[논문]피브로인 H-chain 재조합 단백질 발현시스템을 이용한 녹색형광실크 생산

김성완; 윤은영; 최광호; 김성렬; 박승원; 강석우; 구태원

doi:10.7852/jses.2013.51.2.153

[국내논문] 피브로인 H-chain 재조합 단백질 발현시스템을 이용한 녹색형광실크 생산
Production of fluorescent green silk using fibroin H-chain expression system 원문보기

한국잠사곤충학회지 = Journal of sericultural and entomological science, v.51 no.2, 2013년, pp.153 - 158

김성완 (농촌진흥청 국립농업과학원) , 윤은영 (농촌진흥청 국립농업과학원) , 최광호 (농촌진흥청 국립농업과학원) , 김성렬 (농촌진흥청 국립농업과학원) , 박승원 (대구가톨릭대학교) , 강석우 (농촌진흥청 국립농업과학원) , 구태원 (농촌진흥청 국립농업과학원)

초록
AI-Helper

본 연구의 목적은 누에형질전환 기술을 이용하여 녹색형광실크를 개발하는 것으로서, 본 실험에서는 피브로인 H-chain의 N-말단과 C-말단을 이용하여 피브로인 재조합 단백질 발현 시스템을 제작하였고, 종결코돈이 없는 EGFP 유전자를 위의 발현 시스템에 클로닝하여 녹색형광실크를 제작하였다. 누에형질전환체 선발을 위해서는 3xP3 promoter와 DsRed2를 이용하여 선발하였고, 1200 개의 누에알에 microinjection 하여 F1 세대에서 8 bloods의 형질전환체를 선발하였다. 선발된 누에형질전환체는 초기배 단계의 눈과 신경조직, 유충과 번데기 그리고 성충의 눈에서 DsRed2 형광단백질이 발현되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 실크의 피브로인에서 EGFP 단백질이 발현되는 것을 확인하기 위해, F2세대의 누에형질전환체 중에서 5령 3일 유충을 해부하여 견사선을 형광현미경으로 관찰하였고, 중부와 후부 견사선에서 형광단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 F2 세대의 고치와 저온에서 정련한 실크에서도 녹색형광단백질의 발현을 확인할 수 있었고, Western blot 분석에서도 EGFP 재조합 단백질이 피브로인 H-chain과 융합된 형태로 존재하는 것이 확인되었다. 이상의 결과에서 녹색형광실크를 생산하는 누에형질전환체가 성공적으로 제작 되었음을 확인할 수 있었고 이러한 결과를 토대로 새로운 산업소재로서 실크를 활용할 수 있을 것으로 기대한다.

Abstract ▼ AI-Helper

To express green fluorescent protein in the cocoon of silkworm, we constructed the fibroin H-chain expression system to produce enhanced green fluorescent protein (EGFP) in the cocoon of transgenic silkworms. The EGFP fusion protein, each with N- and C-terminal sequences of the fibroin H-chain, was designed to be secreted into the lumen of the posterior silk glands. The expression of the EGFP/H-chain fusion gene was regulated by the fibroin H-chain promoter. The use of the 3xP3-driven DsRed2 cDNA as a marker allowed us to rapidly distinguish transgenic silkworm. A mixture of the donor and helper vector was micro-injected into 1,200 eggs of bivoltin silkworms, Baegokjam. We obtained 8 broods. The cocoon displayed strong green fluorescence, proving that the fusion protein was present in the cocoon. Also, the presence of fusion proteins in cocoons was demonstrated by SDS-PAGE and immunoblotting. Accordingly, we suggest that the EGFP fluorescence silk will enable the production of the novel biomaterial based on the transgenic silk.

Keyword

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

그러나 값이 비싸고 내구성이 좋지 못하여 관리가 어렵고, 구김이 잘 생기는 등 실용적 특성이 부족하여 실크를 대중화, 일반화하지 못하고 있다. 따라서 실크를 다양한 산업분야에 적용하기 위한 소재로 개발하기 위해 본 실험에서는 피브로인 H-chain 재조합 단백질 발현 시스템을 이용하여 녹색형광실크를 제작하였다.
본 연구의 목적은 누에형질전환 기술을 이용하여 녹색 형광실크를 개발하는 것으로서, 본 실험에서는 피브로인 H-chain의 N-말단과 C-말단을 이용하여 피브로인 재조합 단백질 발현 시스템을 제작하였고, 종결코돈이 없는 EGFP 유전자를 위의 발현 시스템에 클로닝하여 녹색형광실크를 제작하였다. 누에형질전환체 선발을 위해서는 3xP3 promoter와 DsRed2를 이용하여 선발하였고, 1200 개의 누에알에 microinjection 하여 F1 세대에서 8 bloods의 형질전환체를 선발하였다.

가설 설정

Fluorescence expression of DsRed2 in transgenic silkworms. A) Eggs were expressed in the eyes and the abdominal nervous system of seven days old F1 embryo. Arrows point to eyes and nervous system in panel.
Arrows point to eyes and nervous system in panel. B) Larva was expressed in the eyes of a F1 1th instar larvae. C) and D) fluorescent images of pupa and moth.

제안 방법

먼저 피브로인 프로모터를 얻기 위해서 1,124 bp 프로모터 서열과 1,430 bp N-말단에 피브로인 H 유전자(nt 61,312 to 63,870 of AF226688)의 인트론(972 bp)이 포함된 단편은 누에에서 분리된 genomic DNA와 프라이머 pFibHN-F: 5’-GGCGCGCCGTGCGTGATCAGGAAAAAT-3’ (27mer) 와 pFibHN-R: 5’-TGCACCGACTGCAGCACTA GTGCTGAA-3’ (27mer)을 사용하여 PCR로 증폭하였고, pGEM-T Easy Vector System (Promega, Madison WI)에 클로닝하였다.
종결코돈이 없는 EGFP 유전자 단편은 프라이머 EGFP-F: 5’- GCGGCCGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ (29mer) 와 EGFP-R: 5’-GCTGAGGCTTGTACAGC TCGTCCAT-3’ (25mer)을 사용하여 pEGFP-1 (Clontech, UAS)으로부터 증폭하였고, pGEM-T Easy Vector에 클로닝하였다.
H-chain gene ORF의 180 bp 3’ 말단과 피브로인 H 유전자(nt 79,021 to 80,009 of AF226688)의 300 bp 3’ 영역이 포함된 단편은 누에에서 분리한 genomic DNA와 프라이머 pFibHC-F:5’-AGCGTCAGTTACG GAGCTGGCAGGGGA-3’ (27 mer)와 pFibHC-F: 5’-TATAGTATTCTTAGTTGAGAAGGCATA-3’ (27mer)을 사용하여 PCR로 증폭하였고, pGEM-T Easy Vector System (Promega, USA)에 클로닝하였다.
누에 실크에서 녹색 형광단백질이 발현되는 형질전환 누에를 만들기 위해 피브로인 프로모터와 EGFP 유전자를 piggyBac 벡터에 도입하여 제작하였다. 먼저 피브로인 프로모터를 얻기 위해서 1,124 bp 프로모터 서열과 1,430 bp N-말단에 피브로인 H 유전자(nt 61,312 to 63,870 of AF226688)의 인트론(972 bp)이 포함된 단편은 누에에서 분리된 genomic DNA와 프라이머 pFibHN-F: 5’-GGCGCGCCGTGCGTGATCAGGAAAAAT-3’ (27mer) 와 pFibHN-R: 5’-TGCACCGACTGCAGCACTA GTGCTGAA-3’ (27mer)을 사용하여 PCR로 증폭하였고, pGEM-T Easy Vector System (Promega, Madison WI)에 클로닝하였다.
종결코돈이 없는 EGFP 유전자 단편은 프라이머 EGFP-F: 5’- GCGGCCGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ (29mer) 와 EGFP-R: 5’-GCTGAGGCTTGTACAGC TCGTCCAT-3’ (25mer)을 사용하여 pEGFP-1 (Clontech, UAS)으로부터 증폭하였고, pGEM-T Easy Vector에 클로닝하였다. 이 플라스미드는 Not I 과 Bbvc I 으로 제한효소 처리하였고, 분리된 단편은 Not I 과 Bbvc I 으로 제한효소 처리된 pFibHNCnull벡터에 클로닝하였다. 완성된 플라스미드는 pFibHNCEGFP로 명명하였다.
또한 피브로인 H 유전자의 C-말단은 180 bp의 피브로인 H-chain gene ORF 3’ 말단과 300 bp 의 피브로인 H 유전자(nt 79,021 to 80,009 of AF226688)3’ 영역을 PCR을 이용하여 증폭하였다.
누에 초기배로의 microinjection은 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 주사하였으며, 그 과정은 다음과 같다. 먼저 텅스텐 침으로 누에알의 난각에 작은 구멍을 뚫고, 이 구멍에 DNA 용액이 들어있는 microcapillary의 끝을 삽입 후, microinjector의 공기압을 이용하여 DNA 용액을 알 속으로 주입하였다. 이때 각 배아에 주입된 DNA 용액의 양은 10 ~ 15 nl가 사용되었고, 난각에 생긴 구멍은 cyanocrylate 접착제를 사용하여 막았다.
형광현미경을 사용한 형질전환체 선발은 Leica (USA)사의 LEICA MZ16FA 현미경과 Leica (USA)사의 Microscope MZ FLIII Flourescence Filter DsRed 형광필터를 사용하여 세대별, 시기별로 관찰하여 선발하였다. 또한 녹색형광실크의 선별은 Leica (USA)사의 LEICA Z6 APO 현미경과 Leica (USA)사의 Filtersystem 470 LED를 사용하였다.
확인하고자 하는 단백질을 12% SDS-PAGE 전기영동 후 Semiphore transfer unit (Hoefer, TE-70)를 이용하여 PVDF membrane (Amersham Co., U.S.A.)에 transfer하였다. 비특이적인 반응을 막기 위해 5% skim milk로 2시간 동안 blocking한 후, TBS-T 완충액(10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.
반응 후 TBS-T로 상온에서 10분간 5회 세척한 후, 3M paper로 PVDF membrane에 남아 있는 물기를 제거하였다. ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (Amersham Biosciences., U.S.A.)를 사용하여 PVDF membrane을 상온에서 5분간 반응시킨 후, X-ray film에 노출시킨 후 현상하여 확인하였다.
녹색형광실크를 생산하는 형질전환 누에를 제작하기 위해 piggyBac 벡터를 이용하여 전이벡터를 구축하였다. 형질전환체를 선발하기 위한 마커 유전자로는 DsRed2 유전자를 사용하였고, 이 유전자의 조절 프로모터로는 3xP3 promoter를 사용하였다.
형질전환체를 선발하기 위한 마커 유전자로는 DsRed2 유전자를 사용하였고, 이 유전자의 조절 프로모터로는 3xP3 promoter를 사용하였다. 피브로인 프로모터를 얻기 위해서, 1,124 bp 프로모터 서열과 1,430 bp N-말단에 피브로인 H 유전자(nt 61,312 to 63,870 of AF226688)의 인트론(972 bp)이 포함된 단편을 누에 게놈으로부터 PCR을 이용하여 증폭하였다. 또한 피브로인 H 유전자의 C-말단은 180 bp의 피브로인 H-chain gene ORF 3’ 말단과 300 bp 의 피브로인 H 유전자(nt 79,021 to 80,009 of AF226688)3’ 영역을 PCR을 이용하여 증폭하였다.
누에형질전환체 제작을 위한 누에 초기배로의 microinjection 은 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 microinjection 하였고, 총1200개의 누에알에 microinjection 하였다. 그 결과 124 마리의 유충이 부화되었고, 그 중 54마리가 성충이 되었다.
녹색형광고치에서 EGFP 재조합단백질 발현을 확인하기 위해Western blot으로 분석하였다. 분석에는 F2세대의 녹색형광고치를 사용하였고, 사용된 항체는 Anti-EGFP Mouse monoclonal antibody (UK, Abcam)를 사용하였다.
2003). 본 실험에서는 피브로인 Hchain 재조합단백질 발현 시스템을 이용하여 녹색형광실크를 생산하는 형질전환누에를 제작하였다. 초파리 형질전환에 널리 사용되는 piggyBac 전이벡터에 누에 피브로인 H-chain 유래의 promoter와 EGFP 유전자를 이용하여 실크 피브로인에서 녹색형광단백질을 발현시켰고, 누에형질전환체 선발을 위해서는 초파리의 3xP3 promoter와 적색형광유전자인 DsRed2를 사용하였다.
일반적으로 실크가 생성되는 과정은 누에의 후부 견사선에서 피브로인이 생성된 후 중부 견사선에서 세리신으로 코팅되고 전부 견사선에서 토사공을 통해 밖으로 배출된다. 따라서 피브로인에서 녹색형광단백질이 발현되는 것을 확인하기 위해 5령 3일 누에를 해부하여 후부 견사선을 현광현미경으로 확인하였다. 그 결과 그림 3의 B에서 보는 것처럼 후부 견사선에서 녹색형광이 뚜렷하게 관찰되었고 중부와 전부 견사선에서도 녹색형광이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
또한 누에고치와 저온 정련법으로 제작한 실크에서도 녹색형광이 관찰되었으며, F2세대부터는 형질전환체의 누에고치색이 흰색에서 연녹색으로 점차 변하면서 F7세대에서는 진한 연두색을 나타내었다. 또한 형질전환 된 누에고치에서 EGFP 재조합단백질의 발현분석을 위해 Anti-EGFP antibody를 사용하여 Western blot분석을 하였다. 비록 피브로인 H-chain과 EGFP 융합단백질의 예상 위치인 약 40 kDa 보다는 높은 위치에서 밴드를 확인할 수 있었지만, 피브로인 H-chain 재조합단백질 발현 시스템에 의해 EGFP 재조합단백질이 누에실크에서 정확하게 발현된다는 것은 확인할 수 있었다.
선발된 누에형질전환체는 초기배 단계의 눈과 신경조직, 유충과 번데기 그리고 성충의 눈에서 DsRed2 형광단백질이 발현되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 실크의 피브로인에서 EGFP 단백질이 발현되는 것을 확인하기 위해, F2세대의 누에형질전환체 중에서 5령 3일 유충을 해부하여 견사선을 형광현미경으로 관찰하였고, 중부와 후부 견사선에서 형광단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 F2 세대의 고치와 저온에서 정련한 실크에서도 녹색형광단백질의 발현을 확인할 수 있었고, Western blot 분석에서도 EGFP 재조합 단백질이 피브로인 H-chain과 융합된 형태로 존재하는 것이 확인되었다.
그 결과 124 마리의 유충이 부화되었고, 그 중 54마리가 성충이 되었다. 성충이 된 나방들은 서로 교배시켜 F1세대를 얻은 후, 형질전환체의 선발을 위해 시기별로 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 누에알은 산란 후 3일째에 눈과 신경조직에서 형광이 관찰되었고, 유충과 번데기, 성충은 눈에서 형광이 각각 관찰되었다 (그림 2).
실크 피브로인에서 녹색형광단백질이 발현되는 것을 확인하기 위하여, 먼저 F2세대의 5령 3일 유충을 해부하여 견사선을 확인해 보았다. 그 결과 피브로인을 생산하는 기관인 후부 견사선에서 녹색형광단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 중부 견사선에서도 녹색형광단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (그림 3).

대상 데이터

형질전환에 사용된 누에(Bombyx mori)는 백옥잠(123x124) 을 사용하였고, 농촌진흥청 농업생물부의 표준 사육 기준(온도: 24oC ~ 27oC, 상대습도: 70% ~ 90%)에 준하여 사육하였다. 누에 형질전환에 사용된 전이벡터는 누에 형질전환에 사용된 벡터는 체코의 Jindra 박사로부터 분양 받은 pBac3xP3EGFP 벡터와 helper 벡터인 pHA3PIG를 사용하였다.
형질전환에 사용된 누에(Bombyx mori)는 백옥잠(123x124) 을 사용하였고, 농촌진흥청 농업생물부의 표준 사육 기준(온도: 24oC ~ 27oC, 상대습도: 70% ~ 90%)에 준하여 사육하였다. 누에 형질전환에 사용된 전이벡터는 누에 형질전환에 사용된 벡터는 체코의 Jindra 박사로부터 분양 받은 pBac3xP3EGFP 벡터와 helper 벡터인 pHA3PIG를 사용하였다.
완성된 플라스미드는 pGEMT-CTD로 명명하였다. 그리고 pGEMTpFibH-NTD는 Asc I과 BamH I으로, pGEMT-CTD는 SalI과 Fse I으로 각각 제한효소 처리함으로써 단편들을 준비하였다. 이들 단편들은 Apa I과 Not I으로 제한효소 처리된 pBluescriptII SK(-) vector (Stratagene, CA)에 함께 클로닝하였고, pFibHNC-null로 명명하였다.
형질전환에 사용된 누에알은 산란 후 4시간 이내의 것만 사용하였다. 전이벡터와 helper 벡터의 농도비는 1 : 1의 비율로 사용하였고, microinjection용 완충용액(5 mM KCl, 0.
형광현미경을 사용한 형질전환체 선발은 Leica (USA)사의 LEICA MZ16FA 현미경과 Leica (USA)사의 Microscope MZ FLIII Flourescence Filter DsRed 형광필터를 사용하여 세대별, 시기별로 관찰하여 선발하였다. 또한 녹색형광실크의 선별은 Leica (USA)사의 LEICA Z6 APO 현미경과 Leica (USA)사의 Filtersystem 470 LED를 사용하였다.
녹색형광실크를 생산하는 형질전환 누에를 제작하기 위해 piggyBac 벡터를 이용하여 전이벡터를 구축하였다. 형질전환체를 선발하기 위한 마커 유전자로는 DsRed2 유전자를 사용하였고, 이 유전자의 조절 프로모터로는 3xP3 promoter를 사용하였다. 피브로인 프로모터를 얻기 위해서, 1,124 bp 프로모터 서열과 1,430 bp N-말단에 피브로인 H 유전자(nt 61,312 to 63,870 of AF226688)의 인트론(972 bp)이 포함된 단편을 누에 게놈으로부터 PCR을 이용하여 증폭하였다.
녹색형광고치에서 EGFP 재조합단백질 발현을 확인하기 위해Western blot으로 분석하였다. 분석에는 F2세대의 녹색형광고치를 사용하였고, 사용된 항체는 Anti-EGFP Mouse monoclonal antibody (UK, Abcam)를 사용하였다. 그 결과 피브로인 H-chain과 EGFP 융합단백질의 예상 위치인 약 40 kDa 보다는 높은 위치에서 밴드를 확인할 수 있었다 (그림 6B).
본 실험에서는 피브로인 Hchain 재조합단백질 발현 시스템을 이용하여 녹색형광실크를 생산하는 형질전환누에를 제작하였다. 초파리 형질전환에 널리 사용되는 piggyBac 전이벡터에 누에 피브로인 H-chain 유래의 promoter와 EGFP 유전자를 이용하여 실크 피브로인에서 녹색형광단백질을 발현시켰고, 누에형질전환체 선발을 위해서는 초파리의 3xP3 promoter와 적색형광유전자인 DsRed2를 사용하였다. 누에형질전환체의 제작은 piggyBac 전이벡터와 helper 벡터의 혼합액을 초기배 상태의 누에알 배아의 주공과 후부 사이의 배면 부분에 microinjection함으로써 형질전환 효율을 향상시킬 수 있었다(Tamura et al.
1200 개의 누에알을 microinjection 하여 124 마리의 유충이 부화되었고, 그 중에서 54마리 만이 성충이 되었다. 또한 성충들을 서로 교배시켜 F1 세대의 알을 얻었고, 그 중에서 8 bloods 만이 형질전환체로 선발되었다. 형질전환체의 선발은 산란 후 3일째 되는 F1세대의 누에알을 형광현미경으로 관찰하여 선발하였는데, 3xP3 promoter의 특징인 누에 초기배 단계의 눈과 신경조직, 유충과 번데기 그리고 성충의 눈에서 작용한다고 알려져 있어서, 이러한 특징으로 누에형질전환체를 빠르게 선발할 수 있었다 (Thomas et al.
본 연구의 목적은 누에형질전환 기술을 이용하여 녹색 형광실크를 개발하는 것으로서, 본 실험에서는 피브로인 H-chain의 N-말단과 C-말단을 이용하여 피브로인 재조합 단백질 발현 시스템을 제작하였고, 종결코돈이 없는 EGFP 유전자를 위의 발현 시스템에 클로닝하여 녹색형광실크를 제작하였다. 누에형질전환체 선발을 위해서는 3xP3 promoter와 DsRed2를 이용하여 선발하였고, 1200 개의 누에알에 microinjection 하여 F1 세대에서 8 bloods의 형질전환체를 선발하였다. 선발된 누에형질전환체는 초기배 단계의 눈과 신경조직, 유충과 번데기 그리고 성충의 눈에서 DsRed2 형광단백질이 발현되는 것을 확인 할 수 있었다.

성능/효과

완성된 플라스미드는 pFibHNCEGFP로 명명하였다. 마지막으로 pFibHNC-EGFP를 Asc I과 Fse I으로 제한효소 처리하여 분리된 단편을 Asc I과 Fse I으로 제한효소 처리된 pG-3xP3-DsRed2에 클로닝하였고, 완성된 플라스미드는 pG-3xP3-DsRed2-pFibH-EGFP로 명명하였다.
누에형질전환체 제작을 위한 누에 초기배로의 microinjection 은 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 microinjection 하였고, 총1200개의 누에알에 microinjection 하였다. 그 결과 124 마리의 유충이 부화되었고, 그 중 54마리가 성충이 되었다. 성충이 된 나방들은 서로 교배시켜 F1세대를 얻은 후, 형질전환체의 선발을 위해 시기별로 형광현미경으로 관찰하였다.
분석에는 F2세대의 녹색형광고치를 사용하였고, 사용된 항체는 Anti-EGFP Mouse monoclonal antibody (UK, Abcam)를 사용하였다. 그 결과 피브로인 H-chain과 EGFP 융합단백질의 예상 위치인 약 40 kDa 보다는 높은 위치에서 밴드를 확인할 수 있었다 (그림 6B).
따라서 피브로인에서 녹색형광단백질이 발현되는 것을 확인하기 위해 5령 3일 누에를 해부하여 후부 견사선을 현광현미경으로 확인하였다. 그 결과 그림 3의 B에서 보는 것처럼 후부 견사선에서 녹색형광이 뚜렷하게 관찰되었고 중부와 전부 견사선에서도 녹색형광이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 누에고치와 저온 정련법으로 제작한 실크에서도 녹색형광이 관찰되었으며, F2세대부터는 형질전환체의 누에고치색이 흰색에서 연녹색으로 점차 변하면서 F7세대에서는 진한 연두색을 나타내었다.
그 결과 그림 3의 B에서 보는 것처럼 후부 견사선에서 녹색형광이 뚜렷하게 관찰되었고 중부와 전부 견사선에서도 녹색형광이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 누에고치와 저온 정련법으로 제작한 실크에서도 녹색형광이 관찰되었으며, F2세대부터는 형질전환체의 누에고치색이 흰색에서 연녹색으로 점차 변하면서 F7세대에서는 진한 연두색을 나타내었다. 또한 형질전환 된 누에고치에서 EGFP 재조합단백질의 발현분석을 위해 Anti-EGFP antibody를 사용하여 Western blot분석을 하였다.
또한 형질전환 된 누에고치에서 EGFP 재조합단백질의 발현분석을 위해 Anti-EGFP antibody를 사용하여 Western blot분석을 하였다. 비록 피브로인 H-chain과 EGFP 융합단백질의 예상 위치인 약 40 kDa 보다는 높은 위치에서 밴드를 확인할 수 있었지만, 피브로인 H-chain 재조합단백질 발현 시스템에 의해 EGFP 재조합단백질이 누에실크에서 정확하게 발현된다는 것은 확인할 수 있었다.
누에형질전환체 선발을 위해서는 3xP3 promoter와 DsRed2를 이용하여 선발하였고, 1200 개의 누에알에 microinjection 하여 F1 세대에서 8 bloods의 형질전환체를 선발하였다. 선발된 누에형질전환체는 초기배 단계의 눈과 신경조직, 유충과 번데기 그리고 성충의 눈에서 DsRed2 형광단백질이 발현되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 실크의 피브로인에서 EGFP 단백질이 발현되는 것을 확인하기 위해, F2세대의 누에형질전환체 중에서 5령 3일 유충을 해부하여 견사선을 형광현미경으로 관찰하였고, 중부와 후부 견사선에서 형광단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
성충이 된 나방들은 서로 교배시켜 F1세대를 얻은 후, 형질전환체의 선발을 위해 시기별로 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 누에알은 산란 후 3일째에 눈과 신경조직에서 형광이 관찰되었고, 유충과 번데기, 성충은 눈에서 형광이 각각 관찰되었다 (그림 2). 이런 과정을 통해 F1세대에서 8 아구(Bloods)의 형질전환체를 선발할 수 있었다 (표 1).
실크 피브로인에서 녹색형광단백질이 발현되는 것을 확인하기 위하여, 먼저 F2세대의 5령 3일 유충을 해부하여 견사선을 확인해 보았다. 그 결과 피브로인을 생산하는 기관인 후부 견사선에서 녹색형광단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 중부 견사선에서도 녹색형광단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (그림 3). 또한 F2 세대의 형질전환고치와 실크에서도 녹색형광이 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (그림 4, 그림 5).

후속연구

이상의 결과에서 녹색형광실크를 생산하는 누에형질전환체가 성공적으로 제작 되었음을 확인할 수 있었고, 이러한 결과는 실크를 새로운 산업소재 및 재조합 단백질 대량생산 연구에 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
그리고 F2 세대의 고치와 저온에서 정련한 실크에서도 녹색형광단백질의 발현을 확인할 수 있었고, Western blot 분석에서도 EGFP 재조합 단백질이 피브로인 H-chain과 융합된 형태로 존재하는 것이 확인되었다. 이상의 결과에서 녹색형광실크를 생산하는 누에형질전환 체가 성공적으로 제작 되었음을 확인할 수 있었고 이러한 결과를 토대로 새로운 산업소재로서 실크를 활용할 수 있을 것으로 기대한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	누에는 어떤 특수기관을 가지고 있는가?	의류용 실크 소재를 생산하는 대표적 산업곤충인 누에는 체내에 실크 단백질을 생산하기 위한 견사선이라는 특수한 기관을 가지고 있는데, 그것은 1,000개 내외의 세포로 이루어져 있으며 뽕잎의 단백질, 아미노산, 당 등으로부터 합성된 액상견으로 채워져 있다. 또한 견사선은 크게 피브로인(fibroin)의 합성 장소인 후부견사선(posterior silk gland, PSG)와 세리신(sericin)의 합성 장소인 중부견사선(middle silk gland, MSG) 그리고 실크를 토사시키는 전부견사선(anterial silk gland, ASG)로 구성되어 있고, 실크의 제작합성은 후부견사선에서 피브로인이 생성된 후 중부견사선에서 피브로인을 세리신으로 코팅하고, 전부견사선을 통해 토사된다 (Altman et al.
	의류용 실크 소재를 생산하는 대표적 산업곤충은 무엇인가?	의류용 실크 소재를 생산하는 대표적 산업곤충인 누에는 체내에 실크 단백질을 생산하기 위한 견사선이라는 특수한 기관을 가지고 있는데, 그것은 1,000개 내외의 세포로 이루어져 있으며 뽕잎의 단백질, 아미노산, 당 등으로부터 합성된 액상견으로 채워져 있다. 또한 견사선은 크게 피브로인(fibroin)의 합성 장소인 후부견사선(posterior silk gland, PSG)와 세리신(sericin)의 합성 장소인 중부견사선(middle silk gland, MSG) 그리고 실크를 토사시키는 전부견사선(anterial silk gland, ASG)로 구성되어 있고, 실크의 제작합성은 후부견사선에서 피브로인이 생성된 후 중부견사선에서 피브로인을 세리신으로 코팅하고, 전부견사선을 통해 토사된다 (Altman et al.
	대표적 산업곤충인 누에가 만들어내는 실크의 단점은?	실크는 다른 섬유에서 찾아 볼 수 없는 우아하고 고상한 광택과 촉감을 갖고 있으므로 다른 섬유보다 고부가 가치 소재로서 널리 알려져 있다. 그러나 값이 비싸고 내구성이 좋지 못하여 관리가 어렵고, 구김이 잘 생기는 등 실용적 특성이 부족하여 실크를 대중화, 일반화하지 못하고 있다. 따라서 실크를 다양한 산업분야에 적용하기 위한 소재로 개발하기 위해 본 실험에서는 피브로인 H-chain 재조합 단백질 발현 시스템을 이용하여 녹색형광실크를 제작하였다.

참고문헌 (14)

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Zhou CZ, Confalonieri F, Medina N, Zivanovic Y, Esnault C, Yang T, Jacquet M, Janin J, Duguet M, Perasso R, Li ZG (2000) Fine organization of Bombyx mori fibroin heavy chain gene. Nucleic Acids Res 28, 2413-2419.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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