멸종위기종, 상제나비(나비목, 흰나비과)의 보전을 위한 DNA 바코드 특성 분석 DNA barcode analysis for conservation of an endangered species, Aporia crataegi (Lepidoptera, Pieridae) in Korea원문보기
멸종위기종인 남한산 상제나비의 28년 된 장기 건조표본을 이용하여 DNA 바코드염기 서열을 최초로 분석하고, 이를 유라시아 10 지역 개체군 36개체들과 COI 특성을 비교해 보았다. 이들 개체군에서 총 5개의 haplotype을 확인하였고, haplotype I은 75%로 가장 높은 빈도를 나타내었으며, 유라시아 전 지역에 광범위하게 분포하고 있음을 확인하였다. 남한산 개체들은 모두 haplotype I에 속하고 있어 COI 유전자 상에서는 지역 고립성이 없는 것으로 밝혀졌다. 이 결과로 추후 남한산 상제나비 보전 및 복원은 타 지역 개체군 중 동일 haplotype 선별이 필수 요건으로 판단되나, 좀 더 정교한 평가를 위해서는 추가적인 마커를 이용한 분석이 필요할 것으로 제안한다.
멸종위기종인 남한산 상제나비의 28년 된 장기 건조표본을 이용하여 DNA 바코드 염기 서열을 최초로 분석하고, 이를 유라시아 10 지역 개체군 36개체들과 COI 특성을 비교해 보았다. 이들 개체군에서 총 5개의 haplotype을 확인하였고, haplotype I은 75%로 가장 높은 빈도를 나타내었으며, 유라시아 전 지역에 광범위하게 분포하고 있음을 확인하였다. 남한산 개체들은 모두 haplotype I에 속하고 있어 COI 유전자 상에서는 지역 고립성이 없는 것으로 밝혀졌다. 이 결과로 추후 남한산 상제나비 보전 및 복원은 타 지역 개체군 중 동일 haplotype 선별이 필수 요건으로 판단되나, 좀 더 정교한 평가를 위해서는 추가적인 마커를 이용한 분석이 필요할 것으로 제안한다.
Aporia crataegi, an Korean endangered species, was first analyzed for DNA barcode sequences based on 28-year-old dried specimens and compared barcode characters with 36 individuals of ten geographical populations of Eurasia. They were revealed to consist of five different haplotypes. Among them, hap...
Aporia crataegi, an Korean endangered species, was first analyzed for DNA barcode sequences based on 28-year-old dried specimens and compared barcode characters with 36 individuals of ten geographical populations of Eurasia. They were revealed to consist of five different haplotypes. Among them, haplotype I was mostly extensive and high frequency with 75%. The south Korean individuals were confirmed to be belonging to haplotype I and have no genetic isolation on COI gene. By these results, we consider that selection of the identical haplotype from other geographical populations may be a requirement prior to performing for conservation and restoration of the Korean population. We also propose to analyse the additional genetic markers in order to understand a more accurate genetic structures between haplotypes of this species.
Aporia crataegi, an Korean endangered species, was first analyzed for DNA barcode sequences based on 28-year-old dried specimens and compared barcode characters with 36 individuals of ten geographical populations of Eurasia. They were revealed to consist of five different haplotypes. Among them, haplotype I was mostly extensive and high frequency with 75%. The south Korean individuals were confirmed to be belonging to haplotype I and have no genetic isolation on COI gene. By these results, we consider that selection of the identical haplotype from other geographical populations may be a requirement prior to performing for conservation and restoration of the Korean population. We also propose to analyse the additional genetic markers in order to understand a more accurate genetic structures between haplotypes of this species.
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문제 정의
이에 28년 된 상제나비의 장기건조 표본에서 DNA 바코드 분석을 시도하였고, 아울러 중국, 러시아의 지역 집단을 포함한 DNA 바코드 라이브러리를 구축하면서 지역집단간의 유전적 다양성을 밝히고자 하였다. 또한 haplotype 분석을 통하여 유전자 수준에서 남한 집단과 가장 근접한 지역 집단을 찾고, 향후 상제나비 국내 집단의 복원을 위한 기초 자료로 활용하고자 하였다.
하지만 한국산 개체에 대한 유전적 분석은 생체나 최근 표본이 없어 시도되지 못하고 있는 실정이었다. 이에 28년 된 상제나비의 장기건조 표본에서 DNA 바코드 분석을 시도하였고, 아울러 중국, 러시아의 지역 집단을 포함한 DNA 바코드 라이브러리를 구축하면서 지역집단간의 유전적 다양성을 밝히고자 하였다. 또한 haplotype 분석을 통하여 유전자 수준에서 남한 집단과 가장 근접한 지역 집단을 찾고, 향후 상제나비 국내 집단의 복원을 위한 기초 자료로 활용하고자 하였다.
제안 방법
PCR 증폭에는 AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Korea)를 이용하여 초기변성은 94℃에서 5분, 목적 단편 구간 증폭은 94℃에서 30초, 48℃에서 25초, 72℃에서 45초로 35회 반복하였으며, 최종 확장은72℃에서 3분을 가하였다. PCR 산물은 7% 아가로스겔에서 모니터링 하여 증폭 여부를 확인한 후 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Korea)를 이용하여 정제하고, 시퀀싱 반응은 automated DNA analyzer (ABI 3730 xl 96-capillary DNA anlayzer; Applied Biosystems, USA)로 분석하였다. 분석된 염기 서열은 GenBank에 등록하였다.
1). PCR 증폭에는 AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Korea)를 이용하여 초기변성은 94℃에서 5분, 목적 단편 구간 증폭은 94℃에서 30초, 48℃에서 25초, 72℃에서 45초로 35회 반복하였으며, 최종 확장은72℃에서 3분을 가하였다. PCR 산물은 7% 아가로스겔에서 모니터링 하여 증폭 여부를 확인한 후 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Korea)를 이용하여 정제하고, 시퀀싱 반응은 automated DNA analyzer (ABI 3730 xl 96-capillary DNA anlayzer; Applied Biosystems, USA)로 분석하였다.
본 연구에서 새롭게 분석된 상제나비는 모두 건조표본으로 한국산 2개체, 중국산 5개체, 러시아산 3개체를 포함하여 총 10개체에 대한 DNA 바코드 분석을 실시하였다(Table 1). 게놈 DNA는 성충의 다리를 적출한 후 QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, Korea)를 사용하여 100 ㎕를 추출하였다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 상제나비에 대한 종 특이 프라이머를 Park et al.
멸종위기종인 남한산 상제나비의 28년 된 장기 건조표본을 이용하여 DNA 바코드 염기 서열을 최초로 분석하고, 이를 유라시아 10 지역 개체군 36개체들과 COI 특성을 비교해 보았다. 이들 개체군에서 총 5개의 haplotype을 확인하였고, haplotype I은 75%로 가장 높은 빈도를 나타내었으며, 유라시아 전 지역에 광범위하게 분포하고 있음을 확인하였다.
본 연구에서 새롭게 분석된 상제나비는 모두 건조표본으로 한국산 2개체, 중국산 5개체, 러시아산 3개체를 포함하여 총 10개체에 대한 DNA 바코드 분석을 실시하였다(Table 1). 게놈 DNA는 성충의 다리를 적출한 후 QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, Korea)를 사용하여 100 ㎕를 추출하였다.
상제나비 35개체 내의 COI 유전자 분화율은 0.00 ~ 0.53%로 종내 변이수준이였으며, 총 5개의 haplotype을 구성하였다(Fig 2, Table 3). Haplotype I은 27개체(75%)였으며, 몽골산을 제외한 9개 지역 개체군 모두 포함되고 있었다.
게놈 DNA는 성충의 다리를 적출한 후 QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, Korea)를 사용하여 100 ㎕를 추출하였다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 상제나비에 대한 종 특이 프라이머를 Park et al. (2012)에 의해 분석된 COI 염기 서열을 참고하여 DNA 바코드 영역 658 bp 증폭을 목적으로 하는 8개의 프라이머를 새롭게 디자인하여 적용하였다(Table 2). 각각의 프라이머는 증폭 길이 152 bp ~ 265 bp 구간으로 선택적으로 프라이머세트를 구성하여 적용하였다(Fig.
대상 데이터
DNA 바코드 염기 서열 분석을 위하여 이번에 새롭게 분석한 10개체와 상제나비로 NCBI에 등록되어 있는 스페인산 4개체(Carnicer et al. 2013), 독일산 3개체(Hausmann et al. 2011), 루마니아산 8개체(Dinca et al. 2011), 이탈리아 1개체(Shapiro et al. 2007), 핀란드산 1개체(Wahlberg and Wheat 2008), 몽골산 1개체(Park et al. 2012), 카자흐스탄산 7개체(Lukhtanov et al. 2009) 등 25개체 서열 정보를 이용하여 총 35개체 및 중국산 A. potanini도 포함하였으며, outgroup으로는 A. bieti를 사용해 총 10개 지역개체군 37개체에 대한 데이터세트를 구성하여 시험에 이용하였다(Table 1). 658 bp 염기 서열의 데이터세트 중 일부 분석한 개체에서의 missing sequence data는 haplotype분석에서 잠재적인 오류를 도출하기 때문에 모두 삭제하여 최종적으로 567 bp 길이로 보정한 후 분석하였다.
Haplotype I은 27개체(75%)였으며, 몽골산을 제외한 9개 지역 개체군 모두 포함되고 있었다. 두번째로 빈도가 높은 haplotype IV는 5개체(13.9%)로 각각 루마니아산, 몽골산, 카자흐스탄산 개체들로 구성되어 있었다. Haplotype II는 2개체(5.
이론/모형
DNA 바코드 염기 서열의 정열 및 유전적 분화율 및 neighbour-joining(NJ) 분석은 MEGA 5.2(Tamura et al. 2011)를 이용하였다. Haplotype 분석은 TCS 1.
2011)를 이용하였다. Haplotype 분석은 TCS 1.21(Clement et al. 2000)을 이용하여 NJ tree에 적용시켰다.
성능/효과
567 bp 염기 서열을 대상으로 한 COI의 분화율은 상제나비와 A. bieti는 종간에 6.10 ~ 6.50% 차이로 뚜렷이 구분되었다. 하지만 중국산 A.
이 중 한국산 2개체는 haplotype I에 속하였다. Haplotype간 유전적 변이는 haplotype III을 haplotype IV과 V를 비교하였을 때 0.53%로 가장 큰 것으로 나타났다. 특이점으로는 이들 haplotype간 염기치환은 전체 567 bp 염기 서열에서 모두 4 개의 염기 위치로 각각 225번째(T→C), 237번째(C→T), 322번째(G→A), 468번째(C→T)였다(Fig.
3). 결과적으로 10 지역 개체군에 대한 개체들은 크게 5종류의 haplotype들이 있음을 확인하였다. 이들 중 108번째 아미노산 돌연변이 유무에 따라 두 개의 유전자 풀 그룹으로 나뉘는데, 그룹 1은 글리신을 갖는 개체들로 haplotype I, II, III, V가 포함되고, 그룹 2는 세린을 갖는 개체들로 haplotype IV에 속한다.
그럼에도 불구하고, 향후에 상제나비 종 복원 사업에서 타지역 집단의 개체를 도입하려고 할 때, COI haplotype 분석을 통해 동일 haplotype 개체인지를 확인하는 것은 유전적 근연 집단을 찾는데 매우 중요한 일임을 제시해준다. 하지만, 이번 연구보다 더 다양한 분포지역을 포함하는 상제나비의 유전적 변이를 microsatellite DNA 분석을 시도할 필요가 있다.
반면COI 염기 서열을 이용한 상제나비의 DNA 바코드를 분석한 결과, 우리나라를 포함한 유라시아 10개 지역 개체군들은 총 5개의 haplotype으로 구성되었고, 특히, 남한산 영월 개체들은 가장 빈도가 우세한 haplotype I에 속하는 것으로 확인되었다. 또한 광역 분포종인 상제나비의 haplotype들이 각각의 빈도는 다를지라도 동일 지역에서도 혼재되어 있음이 밝혀졌다. 이는 상제나비가 남한에서만 귀할 뿐, 인접 러시아 극동지역에서는 매우 흔하고, 러시아의 다른 지역에서는 여러 번 발생(1-3세대 또는 그 이상)이 가능하며, 식초(2개과 등: 장미과, 월귤과 등) 다양성이 큰 것과 관련 있을 것으로 보인다(Tuzov 1997).
상제나비는 형태분류학적으로 9개의 아종으로 이루어져 있으나, 변이성이 매우 약하기 때문에 이들의 분류학적 지위가 의심스러운 것으로 보고 있다(Tuzov 1997). 반면COI 염기 서열을 이용한 상제나비의 DNA 바코드를 분석한 결과, 우리나라를 포함한 유라시아 10개 지역 개체군들은 총 5개의 haplotype으로 구성되었고, 특히, 남한산 영월 개체들은 가장 빈도가 우세한 haplotype I에 속하는 것으로 확인되었다. 또한 광역 분포종인 상제나비의 haplotype들이 각각의 빈도는 다를지라도 동일 지역에서도 혼재되어 있음이 밝혀졌다.
225번째, 237번째 염기 위치는 동의적 치환(synonymous substitution)인 동시에 singletonposition이었으나, 468번째 위치는 동의적 치환인 동시에 haplotype II와 III에 대한 informative position이였다. 예외적으로 322번째 위치는 아미노산 서열로 전환하였을 때108번째 코돈의 첫 번째 위치에서 일어난 돌연변이로 GGA가 AGA 치환되어 글리신(Gly)이 아닌 세린(Ser)을 지시하는 것을 확인하였고, 이는 haplotype IV에 속하는 개체들만이 갖는 특징이었다(Fig. 3). 결과적으로 10 지역 개체군에 대한 개체들은 크게 5종류의 haplotype들이 있음을 확인하였다.
이는 상제나비가 남한에서만 귀할 뿐, 인접 러시아 극동지역에서는 매우 흔하고, 러시아의 다른 지역에서는 여러 번 발생(1-3세대 또는 그 이상)이 가능하며, 식초(2개과 등: 장미과, 월귤과 등) 다양성이 큰 것과 관련 있을 것으로 보인다(Tuzov 1997). 우리의 DNA바코드를 통한 결과로도 남한산 개체군이 고립된 수많은 지역 집단인 메타개체군 중의 하나라고 간주하기는 어렵다는 결론에 도달하였다.
멸종위기종인 남한산 상제나비의 28년 된 장기 건조표본을 이용하여 DNA 바코드 염기 서열을 최초로 분석하고, 이를 유라시아 10 지역 개체군 36개체들과 COI 특성을 비교해 보았다. 이들 개체군에서 총 5개의 haplotype을 확인하였고, haplotype I은 75%로 가장 높은 빈도를 나타내었으며, 유라시아 전 지역에 광범위하게 분포하고 있음을 확인하였다. 남한산 개체들은 모두 haplotype I에 속하고 있어 COI 유전자 상에서는 지역 고립성이 없는 것으로 밝혀졌다.
후속연구
남한산 개체들은 모두 haplotype I에 속하고 있어 COI 유전자 상에서는 지역 고립성이 없는 것으로 밝혀졌다. 이 결과로 추후 남한산 상제나비 보전 및 복원은 타 지역 개체군 중 동일 haplotype 선별이 필수 요건으로 판단되나, 좀 더 정교한 평가를 위해서는 추가적인 마커를 이용한 분석이 필요할 것으로 제안한다.
50% 차이로 뚜렷이 구분되었다. 하지만 중국산 A. potanini (EF584852)는 상제나비 35 분석 개체와 종내 변이 수준(0 ~ 0.35%)만을 보였으며, 상제나비 haplotype I에 포함되어 종간의 특성은 없어 이 종에 대한 오동정 여부 또는 분류학적 지위를 재검토해야 할 것으로 보인다(Fig. 2).
그럼에도 불구하고, 향후에 상제나비 종 복원 사업에서 타지역 집단의 개체를 도입하려고 할 때, COI haplotype 분석을 통해 동일 haplotype 개체인지를 확인하는 것은 유전적 근연 집단을 찾는데 매우 중요한 일임을 제시해준다. 하지만, 이번 연구보다 더 다양한 분포지역을 포함하는 상제나비의 유전적 변이를 microsatellite DNA 분석을 시도할 필요가 있다. 종 복원 사업을 진행하기 전에 이 같은 한 차원 높은 유전적 변이분석을 수행하게 된다면, 지리적 집단 간의 유전자 흐름과 남한 개체군의 유전적 구조의 정도를 세밀하게 파악하게 되어 남한산 상제나비 집단의 유전적 특성 뿐 아니라 근친 집단을 더 명확하게 구별할 수 있기 때문이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
상제나비의 애벌레의 특징은 무엇인가?
상제나비는 흰나비과의 Aporia속에 속하며, 날개의 바탕이 희고 맥이 검다. 이 종의 애벌레는 장미과의 개살구나무와 털야광나무를 식초로 삼고, 3령으로 겨울을 나서 이듬해 5-6월에 성충으로 1회 발생한다(Kim and Seo 2012).또한 이 나비는 광역 분포 종으로 유럽부터 극동 아시아까지 유라시아 대륙의 한대지역에 넓게 분포하며, 우리나라가 동아시아 분포의 남한계이다(Paek and Shin 2010).
상제나비는 분류학적으로 어디에 속하는가?
상제나비는 흰나비과의 Aporia속에 속하며, 날개의 바탕이 희고 맥이 검다. 이 종의 애벌레는 장미과의 개살구나무와 털야광나무를 식초로 삼고, 3령으로 겨울을 나서 이듬해 5-6월에 성충으로 1회 발생한다(Kim and Seo 2012).
상제나비의 급격한 감소와 절멸위기의 원인은 무엇인가?
상제나비의 급격한 감소와 절멸위기의 원인으로는 좁은 지역에서 발생한 개체에 대한 남획과 기후온난화 가능성이 제기되었고(Park 2005), Choi and Kim (2011)은 기후온난화와 서식지인 관목림 상태의 서식지의 축소가 감소원인으로 제시하였다. 하지만, 상제나비의 남한 집단에 대한 생태 및 집단유전학적 연구가 수행되기도 전에 남한에서는 절멸위기의 상황이 되어 버렸다.
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