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문제 정의
- 따라서 본 연구의 목적은 난용성 인산염을 가용화 시킬 수 있는 경제적이고, 고효율적인 생물비료의 개발을 위한 것이다. 미생물제제 개발 시에 제제의 균주 생존 안정성이 비교적 우수 미생물인 Bacillus 속을 분리하여 동정하였기에, 선발된 미생물의 배양학적 특성에 따른 난용성 인산가용화를 조사하였다.
- 본 연구에서 확보한 Bacillus subtilis HR-1019 균주를 이용하여 식물생장 조절을 위한 다기능성을 보유한 생장조절제의 개발을 위하여 인산 가용화 능력 이외에도 식물의 병원성 균에 대한 항균 효과의 능력을 검토하였다. 농작물 재배에 피해를 크게 주는 병원균, 잿빛 곰팡이 병원균인 Botrysis cinerea, 줄기썩음 병원균인 Rhizoctonia solani 및 균핵 병원균인 Sclerotinia sclerotiorum 등에 대하여 PDA plate 대치배양법으로 항균력을 조사하였다.
- 0에서 였다. 이러한 결과는 산성과 알칼리의 배지 조건에서도 배양하면서 pH를 저하시키고, 인산염을 가용화 시키는 능력이 우수함으로 보아 다양한 필드 조건에서의 인산염 가용화 효과가 기대되는 균주로 평가되어 진다.
제안 방법
- 콜로니의 모양, 색깔 등으로 보아 바실러스 속으로 보이는 것을 tri-calcium phosphate가 함유된 SM 고체배지 상에 접종하여 배양하였다. 3일 후에 투명대를 관찰하여 비교적 투명대 영역이 분명하게 나타난 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 인산염 첨가 배지에서 유리 인산 생성량이 비교적 높은 수준의 세균을 선발하였으며, 그 중에서 인산가용화 능이 우수한 HR-1019 균주를 계속하여 실험하였다.
- Bacillus subtilis HR-1019의 난용성인산염의 종류에 따른 인산가용화능을 알아보고자 사용한 난용성인산염으로는 TCP (tri-calcium phosphate), hydroxy apatite, aluminum phosphate의 3종류를 사용하였다.
- 4). pH 5.0부터 pH 10.0까지 pH값 1씩 올라가면서 인산가용화능에 따른 pH값 변화를 알아보았다. 하지만 초기 pH값이 현저히 다른 것에 비해 12시간쯤이 되자 거의 모든 조건에서의 pH값이 5.
- 김해시 대동면 인근의 인산집적이 심한 시설 비닐하우스에서 채취한 토양 10 g를 100 ml의 멸균수에 넣고 200 rpm으로 30분 동안 혼합한 후, 희석 평판법으로 6단계까지 희석한 시료를 LB 배지에 도말 하였다. 생성된 콜로니를 0.
- 난용성 인산염 가용화능이 확인된 인산가용화균을 동정하기 위하여 동정을 위하여 멸균된 1.5 ml 원심분리 튜브에 0.5 ml 멸균 생리식염수와 균주를 혼합하여 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하고 상등액을 제거 한 후 16S rDNA를 증폭하기 위해서 두 개의 올리고 뉴클레오타이드 프라이머 5´-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´ (position 9 to 27 E. coli 16s rDNA), 5´-A GAAAGGAGGTGATCCAGCC-3´ (position 1,542 to 1,525 E. coli 16S rDNA)를 이용하였으며, rpoB 유전자의 증폭을 위해서 두 개의 프라이머 5'-AACCAGT TCCTCGTTGGCCTGG-3',5'-CCTGAACAACACGCTCGGA-3'을 사용하였다[10].
- 난용성인산염이 0.5% 첨가된 SM 배지 100 ml에 전배양한 균주 1%를 식균한 후에, 37℃, 160 rpm으로 필요한 시간 동안 진탕 배양한 배양액을 원심분리로 얻어낸 상등액 내의 유리인산 농도와 pH 변화를 일정시간에 측정하였다. 즉, 균체 배양액 1 ml을 소형 튜브에 담은 후 소형원심분리기로 13,000 rpm, 5분간 실온에서 원심분리 하였다.
- 분리 균주를 이용해 농작물 재배에 피해를 크게 주는 병원균, 잿빛 곰팡이 병원균인 Botrysis cinerea, 줄기썩음병원균인 Rhizoctonia solani 및 균핵병원균인 Sclerotinia sclerotiorum 등에 대하여 PDA plate 대치배양법으로 항균력을 조사하였다. 배지에 병원균과 HR-1019 균주를 동시에 접종하여 30℃에서 3-6일간 배양한 후에 저해 정도를 측정하여 항균 스펙트럼을 조사하였다[8, 9]
- 따라서 본 연구의 목적은 난용성 인산염을 가용화 시킬 수 있는 경제적이고, 고효율적인 생물비료의 개발을 위한 것이다. 미생물제제 개발 시에 제제의 균주 생존 안정성이 비교적 우수 미생물인 Bacillus 속을 분리하여 동정하였기에, 선발된 미생물의 배양학적 특성에 따른 난용성 인산가용화를 조사하였다.
- 배양 초기 pH 별 인산가용화능은 6단계의 조건으로 나누어서 실험하였다(Fig. 4). pH 5.
- 분리한 인산가용화균 Bacillus subtilus HR-1019 균주를 배양 온도, 배양액의 pH 및 탄소원의 차이에 따른 난용성 인산염가용화능의 차이를 조사하였다. 배양온도 차이에 따른 영향은 26℃, 30℃, 37℃에서 실시하였고, 배지의 초기 배양 pH에 따른 영향은 pH 5.0, 6.0, 7.0에서 실시하였다. 배지 조성의 차이에 따른 영향은 37℃, 초기배양 pH 6.
- 0에서 실시하였다. 배지 조성의 차이에 따른 영향은 37℃, 초기배양 pH 6.0에서 glucose를 1%, 3%, 5% 농도별로 첨가하여 실시하였다. 균주에 의한 pH 변화와 유리 인산 생성능은 매 12시간마다 측정하였으며, 이상의 배양 환경에 관한 모든 실험은 3회 반복 수행하여 평균값을 구함으로서 실험 오차를 최소화하였다.
- 분리 균주를 이용해 농작물 재배에 피해를 크게 주는 병원균, 잿빛 곰팡이 병원균인 Botrysis cinerea, 줄기썩음병원균인 Rhizoctonia solani 및 균핵병원균인 Sclerotinia sclerotiorum 등에 대하여 PDA plate 대치배양법으로 항균력을 조사하였다. 배지에 병원균과 HR-1019 균주를 동시에 접종하여 30℃에서 3-6일간 배양한 후에 저해 정도를 측정하여 항균 스펙트럼을 조사하였다[8, 9]
- 분리 균주를 이용해 농작물 재배에 피해를 크게 주는 병원균, 잿빛 곰팡이 병원균인 Botrysis cinerea, 줄기썩음병원균인 Rhizoctonia solani 및 균핵병원균인 Sclerotinia sclerotiorum 등에 대하여 PDA plate 대치배양법으로 항균력을 조사하였다. 배지에 병원균과 HR-1019 균주를 동시에 접종하여 30℃에서 3-6일간 배양한 후에 저해 정도를 측정하여 항균 스펙트럼을 조사하였다[8, 9]
- 분리한 인산가용화균 Bacillus subtilus HR-1019 균주를 배양 온도, 배양액의 pH 및 탄소원의 차이에 따른 난용성 인산염가용화능의 차이를 조사하였다. 배양온도 차이에 따른 영향은 26℃, 30℃, 37℃에서 실시하였고, 배지의 초기 배양 pH에 따른 영향은 pH 5.
- 분리한 인산가용화균 Bacillus subtilus HR-1019 균주의 난용성 인산염 종류에 따른 난용성 인산염 가용화능의 차이를 조사하였다. 즉, 3종류의 난용성 인산염, tri-calcium phosphate, hydroxy apatite 및 aluminuim phosphate가 0.
- 김해시 대동면 인근의 인산집적이 심한 시설 비닐하우스에서 채취한 토양 10 g를 100 ml의 멸균수에 넣고 200 rpm으로 30분 동안 혼합한 후, 희석 평판법으로 6단계까지 희석한 시료를 LB 배지에 도말 하였다. 생성된 콜로니를 0.5% tri-calcium phosphate가 함유된 sucrose minimal (SM) 고체배지(sucrose 10 g, HH4NO3 0.27 g, KCl 0.2 g, MgSO4․7H2O 0.1 g, MnSO4․6H2O 1 mg, FeSO4․7H2O 1 mg, Yeast extract 0.1 g, 난용성인산염 5 g, agar 1.2%, H2O/1 l)에 접종하여 27℃, 3일간 배양하여 투명대(clear zone)를 형성하는 균주를 선발하였다[11]. 선발된 균주는 단일 콜로니가 생성되도록 수차례 계대 배양을 실시하였다.
- 2%, H2O/1 l)에 접종하여 27℃, 3일간 배양하여 투명대(clear zone)를 형성하는 균주를 선발하였다[11]. 선발된 균주는 단일 콜로니가 생성되도록 수차례 계대 배양을 실시하였다. 난용성 인산염 가용화능이 확인된 인산가용화균을 동정하기 위하여 동정을 위하여 멸균된 1.
- 우선 분리 균주를 동정하기 위하여 그람 염색, 현미경 관찰 등의 생리 생화학적인 특성으로 포자형성능과 형태적 특성으로 Bacillus 속으로 추정하였다(data not shown). 보다 정확한 유전학적 분류를 보고자 16S rRNA sequencing 분석방법을 통하여 동정을 실시한 결과 본 미생물은 Bacillus subtilis와 98%의 일치성을 나타내어 최종적으로 Bacillus subtilis HR-1019로 동정되었다.
- 분리한 인산가용화균 Bacillus subtilus HR-1019 균주의 난용성 인산염 종류에 따른 난용성 인산염 가용화능의 차이를 조사하였다. 즉, 3종류의 난용성 인산염, tri-calcium phosphate, hydroxy apatite 및 aluminuim phosphate가 0.5% 함유된 SM 배지, pH 6.0에서 12시간마다 분리 균주의 인산가용화능 및 pH변화를 측정하였다.
- coli 16S rDNA)를 이용하였으며, rpoB 유전자의 증폭을 위해서 두 개의 프라이머 5'-AACCAGT TCCTCGTTGGCCTGG-3',5'-CCTGAACAACACGCTCGGA-3'을 사용하였다[10]. 증폭된 16S rRNA유전자의 염기서열을 분석한 후 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm)에서 BLAST 로 검색하여 기존에 보고된 미생물의 16S rRNA와 상동성을 비교하였다.
- cfu 였다. 콜로니의 모양, 색깔 등으로 보아 바실러스 속으로 보이는 것을 tri-calcium phosphate가 함유된 SM 고체배지 상에 접종하여 배양하였다. 3일 후에 투명대를 관찰하여 비교적 투명대 영역이 분명하게 나타난 균주를 선별하였다.
대상 데이터
- 3일 후에 투명대를 관찰하여 비교적 투명대 영역이 분명하게 나타난 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 인산염 첨가 배지에서 유리 인산 생성량이 비교적 높은 수준의 세균을 선발하였으며, 그 중에서 인산가용화 능이 우수한 HR-1019 균주를 계속하여 실험하였다.
- 반면 starch는 24시간까지는 유리인산의 양이 증가하다가 80 ppm 정도에서 더 이상 증가하지 않고 시간이 지남에 따라 점점 떨어졌다. 유리인산의 생성량과 pH 저하 값으로 보았을 때 glucose와 sucroce는 거의 비슷한 활성을 나타내는 결과를 보였으나 사용이 용이한 glucose를 계속적인 가용화 특성 실험에 사용 하였다.
- 원심분리 후 상등액 10 μl을 취하고 여기에 멸균수 90 μl을 첨가하여 총 100 μl이 되게 하고, 여기에 phosphorus reagent 900 μl을 첨가하여 혼합한 후 15분간 실온에서 방치한 다음, 340 nm에서 흡광도를 측정하였다[15]. 이때 실험에 사용한 용액은 Sigma사에서 제조한 phosphate reagent kit를 사용하였다.
성능/효과
- 조금씩 초기 pH값에 따라 값이 다르게 나타났다. 가장 높은 유리 인산 량을 나타낸 처리구는 초기 pH 값이 가장 낮은 pH 5.0이였고, 가장 낮은 유리 인산 양을 나타낸 것은 초기 pH값이 가장 높은 pH 10.0에서 였다. 이러한 결과는 산성과 알칼리의 배지 조건에서도 배양하면서 pH를 저하시키고, 인산염을 가용화 시키는 능력이 우수함으로 보아 다양한 필드 조건에서의 인산염 가용화 효과가 기대되는 균주로 평가되어 진다.
- 0에서 glucose를 1%, 3%, 5% 농도별로 첨가하여 실시하였다. 균주에 의한 pH 변화와 유리 인산 생성능은 매 12시간마다 측정하였으며, 이상의 배양 환경에 관한 모든 실험은 3회 반복 수행하여 평균값을 구함으로서 실험 오차를 최소화하였다.
- 농도가 가장 높은 5%에서 가장 활성이 좋게 나타난다. 그 뒤로 3%와 1% 순으로 나타나는 것이 glucose 양의 농도가 높을수록 인산가용화능이 높게 나타났다. 배양 60 시간에서 최대의 유리인산양을 나타냈으며 5% 농도에서는 약 두배 정도의 높은 값을 계속 유지하였다.
- 0 정도로 42℃와 37℃의 중간 값이고. 또 그 값을 계속해서 유지해 가다 84시간을 기준으로 하여 pH 값이 다소 증가하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 pH 값의 감소로 보았을 때 37℃에서 가장 활성이 좋음을 알 수 있다.
- 그 뒤로 3%와 1% 순으로 나타나는 것이 glucose 양의 농도가 높을수록 인산가용화능이 높게 나타났다. 배양 60 시간에서 최대의 유리인산양을 나타냈으며 5% 농도에서는 약 두배 정도의 높은 값을 계속 유지하였다. 이러한 결과로 보아 사용 균주의 탄소원 농도별 인산가용화능은 농도가 5% 정도까지 높을수록 높게 나타나는 경향 있으나, 배양의 경제적인 조건 등을 고려한 대량 배양 조건의 탐색이 필요할 것으로 보였다.
- 우선 분리 균주를 동정하기 위하여 그람 염색, 현미경 관찰 등의 생리 생화학적인 특성으로 포자형성능과 형태적 특성으로 Bacillus 속으로 추정하였다(data not shown). 보다 정확한 유전학적 분류를 보고자 16S rRNA sequencing 분석방법을 통하여 동정을 실시한 결과 본 미생물은 Bacillus subtilis와 98%의 일치성을 나타내어 최종적으로 Bacillus subtilis HR-1019로 동정되었다.
- Sucrose와 glucose는 전체적으로 비슷한 값을 가진다. 유리인 산의 생성능은 sucrose나 glucose를 탄소원으로 배양한 경우는 인산가용화 값이 배양시간이 경과함에 따라서 조금씩 유리인산의 양이 증가했으며, 그 전체적인 경향이 비슷하게 나타났다. 반면 starch는 24시간까지는 유리인산의 양이 증가하다가 80 ppm 정도에서 더 이상 증가하지 않고 시간이 지남에 따라 점점 떨어졌다.
- 반면 aluminum phosphate 처리구에서는 생성되는 유리인산의 함량이 매우 저조하였다. 이 결과는 분리균주의 인산염 용해 특성이 hydroxyapatite와 TCP를 잘 분해하고, aluminum phosphate에서는 활성을 거의 나타내지 않는 것 같았다.
- 30℃에서도 다소 떨어지기는 하나 높은 인산가용화능을 보였다. 이러한 결과는 pH 값의 감소에 따른 유리인산의 생성능으로 보았을 때는 37℃에서 가장 활성이 좋음을 알 수 있으나, 30℃에서도 활성이 다소 높은 편이여서 균주의 생육 안정성이 높은 점을 고려하면 미생물처리제로의 개발에 매우 유용할 것으로 사료되었다.
- 사용균주는 인산염을 넣고 배양한 배양액이 pH가 많이 감소한 것은 물론 유리인산의 분해능도 우수하였다. 이러한 결과는 기존의 인산가용화능이 우수한 균주에 비하여 다소 떨어지는 능력이나, 균주의 장기보존 안정성이 매우 우수할 것이라는 Bacillus 속이라는 점을 고려하면 매우 긍정적인 결과였다. 따라서 이 균주의 온도 변화에 따른 가용화 능을 시험한 결과는 Fig.
후속연구
- 농작물 재배에 피해를 크게 주는 병원균, 잿빛 곰팡이 병원균인 Botrysis cinerea, 줄기썩음 병원균인 Rhizoctonia solani 및 균핵 병원균인 Sclerotinia sclerotiorum 등에 대하여 PDA plate 대치배양법으로 항균력을 조사하였다. 그 결과로 잿빛 곰팡이 병원균인 Botrysis cinerea, Rhizoctonia solani 및 Sclerotinia sclerotiorum의 3종의 균주에 대하여 실험한 결과 Fig. 6에서와 같이 병원균의 생육을 저지하는 분명한 생육저지의 clear zone을 보였고, 이는 Bacillus subtilis HR-1019 균주가 인산 가용화 능력 이외에도 식물의 일부 병원성 균에 대한 항균 효과를 가진 것으로 판명되어서 HR 1019를 이용하여 미생물제제를 개발하면 인산가용화를 통한 식물생장촉진과 식물병의 저해 효과에도 크게 도움이 될 것으로 보여 효과적인 제품개발이 가능할 것으로 생각되어진다. 이러한 항균성은 Bacillus sp.
- 배양 60 시간에서 최대의 유리인산양을 나타냈으며 5% 농도에서는 약 두배 정도의 높은 값을 계속 유지하였다. 이러한 결과로 보아 사용 균주의 탄소원 농도별 인산가용화능은 농도가 5% 정도까지 높을수록 높게 나타나는 경향 있으나, 배양의 경제적인 조건 등을 고려한 대량 배양 조건의 탐색이 필요할 것으로 보였다.
- niger 등이 있다[6, 14, 20]. 환경보전을 위한 노력으로 화학비료에 대한 제약이 심화될 것으로 판단되기 때문에 난용성 인산염을 효율적으로 분해하여 인산질 비료 성분을 충분히 공급해줄 수 있는 토양미생물의 탐색과 생물 비료의 개발은 시급히 해결해야 할 과제다. 그러나 알려진 인산가용화 세균을 이용한 미생물비료의 개발 시에는 장기간 안정적인 생존 상태를 유지시키기가 어려운 것들이 알려져 있다[1, 2, 5, 15, 16, 19].
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