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문제 정의
- 시판 쪽 분말염료를 천연 염색 제품개발과 공예 염색에 효율적으로 활용하고 보다 손쉬운 천연 쪽 염색을 널리 보급하기 위해서는, 각 분말의 장점을 조사하여 정보를 제공함으로써 적절한 제품을 선택할 수 있도록 하는것이필요하다고하겠다. 이와같은배경하에서본연구는 시판 쪽 분말 중 인도산과 중국산 발효쪽 분말 각 2종류와 생쪽 분말 2종류를 선정하여 박층크로마토그라피(TLC)법으로 예비분석하고, 고속액체크로마토그라피(이하 HPLC)법을 이용하여 각 분말에 함유된 색소 성분을 분석하여, 그 결과를 해당 쪽 분말로 염색한 면직물의 색상 및 항균성과 비교하여, 현재 국내에서 판매되고 있는 쪽 분말의 특성을 구체화하는 데 목적을 두었다.
제안 방법
- DMSO/acetonitrile(2:1 v/v)의 혼합 용제에 용해한 합성 인디고와 천연 인디고에 대해 HPLC 분석을 실시하였다. 합성인디고와천연인디고의 HPLC 분석결과 6.
- HPLC 분석을 위한 시료의 용매 조건을 찾기 위해 TLC 예비분석을 실시하였다. 선행연구에 따라 DMSO 와 acetonitrile을 다양한 농도로 조합하여 염료 용해를 시도하고, 전개액은 chloroform과 acetonitrile의 혼합 비율을 조절하여 푸른 색소와 붉은 색소의 분리가 잘 일어나는 조건을 구하였다.
- 2×105 CFU/ml이며 대조편으로 염색 처리하지 않은 표준면표를 사용하였다. 각 염료로 염색한 시료와 대 조편 0.4g당 공시균을 0.2ml 흡수시켜 37oC에서 18시간 배양한 후 각각에 비이온계면활성제(Tween 80) 0.05%수용액을 20ml씩을 첨가한 뒤 생균수를 측정하였다. 염색한 시료의 항균성은 대조편 대비 균감소율로서 측정하였다.
- 모세관(Micro-hematocrit capillary tube)으로 염료를 빨아들여 3cm×10cm로 자른 TLC plate 하단 1cm 지점에 각 염료의 간격이 0.5cm 되도록 점적(spotting)하고 건조시켰다.
- 본 연구에서는 발효쪽과 생쪽을 포함하는 6종의 시판 쪽 분말에 대해 HPLC법으로 색소 성분과 함량을 분석하고 그 결과를 해당 쪽 분말로 염색한 면직물의 색상 및 항균성과 비교하였다. 연구결과, 색소 함량과 염색포의 색상은 면직물 기준, 반드시 일치하지는 않으나, 염색포의 항균성은 색소 성분의 함량과 직접적인 연관이 있음을 확인하였다.
- 분말제품과 표준물의 HPLC 크로마토그램 피크의 면적(relative abundance)을 토대로 시료에 포함된 색소 함량을 조사하였다(Table 4). 조사결과 발효쪽 분말은 4종 모두 인디고틴의 함량이 인디루빈보다 높은 것을 확인하였는데 중국산의 경우 인도산에 비해 인디고틴의 함량이 더 높고, 역으로 인도산은 중국산에 비해 인디 루빈의 함량이 높은 것으로 나타났다.
- 선명한그림을얻기위해 [Fig. 3]−[Fig. 5]는 Agilent 1200 series HPLC-DAD-MS로 새로 분석하였다.
- HPLC 분석을 위한 시료의 용매 조건을 찾기 위해 TLC 예비분석을 실시하였다. 선행연구에 따라 DMSO 와 acetonitrile을 다양한 농도로 조합하여 염료 용해를 시도하고, 전개액은 chloroform과 acetonitrile의 혼합 비율을 조절하여 푸른 색소와 붉은 색소의 분리가 잘 일어나는 조건을 구하였다. 다양한 시도결과 DMSO와 acetonitrile을 2:1 v/v 비율로 혼합한 용제를 염료의 용매로 사용하고 시판 쪽 분말과 합성 인디고, 천연 인디고 0.
- 시판 쪽 분말의 인디고틴과 인디루빈 성분을 분리, 확인하기 위해 6종의 쪽 분말과 합성 인디고 및 천연 인디고에 대해 HPLC 분석을 실시하였다. 천연 인디고와 합성인디고에서 나타나는 크로마토그램 피크의 머무름 시간(retention time)과 DAD의 UV 스펙트럼을 통해 쪽 분말제품의 색소를 확인하였다.
- 05%수용액을 20ml씩을 첨가한 뒤 생균수를 측정하였다. 염색한 시료의 항균성은 대조편 대비 균감소율로서 측정하였다.
- 시판 쪽 분말의 인디고틴과 인디루빈 성분을 분리, 확인하기 위해 6종의 쪽 분말과 합성 인디고 및 천연 인디고에 대해 HPLC 분석을 실시하였다. 천연 인디고와 합성인디고에서 나타나는 크로마토그램 피크의 머무름 시간(retention time)과 DAD의 UV 스펙트럼을 통해 쪽 분말제품의 색소를 확인하였다. 인디고틴과 인디루빈은 분자량이 같기 때문에 질량분석으로는 두 성분 간의 구분이 어려우므로 따라서 DAD의 UV 흡수 밴드가 성분 판별의 결정적인 요소가 된다.
- 합성 인디고와 천연 인디고의 HPLC 분석결과를 토대로 6종의 쪽 분말의 성분분석을 실시하였다(Fig. 4)−(Fig. 5).
- 항균성시험은 발효쪽 분말 FI1과 FC1, 생쪽 분말 R2로 염색한 면직물에 실시하였다(Table 6). 동일한 조건에서 실험한 표준면포의 균수에 비해 발효쪽 분말(FI1 FC1)은 정균감소율이 60~96%로서 모두 염색결과 항균성이 생긴 것을 확인하였다.
대상 데이터
- HPLC는 DAD(Diode array detector)와 질량분석기가 장착된 Agilent 1100 series를 사용하였다. 컬럼(column)은 Shiseido capsell pak C18, 이동상은 acetonitrile/water (50:50), DAD의 UV detector는 540nm, runtime은 30분으로하였다.
- 항균성 측정은 한국의류시험연구소(KATRI)에 의뢰하였으며 KS K 0693에 준하여 시험하였다. 공시균은 섬유부착 병원균 중 Gram 양성균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus ATCC 6538)과 Gram 음성균인 폐렴균(Klebsiella pneumoniae ATCC 4352)을 사용하였다. 접종균액의 농도는 황색포도상구균 1.
- 선행연구(Oh & Ahn, 2011)에서 취급했던 시판 쪽 분말 중 발효쪽 분말 4종과 생쪽 분말 2종을 분석실험에 사용하였고, Sigma Aldrich의 natural indigo와 합성 indigo(순도 95%)를 표준물로 사용하였다(Table 2).
- 시료들은 발효쪽 분말(FI1, FI2, FC1, FC2)은 환원법을, 생쪽 분말(R1, R2)은 비환원법을 사용해 염색한 것들로서 측색은 JS-555 분광색차계(Color Techno System, Japan)를 이용하였다(Oh & Ahn, 2011).
- 시판쪽 분말은 FI1, FI2, FC1, FC2, R1, R2로 표기하고 합성인디고는 S, 천연 인디고는 N으로 표기하였다. 염료 용해와 TLC 전개액에는 dimethyl sulfoxide(DMSO, Mallinckrodt, HPLC급), acetonitrile(JT Baker, HPLC급), chloroform(JT Baker, HPLC급)이 사용되었다. 염액은 유리섬유가 강화된 나일론 0.
- 염액은 유리섬유가 강화된 나일론 0.45µm 시린지 필터(Alltech, Deerfield)로 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다.
이론/모형
- 염색결과는 선행연구(Oh & Ahn, 2011)에서 6종의 시판 쪽 분말과 합성 인디고를 이용해 면직물(한국의류시험연구원의 섬유시험용 백포, KS K 0905 규격)을 염색한 결과를활용하였다.
- 항균성 측정은 한국의류시험연구소(KATRI)에 의뢰하였으며 KS K 0693에 준하여 시험하였다. 공시균은 섬유부착 병원균 중 Gram 양성균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus ATCC 6538)과 Gram 음성균인 폐렴균(Klebsiella pneumoniae ATCC 4352)을 사용하였다.
성능/효과
- 쪽의 성분분석을 다룬 선행연구에서 Polygonum tinctorium이나 Isatis tinctoria 각각에 대한 연구 혹은 두 종자 간을 비교한 연구는 있었으나 인도산인 Indigofera tinctoria와 중국산인 Polygonum tinctorium을 비교분석한 연구는 없는 것을 볼 때 시판 쪽 분말에 대한 분석을 통해 두 종자 간의 색소 함량의 차이도 조사할 수 있을 것으로 사료된다. Indigofera tinctoria와 Polygonum tinctorium에 함유되어 있는 전구체에 대한 선행연구의 결과로 미루어 6종의 쪽 분말 모두 인디칸이 주요 전구체일 것으로 추정되며 인디고틴과 인디루빈이 모두 검출될 것으로 예상된다.
- TLC 분석결과 발효쪽 분말(FI1, FC1)과 합성 인디고(S)는 인디고틴으로 추정되는 청색 색소와 인디루빈으로 추정되는 적색 색소로 전개된 반면 생쪽 분말(R1)은 청색과 적색 색소의 전개가 이루어지지 않았다. 합성 인디고(S)에서도 적색 색소의 전개가 이루어진 것은 의외의 결과로서 염료 합성 혹은 보관 과정에서 인디루빈이 불순물로 생성된 것으로 보이며 HPLC-MS를 이용한 성분분석이 필요한 것으로 사료된다.
- 본 실험에서는중국산발효쪽분말이인도산발효쪽분말보다인디고틴의함량이높은것으로나타났고인디루빈의경우는 그 반대였다. 그러나 결과적으로 인도산 발효쪽 분말로 염색한 면직물의 색상이 더 진하게 염색되어 인디고틴 함량의 결과와는 반대의 결과를 나타내었다.
- 항균성시험은 발효쪽 분말 FI1과 FC1, 생쪽 분말 R2로 염색한 면직물에 실시하였다(Table 6). 동일한 조건에서 실험한 표준면포의 균수에 비해 발효쪽 분말(FI1 FC1)은 정균감소율이 60~96%로서 모두 염색결과 항균성이 생긴 것을 확인하였다. 특히 인도산 발효쪽 분말(FI1)이 공시균주 두 종류에 대해 각각 정균감소율이 96.
- 4). 따라서 4종의 발효쪽 분말 모두 인디고틴과 인디루빈을 갖고 있는 것으로 확인하였다. 생쪽 분말(R1, R2)도 머무름 시간과 UV 흡수 밴드를 볼 때 인디고틴과 인디루빈이 분리된 것을 확인하였으나 피크의 강도는 발효쪽 분말이나 합성 인디고, 천연 인디고와 상이하였다.
- 문헌고찰에 따라 본 연구의 실험대상인 인도산 발효 쪽과 생쪽 분말은 식물원료가 Indigofera tinctoria일 것으로 여겨지며, 중국산 발효쪽은 Polygonum tinctorium 이 원료일 것으로 여겨진다. 쪽의 성분분석을 다룬 선행연구에서 Polygonum tinctorium이나 Isatis tinctoria 각각에 대한 연구 혹은 두 종자 간을 비교한 연구는 있었으나 인도산인 Indigofera tinctoria와 중국산인 Polygonum tinctorium을 비교분석한 연구는 없는 것을 볼 때 시판 쪽 분말에 대한 분석을 통해 두 종자 간의 색소 함량의 차이도 조사할 수 있을 것으로 사료된다.
- 1%로서 항균성이 가장 우수하였으며 이는 중국산 발효쪽 분말에 비해 인도산 발효쪽 분말에 인디 루빈이 더 많이 함유되어 있기 때문으로 사료된다. 반면 생쪽 분말은 Staphylococcus aureus에 대해 정균감소율이 78.6%로서 항균성이 세 가지 분말타입 중 가장 낮았으며, Klebsiella pneumoniae에 대해서는 표준면포에 비해 오히려 균이 1.4배 정도 균주가 더 늘어난 것을 확인할 수 있었다. 위의 결과로 미루어 볼 때 쪽 분말의 색소는 대체로 Staphylococcus aureus에 대해 더 항균성이 우수하며 항균성의 정도는 indirubin의 함량과 무관하지 않은 것을 알 수 있다.
- , 2004) 등 다양한 원인에 의해 인디고틴 함량에 차이가 있을 것으로 추측된다. 본 실험에서는중국산발효쪽분말이인도산발효쪽분말보다인디고틴의함량이높은것으로나타났고인디루빈의경우는 그 반대였다. 그러나 결과적으로 인도산 발효쪽 분말로 염색한 면직물의 색상이 더 진하게 염색되어 인디고틴 함량의 결과와는 반대의 결과를 나타내었다.
- 3 min의 피크는 542nm로 나타났다. 선행연구 결과에 따라 610nm는 인디고틴, 542nm는 인디루빈의 흡수 밴드이며 따라서 본 연구에서 적용한 HPLC 분석조건에서는 인디고틴이 6.9 min, 인디루빈이 8.3 min에 분리되는 것으로 확인된다. 이와 같이 합성 인디고의 HPLC 분석결과에서 인디루빈이 함유되어 있는 것으로 나타난 것은 TLC 분석의 결과와 같고 Chung et al.
- 본 연구에서는 발효쪽과 생쪽을 포함하는 6종의 시판 쪽 분말에 대해 HPLC법으로 색소 성분과 함량을 분석하고 그 결과를 해당 쪽 분말로 염색한 면직물의 색상 및 항균성과 비교하였다. 연구결과, 색소 함량과 염색포의 색상은 면직물 기준, 반드시 일치하지는 않으나, 염색포의 항균성은 색소 성분의 함량과 직접적인 연관이 있음을 확인하였다. 인디고틴의 함량이 더 많은 중국산 발효쪽 분말의 경우 예상 외로 면직물에 대한 염 착률이 인도산 발효쪽 분말보다 낮았고 색상이 옅게 염색되었는데 이와 같은 현상이 분말의 입자 크기 등에 기인하는지에 대해서는 후속연구가 필요하다고하겠다.
- 4배 정도 균주가 더 늘어난 것을 확인할 수 있었다. 위의 결과로 미루어 볼 때 쪽 분말의 색소는 대체로 Staphylococcus aureus에 대해 더 항균성이 우수하며 항균성의 정도는 indirubin의 함량과 무관하지 않은 것을 알 수 있다. 생쪽 분말의 경우 전반적으로 색소 함량이 적은데도 불구하고 항균성을 나타내는 것은 괄목할만한 사실이다.
- 6cm 전개되었다. 이 값을 통하여 산출된 각 색소의 Rf 값은 청색 색소가 0.81, 적색 색소가 0.72이었으며 이 값은 발효쪽 분말인 FI1과 FC1, 합성 인디고(S)가 모두 동일하였다. 분리된 색소의 색상과 Rf 값을 볼 때 발효쪽 분말에서 분리된 색소는 합성 인디고의 색소와 동일한 것으로 추정된다.
- 인디고틴과 인디 루빈의 함량비에 있어서 인도산 발효쪽은 천연 인디고에 결과에 가까운 것을 알 수 있었다. 이와 같은 결과로볼 때 본 연구에서 사용한 천연 인디고 표준물과 인도산 발효쪽 분말은 동일한 식물재료로부터 제조된 것으로 추측할 수 있으며 Indigofera tinctoria를 원료로 하였을 것으로 생각된다.
- 5). 인도산 발효쪽 분말(FI1, FI2)과 중국산 발효쪽 분말(FC1, FC2)은 모두 6.9 min 부근에서 주 피크와 8.3 min 부근에서 작은 피크가 나타났고 각각의 UV 흡수 밴드는 합성 인디고, 천연 인디고와 동일하였다(Fig. 4). 따라서 4종의 발효쪽 분말 모두 인디고틴과 인디루빈을 갖고 있는 것으로 확인하였다.
- 인디고틴의 함량이 더 많은 중국산 발효쪽 분말의 경우 예상 외로 면직물에 대한 염 착률이 인도산 발효쪽 분말보다 낮았고 색상이 옅게 염색되었는데 이와 같은 현상이 분말의 입자 크기 등에 기인하는지에 대해서는 후속연구가 필요하다고하겠다. 인도산 발효쪽 분말은 진한 쪽빛으로 염색되고 항균성도 중국산에 비해 다소 높은 것으로 나타났는데 이는 쪽의 종자 중 Indigofera tinctoria를 true indigo라고 부르는 것과 무관하지 않은 것으로 사료된다. 생쪽 분말의 경우 색소의 함량이 매우 낮으므로 염색시 발효쪽 분말 대비 더 많은 양의 분말을 사용해야 하며 환원 처리 전에쪽 분말을 물속에서 끓이는 전처리도 염색효과를 높이는데 유용할 것이다.
- 5). 전체적으로 R1과 R2 모두 표준물과 발효쪽 분말에 비해 흡광도(y축)가 매우 낮아 색소 함량이 적을 것을 시사하였다.
- 분말제품과 표준물의 HPLC 크로마토그램 피크의 면적(relative abundance)을 토대로 시료에 포함된 색소 함량을 조사하였다(Table 4). 조사결과 발효쪽 분말은 4종 모두 인디고틴의 함량이 인디루빈보다 높은 것을 확인하였는데 중국산의 경우 인도산에 비해 인디고틴의 함량이 더 높고, 역으로 인도산은 중국산에 비해 인디 루빈의 함량이 높은 것으로 나타났다. 인디고틴과 인디 루빈의 함량비에 있어서 인도산 발효쪽은 천연 인디고에 결과에 가까운 것을 알 수 있었다.
- 생쪽 분말(R1, R2)도 머무름 시간과 UV 흡수 밴드를 볼 때 인디고틴과 인디루빈이 분리된 것을 확인하였으나 피크의 강도는 발효쪽 분말이나 합성 인디고, 천연 인디고와 상이하였다. 즉, R1 생쪽 분말은 인디고틴과 인디루빈 피크의 강도가 유사하였으며 R2의 경우는 인디루빈의 피크가 인디고틴에 비해 높은 것으로 확인되었다(Fig. 5). 전체적으로 R1과 R2 모두 표준물과 발효쪽 분말에 비해 흡광도(y축)가 매우 낮아 색소 함량이 적을 것을 시사하였다.
- 동일한 조건에서 실험한 표준면포의 균수에 비해 발효쪽 분말(FI1 FC1)은 정균감소율이 60~96%로서 모두 염색결과 항균성이 생긴 것을 확인하였다. 특히 인도산 발효쪽 분말(FI1)이 공시균주 두 종류에 대해 각각 정균감소율이 96.3%와 88.1%로서 항균성이 가장 우수하였으며 이는 중국산 발효쪽 분말에 비해 인도산 발효쪽 분말에 인디 루빈이 더 많이 함유되어 있기 때문으로 사료된다. 반면 생쪽 분말은 Staphylococcus aureus에 대해 정균감소율이 78.
- DMSO/acetonitrile(2:1 v/v)의 혼합 용제에 용해한 합성 인디고와 천연 인디고에 대해 HPLC 분석을 실시하였다. 합성인디고와천연인디고의 HPLC 분석결과 6.9 min에 매우 강한 피크가 나타났고 8.3 min에 작은 피크가 추가로 나타났다(Fig. 3). DAD 분석결과 6.
후속연구
- 즉, 중국산 발효쪽 분말이 인디고틴의 함량이 높음에도 염색성이 낮게 나타난 것은 분말의 용해도가 낮았기 때문으로 판단된다. 또한 분말의 입자 크기는 용해도에 영향을 미치는 주요 요인 중의 하나일것으로 판단되며 쪽 분말들의 물리적인 특성에 대해서는 후속연구에서 다루고자 한다.
- 인도산 발효쪽 분말은 진한 쪽빛으로 염색되고 항균성도 중국산에 비해 다소 높은 것으로 나타났는데 이는 쪽의 종자 중 Indigofera tinctoria를 true indigo라고 부르는 것과 무관하지 않은 것으로 사료된다. 생쪽 분말의 경우 색소의 함량이 매우 낮으므로 염색시 발효쪽 분말 대비 더 많은 양의 분말을 사용해야 하며 환원 처리 전에쪽 분말을 물속에서 끓이는 전처리도 염색효과를 높이는데 유용할 것이다.
- 연구결과, 색소 함량과 염색포의 색상은 면직물 기준, 반드시 일치하지는 않으나, 염색포의 항균성은 색소 성분의 함량과 직접적인 연관이 있음을 확인하였다. 인디고틴의 함량이 더 많은 중국산 발효쪽 분말의 경우 예상 외로 면직물에 대한 염 착률이 인도산 발효쪽 분말보다 낮았고 색상이 옅게 염색되었는데 이와 같은 현상이 분말의 입자 크기 등에 기인하는지에 대해서는 후속연구가 필요하다고하겠다. 인도산 발효쪽 분말은 진한 쪽빛으로 염색되고 항균성도 중국산에 비해 다소 높은 것으로 나타났는데 이는 쪽의 종자 중 Indigofera tinctoria를 true indigo라고 부르는 것과 무관하지 않은 것으로 사료된다.
- 문헌고찰에 따라 본 연구의 실험대상인 인도산 발효 쪽과 생쪽 분말은 식물원료가 Indigofera tinctoria일 것으로 여겨지며, 중국산 발효쪽은 Polygonum tinctorium 이 원료일 것으로 여겨진다. 쪽의 성분분석을 다룬 선행연구에서 Polygonum tinctorium이나 Isatis tinctoria 각각에 대한 연구 혹은 두 종자 간을 비교한 연구는 있었으나 인도산인 Indigofera tinctoria와 중국산인 Polygonum tinctorium을 비교분석한 연구는 없는 것을 볼 때 시판 쪽 분말에 대한 분석을 통해 두 종자 간의 색소 함량의 차이도 조사할 수 있을 것으로 사료된다. Indigofera tinctoria와 Polygonum tinctorium에 함유되어 있는 전구체에 대한 선행연구의 결과로 미루어 6종의 쪽 분말 모두 인디칸이 주요 전구체일 것으로 추정되며 인디고틴과 인디루빈이 모두 검출될 것으로 예상된다.
- TLC 분석결과 발효쪽 분말(FI1, FC1)과 합성 인디고(S)는 인디고틴으로 추정되는 청색 색소와 인디루빈으로 추정되는 적색 색소로 전개된 반면 생쪽 분말(R1)은 청색과 적색 색소의 전개가 이루어지지 않았다. 합성 인디고(S)에서도 적색 색소의 전개가 이루어진 것은 의외의 결과로서 염료 합성 혹은 보관 과정에서 인디루빈이 불순물로 생성된 것으로 보이며 HPLC-MS를 이용한 성분분석이 필요한 것으로 사료된다. 발효쪽 분말과 합성 인디고의 경우 전개액이 spotting line으로부터 3.
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