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문제 정의
- 또한 본 연구에서는 독성이 없으면서 순도변화가 적은 누에실샘 미세분말을 포함하는 기능성 색조용 파우더를 개발하여 피부 보습성 및 피부 탄력성를 확인하여 소비자에게 사용 가능한 화장품 소재로서의 개발 가능성을 확인하고자 하였다.
- 배양기에서 계대배양하여 실험에 사용하였다. 본 실험에 사용된 누에실샘 미세분말이 HEKn의 독성을 나타내는지 알아보기 위해서 MTT assay 실험을 수행하였다. 96 well plate에 1 × 104 cells/well 의 농도로 분주하였으며, 24시간 동안 배양한 후 농도별로(0, 0.
- 본 연구에서는 익은누에를 동결건조하여 실샘을 분리하여 미세분말로 가공한 후에 이를 포함한 기능성 색조용 파우더 화장품의 특성을 조사하고, 항산화 활성, 세포독성, 피부 보습성 및 피부 탄력성을 평가하였다.
가설 설정
- 특히 누에 실샘 미세분말의 아미노산 중 보습인자인 serine과 aspartic acid는 누에분말보다 전체 아미노산 중 높은 조성 비율로 함유하고 있고, OH기를 지닌 serine, threonine 같은 아미노산을 함유하고 있기 때문에 보습효과가 뛰어난 화장품 소재로서 유효할 것으로 사료된다. 또한 단백질 분자량을 저하시키면 단백질 크기도 작아지면서 표면적이 증가하게 되어 보다 많은 친수성 아미노산이 표면에 위치할 가능성이 높으며, 소수성 아미노산은 저분자화로 인하여 표면으로 노출될 가능성이 높을 것이다. 아미노산 중에 항산화능이 우수한 아미노산은 cystine, histidine, lysine, tryptophan, tyrosine 등이 존재하는데 (Manosroi et al.
제안 방법
- 시험대상은 정상피부, 지성피부, 건성피부를 갖는 20~50대 성인 여성 총 30명을 대상으로 하였다. 1일 1회씩 총 3주간 안면 좌측은 누에실샘 미세분말을 포함하는 시험제형을 바르고 안면우측은 비교제형으로 하는 대조군을 화장하여 시험 종료에 색조용 파우더에 대한 피부보습력을 확인하였다. 피부보습력은 피부수분량 측정기(Corneometer) 를 이용하여 실험자의 피부보습력을 측정하였으며, 평가 기준은 개선없음(0 = 0), 약간향상(+ = 1), 다소향상(++ = 2), 명확하게 향상(+++ = 3), 매우 명확하게 향상(++++ = 4)으로 평가하였다.
- 시험대상은 정상피부, 지성피부, 건성피부를 갖는 20~50대 성인 여성 총 30명을 대상으로 하였다. 1일 1회씩 총 3주간 안면 좌측은 누에실샘 미세분말을 포함하는 시험제형을 바르고 안면우측은 비교제형으로 하는 대조군을 화장하여 시험 종료에 색조용 파우더에 대한 피부탄력도를 확인 하여 3주전 후의 차이를 계산하였다. 피부 탄력도는 피부진단 시스템기(Etude System)를 확인하였다.
- 96 well plate에 1 × 104 cells/well 의 농도로 분주하였으며, 24시간 동안 배양한 후 농도별로(0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 ㎍/㎖) 누에실샘 미세분말을 처리하여 24, 48, 그리고 72시간 동안 배양하였다.
- 각 실험 시간동안 배양한 후 MTT (5 ㎎/㎖) 용액을 각 well에 첨가하여 3시간 동안 반응시켰다. MTT 용액을 제거하고 각 well에 DMSO를 넣고 formazan을 용해한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 control 값에 대한 비율로 나타내었다.
- 2 mM DPPH 용액 1 ㎖에 에탄올 1 ㎖를 첨가하고 누에실샘 미세분말1 ㎖ 을 첨가하여 섞은 다음 25℃에서 30분 동안 반응시킨 후 원심분리시켜 상등액을 취하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군으로 하여 다음식에 의해 DPPH의 활성 저해율을 나타내었다. 한편 누에실샘 미세분말 자체 흡광도를 고려하여 517 ㎚ 에서의 누에실샘 미세분말 흡광도를 측정하여 그 값을 보정해주었다.
- 누에실샘 미세분말을 0.01 N NaOH 10 ㎖로 4시간 동안 처리한 후 0.1 N HCl 10 ㎖을 가하여 전체가 20 ㎖이 되게 하였다. 이 용액을 membrane filter(acrodic 0.
- 누에실샘 미세분말을 포함하는 색조용 파우더 시험제형 (experimental cosmetics)과 비교제형(control cosmetics)의 입자 안정성을 측정하기 위하여 광학현미경을 이용하여 입자를 관찰하였고 입자 크기를 측정하기 위하여 실온에서 3개월 보관한 화장품을 15배 희석하여 입자측정기 (Particle size analyzer)를 이용하여 30회 반복하여 각각의 분산 입자크기를 측정하고 평균값을 나타내었다.
- 누에실샘 미세분말의 항산화 활성은 DPPH 라디칼의 소거능으로 확인하였다. 메탄올에 용해시킨 0.
- 색조용 파우더는 전체중량 대비 10 wt%의 누에실샘 미세분말을 포함하고 나머지 성분으로 경질 마그네슘카보네이트(light magnesium carbonate), 카올린(kaolin), 방부제(preservative), 향료(perfume) 및 탤크(talc)를 넣어 총 100 g 의 누에실샘 미세분말을 포함하는 색조용 파우더 시험제형(experimental cosmetics)을 제조하였고, 비교제형(control cosmetics)은 누에실샘 미세분말을 제외하고 나머지 성분을 첨가하여 제조하였다(Table 1).
- 5 ㎛)로여과하여 아미노산 분석 시료로 사용하였다. 아미노산 조성분석은 자동아미노산분석기(Pharmacia Biotech. Biochrom 20 Plus, USA)를 이용하여 18종 아미노산 표준 시료(SigmaAldrich)에 대한 유리 아미노산 조성을 분석하였다.
- (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 측정 기기로는 원심식초미세분쇄기(HKP-5, Korea Energy Technology Co., Korea), 자동아미노산분석기(Pharmacia Biotech. Biochrom 20 Plus, USA), ELISA reader (Molecular Device Corp., VERSAmax, Sunnyvale, CA, USA), 피부 수분량 측정기(corneometer CM 825, CourageKhazaka Electronic, Cologne, Germany), 입자측정기 (Particle size analyzer) (Mastersizer S MAM 5004, Malvern Instruments, Worcestershire, UK) 등을 사용하였다.
- 1일 1회씩 총 3주간 안면 좌측은 누에실샘 미세분말을 포함하는 시험제형을 바르고 안면우측은 비교제형으로 하는 대조군을 화장하여 시험 종료에 색조용 파우더에 대한 피부보습력을 확인하였다. 피부보습력은 피부수분량 측정기(Corneometer) 를 이용하여 실험자의 피부보습력을 측정하였으며, 평가 기준은 개선없음(0 = 0), 약간향상(+ = 1), 다소향상(++ = 2), 명확하게 향상(+++ = 3), 매우 명확하게 향상(++++ = 4)으로 평가하였다. 실험은 실내온도 24.
- 그 활성 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군으로 하여 다음식에 의해 DPPH의 활성 저해율을 나타내었다. 한편 누에실샘 미세분말 자체 흡광도를 고려하여 517 ㎚ 에서의 누에실샘 미세분말 흡광도를 측정하여 그 값을 보정해주었다. 기존 항산화제와 비교를 위하여 15% 비타민 C 를 이용하였다.
대상 데이터
- 기원전 3,000년경부터 인간은 누에를 기르기 시작하였으며 누에에서 합성되는 누에고치는 직물의 재료로 사용하였다. 이러한 직물은 매우 귀한 물건으로 분류되어 일부 귀족과 왕족들만 이용하였다.
- 한편 누에실샘 미세분말 자체 흡광도를 고려하여 517 ㎚ 에서의 누에실샘 미세분말 흡광도를 측정하여 그 값을 보정해주었다. 기존 항산화제와 비교를 위하여 15% 비타민 C 를 이용하였다.
- 본 실험에서 사용한 Human epidermal keratinocyteneonatal (HEKn)는 1% Human keratinocyte growth supplement (HKGs)와 1% penicillin/streptomycin을 포함하고 있는 Epilife 배지로 37℃, 5% CO2 배양기에서 계대배양하여 실험에 사용하였다. 본 실험에 사용된 누에실샘 미세분말이 HEKn의 독성을 나타내는지 알아보기 위해서 MTT assay 실험을 수행하였다.
- 본 연구에 사용된 시약은 3-(4,5-dimethyl-thiazol)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO), 아미노산 표준시료(18종)는 Sigma-Aldrich co. (St.Louis, MO, USA)로부터, Human epidermal keratinocyteneonatal (HEKn), Human keratinocyte growth supplement (HKGs), Epilife medium, penicillin-streptomycin, trypsin/ EDTA, Phosphate buffered saline (PBS)는 Invitrogen Co. (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 측정 기기로는 원심식초미세분쇄기(HKP-5, Korea Energy Technology Co.
- 본 연구에서 사용한 누에(금옥잠)는 농촌진흥청에서 사육하여 동결건조한 후에, 실샘을 분리하였다. 분리한 실 샘을 원심식초미세분쇄기에 투여하여 미세분말로 가공하여 600~1,000 mesh(10~20 ㎛)의 입도를 갖는 누에실샘 미세분말로 제조하여 실험재료로 사용하였다.
- 본 연구에서 사용한 누에(금옥잠)는 농촌진흥청에서 사육하여 동결건조한 후에, 실샘을 분리하였다. 분리한 실 샘을 원심식초미세분쇄기에 투여하여 미세분말로 가공하여 600~1,000 mesh(10~20 ㎛)의 입도를 갖는 누에실샘 미세분말로 제조하여 실험재료로 사용하였다.
- 시험대상은 정상피부, 지성피부, 건성피부를 갖는 20~50대 성인 여성 총 30명을 대상으로 하였다. 1일 1회씩 총 3주간 안면 좌측은 누에실샘 미세분말을 포함하는 시험제형을 바르고 안면우측은 비교제형으로 하는 대조군을 화장하여 시험 종료에 색조용 파우더에 대한 피부보습력을 확인하였다.
데이터처리
- 본 연구의 실험 결과들은 3회 반복하였고, 모든 자료의 통계분석은 SPSS 18.0을 사용하여 실시하였다. 이 때 분산분석은 ANOVA test로, 각 시험구간의 평균 차이에 대한 유의성 검정은 Duncan multiple range test를 이용하여 p < 0.
- 이 때 분산분석은 ANOVA test로, 각 시험구간의 평균 차이에 대한 유의성 검정은 Duncan multiple range test를 이용하여 p < 0.05 수준일 때 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다.
성능/효과
- 시간별, 농도별 의존적으로 세포 생존율의 감소를 나타냈다. 24시간 후 1000 ㎍/㎖에서 3.43% 감소하였고, 72시간 후에서는 500 ㎍/㎖에서 5.71% 유의적으로 세포 생존율이 감소되었다. 하지만 누에실샘 미세분말 농도가 시간별, 농도별 증가하여도 IC50 이하의 값을 나타내므로 누에실샘 미세분말이 피부 세포에 강한 독성이 없음을 확인하였다.
- 본 연구에서는 에탄올과 같은 용매를 사용하지 않아 피부에 유해하지 않으면서 피부 수분 함량에 있어 보다 높은 증가를 보여주었다. 결과 적으로 시험제형이 비교제형에 비해 수치적으로 40이 더 많아서 피부 보습력이 210% 향상됨을 알 수 있었다.
- 그러나 세리신을 pH 8~10의 염기성 완충 수용액에서 반응시켜 PEG-세리신 결합체를 제조한 후 유기용매 내에서 투석에 의해 입자를 제조하여 에탄올, 메탄올, 디메틸포름아미드, 테트라히드로푸란 등의 유기용매에 용해시키므로 인체에 유해할 가능성이 높게 존재하는데, 본 연구에서는 유해 용매를 사용하지 않고 실험대상 화장품이 비교대상 화장품에 비해 그 차이가 182의 수치적 차이가 나타났으므로, 피부 탄력성이 185% 향상됨을 알 수 있었다 (Fig. 4).
- 누에고치 분말에서는 glycine (38.10%) > alanine(27.50%) > serine(17.8%) 등의 순으로 조성되어 있으며, 누에실샘 미세분말에서는 serine(26.77%)> asparatic acid(15.47%) > glycine(9.62%) 등의 순으로 아미노산 조성을 확인하여 누에실샘 미세분말에서는 보습효과가 우수한 아미노산인 serine, aspartic acid 조성이 상위 조성 비율을 나타내어 보습효과가 탁월할 것으로 사료된다.
- 누에실샘 미세분말과 누에분말의 아미노산 분석 결과 보습인자인 serine (26.77%)의 조성이 전체 아미노산 조성 비율에서 상위의 조성을 나타내었지만 누에실샘 미세분말이 누에분말보다 150% 이상 함유하고 있어 보습효과가 우수할 것으로 사료된다. 누에실샘 미세분말을 함유한 시험제형이 함유하지 않은 비교제형보다 입자 크기가 작음을 확인하였고, 이는 화장품의 분산도 향상 및 효율을 향상시켜 기초화장 후 고르게 발라지고 특히 색조발색에 영향을 주지 않아 화사한 피부색을 표현할 수 있을 것으로 사료된다.
- 아미노산 중에 항산화능이 우수한 아미노산은 cystine, histidine, lysine, tryptophan, tyrosine 등이 존재하는데, 그중 세리신의 아미노산 조성에서 histidine과 lysine은 친수성 아미노산으로 단백질 표면에 존재하며, tryptophan과 tyrosine은 소수성 아미노산이지만 변성에 의해 표면으로 노출되어 더 우수한 항산화능을 나타내는 것으로 사료된다. 누에실샘 미세분말을 함유한 시험제형과 함유하지 않은 비교제형의 보습성 및 탄력성을 확인한 결과, 비교제형보다 피부 보습력과 탄력성은 각각 210%와 185% 증가한 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 누에실샘 미세분말을 함유한 화장품은 피부에 매우 우수한 보습 및 탄력 증가에 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 77%)의 조성이 전체 아미노산 조성 비율에서 상위의 조성을 나타내었지만 누에실샘 미세분말이 누에분말보다 150% 이상 함유하고 있어 보습효과가 우수할 것으로 사료된다. 누에실샘 미세분말을 함유한 시험제형이 함유하지 않은 비교제형보다 입자 크기가 작음을 확인하였고, 이는 화장품의 분산도 향상 및 효율을 향상시켜 기초화장 후 고르게 발라지고 특히 색조발색에 영향을 주지 않아 화사한 피부색을 표현할 수 있을 것으로 사료된다.
- 1에 나타내었다. 누에실샘 미세분말의 free radical 소거활성은 비타민 C(97%) 보다 낮은 활성을 보였지만 82.3%로 높은 수준의 항산화 활성을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다.
- 누에실샘 미세분말의 함량이 5 중량%일 경우 피부 보습성 및 탄력성이 낮게 나타나고, 20 중량%를 초과하는 경우에는 색조 파우더용 화장품 제조시 사용되는 통상의 재료들과 혼합이 잘 이루어지지 못해 파우더로 사용하기에 부적합한 사태의 제품으로 생산된다. 또한 항산화 물질인 비타민 C보다 낮은 DPPH 라디컬 소거활성을 나타 냈지만 우수한 항산화 활성을 지닌 것으로 확인하였다. 이는 단백질의 분자량을 저하시키면 단백질 크기도 작아지면서 표면적이 증가하게 되어 보다 많은 친수성 아미노산이 표면에 위치할 가능성이 생기며 소수성 아미노산은 저분자화로 인하여 표면으로 노출될 가능성이 높을 것으로 생각된다.
- 3에 나타냈다. 본 연구에서는 에탄올과 같은 용매를 사용하지 않아 피부에 유해하지 않으면서 피부 수분 함량에 있어 보다 높은 증가를 보여주었다. 결과 적으로 시험제형이 비교제형에 비해 수치적으로 40이 더 많아서 피부 보습력이 210% 향상됨을 알 수 있었다.
- 본 연구의 시험제형의 입자크기가 비교제형보다 작은 크기임을 확인할 수 있으므로(Table 3), 피부에 자극없이 고르게 펴 바를 수 있음을 알 수 있었다. 누에실샘 미세 분말의 입자크기는 기초화장 후 덧바르는 색조의 발색효과에 영향을 주지 않으면서 추가되는 다른 재료들과 잘 융합되도록 하기 위해서는 입자 크기가 10 ~ 20 ㎛ 정도의 미세분말로 가공된 것이 좋다고 사료된다.
- 누에실샘 미세분말을 함유한 시험제형과 함유하지 않은 비교제형의 보습성 및 탄력성을 확인한 결과, 비교제형보다 피부 보습력과 탄력성은 각각 210%와 185% 증가한 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 누에실샘 미세분말을 함유한 화장품은 피부에 매우 우수한 보습 및 탄력 증가에 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 71% 유의적으로 세포 생존율이 감소되었다. 하지만 누에실샘 미세분말 농도가 시간별, 농도별 증가하여도 IC50 이하의 값을 나타내므로 누에실샘 미세분말이 피부 세포에 강한 독성이 없음을 확인하였다.
후속연구
- 이와 같은 결과들은 기존의 제조방법과 달리 유해한 용매를 사용하지 않으며, 고온 고압의 공정을 사용하지 않고 제조한 누에실샘 미세분말을 함유한 화장품은 피부 세포에 비교적 안정하며, 피부에 항산화, 보습 및 탄력 효과 등을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 미백과 주름개선 등에 대한 효과를 발휘할 수 있도록 보완 연구가 이루어진다면 누에실샘을 기능성 화장품의 소재로서 활용될수 있는 가능성이 높을 것으로 생각된다.
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