선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 분리균주 Paenibacillus sp. CK214의 swarming 운동능력에 영향을 미치는 인자를 연구하던 중 glucose가 첨가된 조건에서 운동능력이 급격히 저하됨을 확인하였으며, glucose와 운동성 또는 운동성에 있어서 중요한 인자인 편모의 발현과의 상관관계를 파악하기 위한 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 박테리아의 flagellation은 이러한 filament의 길이 신장을 의미한다. CK214 균주의 flagellin과 관련된 이후 연구를 위해 flagellin 특이적 다클론항체를 필요로 하였다. Flagellin은 여러 종류의 균주들에서 N-말단과 C-말단 쪽에 잘 보존된 나선형의 영역을 가지고 있기 때문에 유전자 정보가 알려지지 않은 CK214의 flagellin 특이적 다클론항체를 생산하기 보다는 유전자 서열이 잘 알려진 Edwardsiella tarda의 flagellin 특이적 다클론항체를 생산하기로 하였다.
- 0% (w/v)의 농도로 첨가하였다. CK214 균주의 각 조건에 따른 운동성은 고체평판배지에서 이동한 지름의 길이(mm)를 재어 측정하였다. CK214 균주의 이동이 완전한 원형의 모습이 아닌 경우, 가장 멀리 이동한 거리를 측정하여 기록하였다.
- typhimurium과 비교하였을 때 이동 거리가 약 5배로 매우 높은 운동성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다[14]. CK214 균주의 운동성에 영향을 미치는 환경 인자를 알기 위해 다양한 조건에서의 운동성을 관찰하였다(data not shown). 그 결과, 0.
- CK214 균주의 각 조건에 따른 운동성은 고체평판배지에서 이동한 지름의 길이(mm)를 재어 측정하였다. CK214 균주의 이동이 완전한 원형의 모습이 아닌 경우, 가장 멀리 이동한 거리를 측정하여 기록하였다.
- Glucose 첨가에 의한 CK214의 운동성 결여가 균체의 생육 정체에 의한 것은 아닌지 구별하기 위하여 glucose 조건에 따른 CK214의 생장 변화를 측정하였다. CK214 전배양액을 각 농도의 glucose가 포함된 0.1%의 농도로 접종한 후 37℃ (200 rpm)에서 배양하면서 6 시간 간격으로 파장 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 그 정도를 생장정도로 판단하였다. Glucose 농도에 따라서 성장 정도는 약간 감소하였지만 전반적으로 일정 수준 이상의 성장 정도를 유지하였다(Fig.
- CK214의 filament 구성 단백질인 flagellin을 확인하기 위해 1.5% (w/v) LB agar 평판배지에서 배양한 CK214 균체를 0.85% NaCl 용액에 현탁한 후 격렬한 pipetting으로 편모의 filament를 균체로부터 분리하였다. 분리된 filament 단백질은 원심분리 후의 상등액에 존재하며, 이를 SDS-PAGE로 확인한 결과, 약 29 kDa의 단일 단백질 밴드가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
- tarda와 Paenibacillus flagellin 단백질에 대한 항원-항체 반응에서 공통된 epitope으로써 작용할 가능성이 매우 높다는 것을 시사한다. E. tarda flagellin 특이적 다클론항체를 생산하기 위해서 항원인 flagellin 단백질을 대장균에서 대량 생산하였으며, 여러 단계의 생화학적 분리과정을 통해 정제한 flagellin 단백질을 토끼에 피하 주사하였다. 토끼로부터 얻은 혈액으로부터 혈청을 분리한 후 immunoblotting을 통해 flagell 단백질에 대한 다클론성 항체가 생성되었는지를 확인한 결과, immunoblotting에 사용할 수 있을 만큼 충분한 면역 활성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다(data not shown).
- Flagellin은 여러 종류의 균주들에서 N-말단과 C-말단 쪽에 잘 보존된 나선형의 영역을 가지고 있기 때문에 유전자 정보가 알려지지 않은 CK214의 flagellin 특이적 다클론항체를 생산하기 보다는 유전자 서열이 잘 알려진 Edwardsiella tarda의 flagellin 특이적 다클론항체를 생산하기로 하였다. E. tarda의 flagellin 단백질에 특이적인 다클론항체를 생산하기에 앞서 E. tarda flagellin 서열과 여러 Paenibacillus 종들의 flagellin 단백질 서열의 N-말단과 C-말단 영역을 각각 CLC 소프트웨어를 통해 비교하여 각각의 flagellin N-말단과 C-말단 영역에서 높은 상동성을 보이는 부분을 확인하였다(Fig. 4). 또한 CLC 소프트웨어의 항원성 예측 프로그램을 이용하여 E.
- CK214 균주의 flagellin과 관련된 이후 연구를 위해 flagellin 특이적 다클론항체를 필요로 하였다. Flagellin은 여러 종류의 균주들에서 N-말단과 C-말단 쪽에 잘 보존된 나선형의 영역을 가지고 있기 때문에 유전자 정보가 알려지지 않은 CK214의 flagellin 특이적 다클론항체를 생산하기 보다는 유전자 서열이 잘 알려진 Edwardsiella tarda의 flagellin 특이적 다클론항체를 생산하기로 하였다. E.
- 1). Glucose 첨가에 의한 CK214의 운동성 결여가 균체의 생육 정체에 의한 것은 아닌지 구별하기 위하여 glucose 조건에 따른 CK214의 생장 변화를 측정하였다. CK214 전배양액을 각 농도의 glucose가 포함된 0.
- 각 균주의 flagellin-N과 flagellin-C 아미노산 서열은 NCBI Protein database에서 획득하였다. 각 flagellin 아미노산 서열의 상동성은 CLC Protein Workbench 5 소프트웨어(CLC bio, Denmark)를 이용하여 비교하였다.
- 균주 현탁액을 grid에 부착시키고 1% (w/v) uranyl acetate로 1 분간 염색한 후 투과전자현미경(TEM, H-7600, HITACHI, 부산대학교 공동실험 실습관)을 사용하여 균체를 관찰하였다(×10,000-25,000).
- 5% (w/v) glucose를 첨가한 고체배지에서 CK214균주를 배양하였다. 배양된 각각의 균체를 0.85% NaCl 용액에 현탁한 후 초음파발생장치(B. Braun Biotech)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄된 균체로부터 획득한 CK214 전체 단백질을 SDS-PAGE로 확인하였으며, E.
- 이를 확인하기 위해 glucose 조건에 따른 CK214 균주의 flagellin 단백질의 발현을 단백질 수준에서 관찰하였다. 배지 중의 glucose의 농도차이에 따른 CK214 균주의 전체 단백질을 획득하기 위해 1.5% (w/v) LB agar 평판 배지와 0.5% (w/v) glucose를 첨가한 고체배지에서 CK214균주를 배양하였다. 배양된 각각의 균체를 0.
- 용해된 단백질 시료들을 95℃에서 5 분동안 가열한 후, 비연속적 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 분리된 단백질들을 Coomassie brilliant blue G-250 (Sigma)을 통한 염색과 2시간 동안의 탈색 과정을 통해 밴드로서 확인하였다.
- 고체 표면에서의 swarming 운동 시에는 높은 표면마찰과 점성을 극복해야 하기 때문에 편모의 역할이 더욱 더 중요시된다[9]. 우리는 glucose에 의한 CK214 균주의 운동성 상실이 flagella와 연관되었을 것이라 생각하고 glucose 조건에 따른 CK214 균주의 flagellation을 투과전자현미경을 통해 관찰하였다. 1.
- 운동성은 2 ml LB 액체배지에서 12 시간 배양한 CK214 배양액 5 μl를 1.0% (w/v) LB agar 평판배지에 떨어뜨린 후 37℃ 에서 20 시간동안 배양하면서 관찰하였다.
- 분리된 filament 단백질은 원심분리 후의 상등액에 존재하며, 이를 SDS-PAGE로 확인한 결과, 약 29 kDa의 단일 단백질 밴드가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이 단백질 밴드가 CK214 균주의 flagellin 단백질인지 확인하기 위해 앞에서 언급한 과정을 통해 생산한 E. tarda flagellin 특이적 다클론항체를 이용하여 immunoblotting을 수행하였으며, 단일 단백질과 E. tarda flagellin 특이적 다클론 항체간의 면역반응을 확인하였다(Fig. 5).
- 앞서 glucose가 CK214의 flagellation을 방해한다는 것을 확인하였으며, glucose가 편모를 형성하는 구성 단백질의 합성이나 분비, 조립과 관련한 유전자 조절에 직/간접적으로 관여할 것이라 예상하였다. 이를 확인하기 위해 glucose 조건에 따른 CK214 균주의 flagellin 단백질의 발현을 단백질 수준에서 관찰하였다. 배지 중의 glucose의 농도차이에 따른 CK214 균주의 전체 단백질을 획득하기 위해 1.
- Braun Biotech)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄된 균체로부터 획득한 CK214 전체 단백질을 SDS-PAGE로 확인하였으며, E. tarda의 flagellin 단백질 특이적 항체를 이용하여 각 조건에서 생장한 CK214 균주에서 발현되는 flagellin 단백질을 비교하였다. 그 결과, glucose가 첨가된 조건에서 생장한 CK214 균주에서의 flagellin 단백질 발현이 glucose가 없는 조건일 때에 비해 감소하는 것을 확인하였다(Fig.
대상 데이터
- 각 균주의 flagellin-N과 flagellin-C 아미노산 서열은 NCBI Protein database에서 획득하였다. 각 flagellin 아미노산 서열의 상동성은 CLC Protein Workbench 5 소프트웨어(CLC bio, Denmark)를 이용하여 비교하였다.
성능/효과
- 우리는 glucose에 의한 CK214 균주의 운동성 상실이 flagella와 연관되었을 것이라 생각하고 glucose 조건에 따른 CK214 균주의 flagellation을 투과전자현미경을 통해 관찰하였다. 1.0% (w/v) LB agar 평판배지에서 배양한 CK214 균주의 경우 단일 세포 주위에서 나타난 여러 개의 주모성 편모를 확인할 수 있었지만, 반면에 0.5% (w/v) glucose가 첨가된 조건의 CK214 균주에서는 주모성 편모가 거의 나타나지 않았다(Fig. 3). 이 결과를 통해 glucose에 의한 CK214 균주의 운동성 상실은 편모의 flagellation 저해에 의한 현상이라 예상할 수 있었으며, 편모를 구성하는 단백질 발현 변화에 대한 연구가 필요하다고 판단하였다.
- 이전 연구 결과, Paenibacillus sp. CK214는 1.0% (w/v) LB agar 평판배지에서 가장 높은 swarming 운동 능력을 나타내었으며(지름 약 80 mm) S. typhimurium과 비교하였을 때 이동 거리가 약 5배로 매우 높은 운동성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다[14]. CK214 균주의 운동성에 영향을 미치는 환경 인자를 알기 위해 다양한 조건에서의 운동성을 관찰하였다(data not shown).
- TBS로 수 회 세척한 membrane에 2차 항체인 peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma)를 5% skim milk/TBS에 1:2000의 비율로 희석하여 2 시간 동안 반응시켰다. TBS로 수 회 세척한 membrane의 flagellin 단백질 밴드를 H2O2 (Sigma)와 4-chloro-1-naphthol (Sigma)이 포함된 용액에서 자주색의 침착물이 생성되는 것으로 확인하였다. 반응은 다량의 증류수 세척을 통해 중지시켰다.
- CK214 균주의 운동성에 영향을 미치는 환경 인자를 알기 위해 다양한 조건에서의 운동성을 관찰하였다(data not shown). 그 결과, 0.05-1.0% (w/v) glucose가 첨가된 환경에서 그 운동성이 급격히 감소하고, 0.2% (w/v) 이상의 glucose 조건에서는 운동성을 완전히 상실한다는 것을 알 수 있었다(Fig. 1). Glucose 첨가에 의한 CK214의 운동성 결여가 균체의 생육 정체에 의한 것은 아닌지 구별하기 위하여 glucose 조건에 따른 CK214의 생장 변화를 측정하였다.
- tarda의 flagellin 단백질 특이적 항체를 이용하여 각 조건에서 생장한 CK214 균주에서 발현되는 flagellin 단백질을 비교하였다. 그 결과, glucose가 첨가된 조건에서 생장한 CK214 균주에서의 flagellin 단백질 발현이 glucose가 없는 조건일 때에 비해 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 6). 예상했던 바와 같이 glucose 첨가 조건에서의 CK214 균주의 운동성 결여는 운동기관인 편모의 구성 단백질 발현 자체의 감소에 의한 것으로 확인되었다.
- 4). 또한 CLC 소프트웨어의 항원성 예측 프로그램을 이용하여 E. tarda와 여러 Paenibacillus 종들의 flagellin 서열을 분석하여 높은 항원성을 가지는 영역을 예측하였을 때 공통적으로 높은 항원성을 나타내는 N-말단 부분이 존재함을 확인하였으며, 이는 N-말단의 상동부분과도 일치하였다 (data not shown). 이러한 bioinformatics 결과는 N-말단 영역이 E.
- 85% NaCl 용액에 현탁한 후 격렬한 pipetting으로 편모의 filament를 균체로부터 분리하였다. 분리된 filament 단백질은 원심분리 후의 상등액에 존재하며, 이를 SDS-PAGE로 확인한 결과, 약 29 kDa의 단일 단백질 밴드가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이 단백질 밴드가 CK214 균주의 flagellin 단백질인지 확인하기 위해 앞에서 언급한 과정을 통해 생산한 E.
- 6). 예상했던 바와 같이 glucose 첨가 조건에서의 CK214 균주의 운동성 결여는 운동기관인 편모의 구성 단백질 발현 자체의 감소에 의한 것으로 확인되었다. 이는 아마도 glucose가 관여하는 carbon catabolite repression (CCR)이 작용하였을 것이라 생각된다.
- tarda와 여러 Paenibacillus 종들의 flagellin 서열을 분석하여 높은 항원성을 가지는 영역을 예측하였을 때 공통적으로 높은 항원성을 나타내는 N-말단 부분이 존재함을 확인하였으며, 이는 N-말단의 상동부분과도 일치하였다 (data not shown). 이러한 bioinformatics 결과는 N-말단 영역이 E. tarda와 Paenibacillus flagellin 단백질에 대한 항원-항체 반응에서 공통된 epitope으로써 작용할 가능성이 매우 높다는 것을 시사한다. E.
- tarda flagellin 특이적 다클론항체를 생산하기 위해서 항원인 flagellin 단백질을 대장균에서 대량 생산하였으며, 여러 단계의 생화학적 분리과정을 통해 정제한 flagellin 단백질을 토끼에 피하 주사하였다. 토끼로부터 얻은 혈액으로부터 혈청을 분리한 후 immunoblotting을 통해 flagell 단백질에 대한 다클론성 항체가 생성되었는지를 확인한 결과, immunoblotting에 사용할 수 있을 만큼 충분한 면역 활성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다(data not shown).
후속연구
- Bacillus와 함께 Firmicutes에 속하는 Paenbacillus sp. CK214의 glucose에 의한 운동성의 감소와 flagellin 단백질의 발현 감소는 CcpA와 관련한 CCR 억제자에 의해 직접적인 음성 조절이 이루어 질 것이라 생각되며 이에 관한 차후 연구가 이루어져야 한다.
- 3). 이 결과를 통해 glucose에 의한 CK214 균주의 운동성 상실은 편모의 flagellation 저해에 의한 현상이라 예상할 수 있었으며, 편모를 구성하는 단백질 발현 변화에 대한 연구가 필요하다고 판단하였다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.