를 가하여 100℃에서 3시간 동안 추출하였다.
- α-1,4 및 α-1,6 글루코시드결합을 분해하는 효소인 α-amyloglucosidase(Sigma, USA)를 사용하여 버섯 추출물이 이 효소의 활성을 저해함으로써 단당류의 소화흡수를 저해하는 정도를 측정, 간접적인 항당뇨 활성을 측정하였다.
- 염증반응은 내독소인 LPS (Lipopolysaccaride, Sigma Chemical Co, ST. Louis, MO, USA)와 IFN-γ (interferon gamma, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 Raw 264.7 cell에 처리하고 버섯추출물을 첨가하여 생성되는 염증 유발물질인 nitric oxide(NO)량을 Griess 시약으로 측정하였다.
- 또한, 열수추출물 제조를 위하여 건조 시료 20배의 3차 증류수를 가하여 100℃에서 3시간 동안 추출하였다. 이 과정을 반복하여 최종적으로 나온 추출액을 흡입 여과 한 후 여과액을 동결 건조하여 분석 실험에 사용하였다. 기존의 열수추출 방식으로 추출한 상등액에 에탄올을 가하여 70% 에탄올 용액이 되게 한 후 침전된 다당체를 제거하고 여과액을 동결 건조한 후 분석 실험에 사용하였다.
- DPPH radical 소거능 활성은 Blois의 방법(Blois, 1958)을 변형시켜 99.9% methanol에 녹인 0.1 mM DPPH 1.17 ml에 버섯시료 100% 메탄올 추출물을 농도별로 0.03 ml씩 넣고 10초간 잘 혼합한 후 빛을 차단한 상태에서 30분간 상온에서 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 ascorbic acid(0.
- 4 ml와 혼합하였다. 이 혼합액을 상온에서 15분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염을 측정한 후 소거율을 계산하였다. 대조군은 Griess 시약 대신 동량의 증류수를 가하여 측정하였으며 positive control은 ascorbic acid(1 mg/ml)를 사용하였다.
- α-amyloglucosidase는 α-1,4 및 α-1,6 glucoside 결합을 가수분해하는 효소로 이 효소의 억제율을 측정함으로써 간접적으로 항당뇨 효과를 확인하였고, 그 결과는 Fig. 4와 같다.
- 45 µm)로 여과하여 HPLC 분석시료로 사용하였다. HPLC는 Agilent 1200 HPLC pump, Agilent 1260 auto-sampler, Agilent 1260 Differential Refractometer detector, ChemStation software를 사용하였으며, 분석 column은 Grace Prevail carbohydrate ES 5u (250x4.6 mm)를 사용하였고 이 동상은 75% Acetonitrile 용액을 is℃ratic mode로 흘려주었다. Injection volumn은 10 µl를 주입하였고, RI detector(30℃)를 사용하여 검출하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 버섯은 경기도 농업기술원 버섯 연구소에서 제공받은 잣버섯인 솔향과 곤지 10호 품종을 사용하였다.
- Mouse macrophage cell line인 Raw 264.7를 한국 세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였고 배지는 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, WelGENE Inc, Daegu, Korea)에 10% FBS (fetal bovine serum, HyClone, South Logan, UT, USA), 1% penicillin- streptomycin(BioWhittaker. Inc: 10,000 U/pen/mL, 10,000 µg strep/mL, Lancaster, MA, USA)을 첨가하여 사용하였다.
- 이 과정을 반복하여 최종적으로 나온 추출액을 흡입 여과 한 후 여과액을 동결 건조하여 분석 실험에 사용하였다. 기존의 열수추출 방식으로 추출한 상등액에 에탄올을 가하여 70% 에탄올 용액이 되게 한 후 침전된 다당체를 제거하고 여과액을 동결 건조한 후 분석 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 값은 평균치±표준편차로 표시하였고, 집단 간 평균의 차이는 SPSS 19.0 for windows 프로그램을 이용하여 two-tailed unpaired Student's t-test 및 one-way analysis of variance(ANOVA) test를 이용하였다.
- 각 실험의 평균차에 대한 통계적 유의성 검증은 Ducan의 다중검증법(DMRT : Duncan's multiple rangetest)을 통해 하였으며, p <0.05 및 p <0.01 수준에서 검증하였다.
- Data were analyzed by one-way ANOVA using SPSS(Duncan’s multiple range test).
- Data were analyzed by one-way ANOVA using SPSS (Duncan’s multiple range test).
- Data were analyzed by one-way ANOVA using SPSS(Duncan°Øs multiple range test).
이론/모형
- Total polyphenol 함량은 Folin-Denis colorimetric method 방법(Swain et al., 1959)에 따라 측정하였다. 즉, 추출시료 15 µl에 증류수 1.
- α-amylase inhibitory activity 측정은 Sidney의 방법(Sidney et al., 1995)을 사용하였다.
- 잣버섯 추출물의 nitrite scavenging activity는 Gray와 Dugan의 방법(Gray and Dugan, 1975)에 따라 시료 1 ml에 1 mM NaNO2 용액 1 ml을 가한 뒤 0.1 NHCl로 pH 1.2가 되게 조절한 후 총량이 10 ml가 되도록 조절하였다. 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 반응액 1 ml을 취해 2% acetic acid 5 ml 및 30% acetic acid로 제조한 Griess 시약(1% sulfanilic acid :1% naphtylamine = 1:1 혼합액) 0.
- 2 M acetate를 첨가하여 중화시켰다. 그리고 DNS(3,5-dinitrosalicylicacid) 환원당 정량법에 의하여 동량의 DNS를 넣고 90℃에서 10분간 가열하고 실온으로 냉각 후 증류수 1 ml를 가해 575 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 반응 후 생성되는 유리 glucose양을 측정하여 -amyloglucosidase의 저해활성을 측정하였으며 positive control은 acarbose(10 mg/ml)를 사용하였다.
성능/효과
- 잣버섯 2품종의 β-glucan 을 분석한 결과 Fig. 1과 같이, 솔향의 경우 32.18±1.16%로 높은 함량을 보였고, 그 다음으로 곤지 10호가 24.08±0.45%가 가장 낮은 함량을 나타내었다.
- 총 아미노산 함량은 솔향이 건물 100 g당 685.57±13.16 mg으로 가장 높았으며, 곤지 10호가 369.35±97.53 mg으로 낮은 것으로 나타났다.
- 85% 에탄올로 추출한 자실체 추출물을 이용하여 버섯의 단맛을 결정하는 유리당 및 당 알코올의 종류 및 그 함량을 분석한 결과는 Table 1과 같다. 즉, 잣버섯에 함유된 유리당과 당알코올은 각각 2종류로서 fructose, mannitol, arabitol, trehaolse임을 확인하였다. 그 중 가장 많은 양을 함유한 trehalose는 건물 g 당 곤지 10호 44.
- 222 g을 포함하는 것에 비해(김태호 등, 2012) 잣버섯의 경우 낮은 함량을 가지는 것을 알 수 있었다. 아미노산 중 glutamic acid 및 aspartic acid 등이 모든 잣버섯에서 높은 함량을 나타냈으며, 또한 필수아미노산인 valine 및 leucine, isoleucine, threonine, lysine, phenylalanine 등이 다량 함유되어 있는 것으로 나타났다. 그러나 신경전달물질인 GABA는 검출되지 않았다.
- 솔향 열수추출물(11.88±0.82 mg GAE/g DW), 솔향 열수 추출물 에탄올 침지 상등액(11.53±0.65 mg GAE/g DW), 곤지 10호 메탄올 추출물(10.640.89 mg GAE/g DW), 곤지 10호 열수 추출물 에탄올 침지 상등액 (8.430.25 mg GAE/g DW), 솔향 메탄올 추출물(6.920.38 mg GAE/g DW) 순으로 낮은 함량을 보였다.
- Total polyphenol 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같다. 메탄올과 열수 추출물의 total polyphenol 함량을 두 품종 간 비교한 결과 곤지 10호 열수추출물이 15.020.50 mg gallic acid equivalent/g dry weight(mg GAE/g DW)로 가장 높은 함량을 보였다. 솔향 열수추출물(11.
- 38 mg GAE/g DW) 순으로 낮은 함량을 보였다. 이와 같은 결과로 곤지 10호의 total polyphenol 함량이 솔향보다 유의적으로 높은 것을 알 수 있었으며 또한, 열수추출물의 경우 메탄올 추출물에 비해 높은 total polyphenol 함량을 나타냈다. 일반적으로 polyphenol은 유기용매에 잘 용해된다고 알려져 있는데 열수 추출물의 수율이 메탄올 추출물보다 2배 가량 높아 메탄올 추출물보다 더 높은 total polyphenol 함량을 가지는 것으로 사료된다.
- 2과 같다. 곤지 10호와 솔향의 품종간의 항산화 활성에 대한 유의적인 큰 차이는 나타나지 않았으나, 100 mg/ml의 농도와 50 mg/ml의 농도에서 두 품종 모두 80%를 넘는 높은 항산화 활성을 보였다. 이는 선행 연구 결과의 2 mg/ml의 농도에서 메탄올 추출물이 75.
- 두 품종 모두 80% 메탄올 추출물이 가장 높은 nitrite 소거능을 나타내었으며, 100 mg/ml의 농도에서 유의 적으로 곤지 10호가 119.14±5.43%로 솔향의 93.52±6.48%보다 더 높은 활성을 나타내었다.
- 100% 및 80% 메탄올 추출물의 경우 항당뇨 효과를 확인할 수 없었으며 최종적으로 효과가 있는 열수추출물의 경우 10 mg/ml의 농도에서 positive control로 쓰인 acarbose(10 mg/ml)의 54.57±4.16%의 활성보다는 낮지만 열수추출물이 에탄올을 첨가하여 다당체를 침전시킨 열수 추출물보다 유의적으로 두 품종 모두 높은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 곤지 10호 열수 추출물이 52.12±8.16%, 열수추출물을 에탄올로 침지시킨 상등액의 경우의 60.62±5.95%의 저해 활성을 나타내었다.
- 대표적으로 항암 활성을 가진다고 알려진 물질인 β-glucan의 경우 솔향이 곤지 10호보다 높은 수치를 나타내지만 품종 간의 유의차는 없는 것으로 나타났으며, 항산화 성분인 total polyphenol 함량은 곤지 10호의 열수추출물이 15.02±0.50 mg GAE/g DW으로 가장 높은 것을 확인하였다.
- 잣버섯 품종인 솔향과 개량 신품종 곤지 10호를 비교 분석한 결과 영양 성분 분석의 경우 유리당과 당 알코올의 경우 총 4종류의 성분이 검출되었고, 그 중 trehalose의 경우 건물 g당 곤지 10호 44.11±0.99 mg, 솔향 38.89±1.31 mg로 검출된 당 중에서 가장 높은 함유량을 나타냈으며, 곤지 10호가 솔향에 비해 유의적으로 높은 수치를 나타내었다.
- 곤지 10호 추출물 중 positive control로 쓰인 dexamethasone과 비교하였을 때 100%, 80%메탄올 추출물 100 µg/ml의 농도에서 유의적으로 더 낮은 nitric oxide 함량을 나타내 잣버섯의 항염 활성을 확인할 수 있었다.
- LPS와 IFN-γ 와 함께 시료를 처리한 결과 솔향보다 곤지 10호 추출물이 유의적으로 더 낮은 nitric oxide가 분비되어 높은 항염 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- LPS와 IFN-γ 와 함께 시료를 처리한 결과 솔향보다 곤지 10호 추출물이 유의적으로 더 낮은 nitric oxide가 분비되어 높은 항염 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 메탄올 추출물이 열수 추출물보다 더 높은 항염 활성을 나타내었다. 곤지 10호 추출물 중 positive control로 쓰인 dexamethasone과 비교하였을 때 100%, 80%메탄올 추출물 100 µg/ml의 농도에서 유의적으로 더 낮은 nitric oxide 함량을 나타내 잣버섯의 항염 활성을 확인할 수 있었다.
- 31 mg로 검출된 당 중에서 가장 높은 함유량을 나타냈으며, 곤지 10호가 솔향에 비해 유의적으로 높은 수치를 나타내었다. 아미노산은 총 24종 중 17종이 검출 되었고 유리당과는 반대로 솔향의 총 아미노산 함량이 곤지 10호보다 유의적으로 높았다. 대표적으로 항암 활성을 가진다고 알려진 물질인 β-glucan의 경우 솔향이 곤지 10호보다 높은 수치를 나타내지만 품종 간의 유의차는 없는 것으로 나타났으며, 항산화 성분인 total polyphenol 함량은 곤지 10호의 열수추출물이 15.
- 자실체의 생리 활성 분석으로는 항산화 실험인 DPPH radical 소거능 실험에서는 두 품종 모두 농도별에 따른 차이는 있지만 품종 간의 유의차는 없었다. 항암 활성을 알아보기 위하여 nitrite 소거능을 실시하였으며 두 품종 모두 메탄올 추출물에서 10 mg/ml 에서까지 대부분 40% 이상의 nitrite를 소거하여 발암물질인 nitrosoamine을 없애 항암 효과가 있는 것으로 나타났다. 항당뇨 실험으로 α-amyloglucosidase 및 α-amylase 저해 활성을 실험한 결과, 이 모두 솔향 열수 추출물이 positive control로 쓰인 acarbose와 같은 농도이거나 더 높은 농도에서 비슷한 저해 활성을 나타내는 것을 알 수 있었으며 이는 곤지 10호보다 유의적으로 활성이 우수하였다.
- 항당뇨 실험으로 α-amyloglucosidase 및 α-amylase 저해 활성을 실험한 결과, 이 모두 솔향 열수 추출물이 positive control로 쓰인 acarbose와 같은 농도이거나 더 높은 농도에서 비슷한 저해 활성을 나타내는 것을 알 수 있었으며 이는 곤지 10호보다 유의적으로 활성이 우수하였다.
- 항당뇨 실험으로 α-amyloglucosidase 및 α-amylase 저해 활성을 실험한 결과, 이 모두 솔향 열수 추출물이 positive control로 쓰인 acarbose와 같은 농도이거나 더 높은 농도에서 비슷한 저해 활성을 나타내는 것을 알 수 있었으며 이는 곤지 10호보다 유의적으로 활성이 우수하였다. 또한, 마우스 유래 RAW264.7 cell line을 이용하여 항염 활성을 확인한 결과 nitric oxide의 저해능은 열수 추출물보다 메탄올 추출물이 더 효과가 있는 것을 확인하였으며 곤지 10호 메탄올 추출물이 솔향 메탄올 추출물보다 효과가 좋은 것을 확인할 수 있었다.
- α-amylase 저해 활성에 따른 항당뇨 활성을 확인한 결과 Fig. 5과 같이 잣버섯 추출물은 50 mg/ml의 농도에서 솔향 열수추출물을 에탄올로 침지시킨 상등액의 경우 95.80±5.47%의 높은 저해활성을 나타내었고, 솔향 열수 추출물이 92.05±3.32%의 저해 활성으로 그 다음으로 높은 활성을 나타내었다.
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