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문제 정의
- 현재 섬유소 분해효소를 생산하는 세균에 대한 연구가 많이 진행되고는 있지만 산업화되어 이용되고 있지는 않은 실정이다. 따라서 본 연구에서는 초본계 식물을 먹이로 하는 초식동물의 배설물로부터 섬유소 분해효소를 생산하는 균주를 분리동정하고자 하였다. 또한 섬유질 분해효소를 생산하는 분리 균주의 최적 효소생산조건을 구명함으로써 국내 바이오에탄올 생산관련 분야의 발전에 기여하고자 한다.
- 따라서 본 연구에서는 초본계 식물을 먹이로 하는 초식동물의 배설물로부터 섬유소 분해효소를 생산하는 균주를 분리동정하고자 하였다. 또한 섬유질 분해효소를 생산하는 분리 균주의 최적 효소생산조건을 구명함으로써 국내 바이오에탄올 생산관련 분야의 발전에 기여하고자 한다.
- 본 연구는 초본계 바이오매스를 이용한 바이오에탄올 생산공정에서 필요한 당화효소생산을 위하여 수행되었다. 효소를 생산하는 균주의 선발을 위해 59종의 초식 동물 배설물로부터 균주를 분리하고 congo red 염색법으로 섬유소 분해활성이 있는 균주를 1차 선발한 후, DNS 방법으로 효소의 활성을 측정하여 활성이 우수한 균을 2차 선발하였다.
- 본 연구는 초본계 바이오매스의 당화효소 개발을 위해 초식성 동물의 배설물을 서울대공원으로부터 분양받아 이들로부터 섬유소 분해능이 우수한 미생물을 분리, 선별, 동정하고자하였다. Table 1은 초식동물 10과 59종에 대한 배설물로부터 분리된 균주들을 탄소원이 CMC로 대체된 YPD 배지에 접종 배양한 후 congo red 염색을 통해 clear zone 형성이 우수한 24개의 균주들을 1차 선별한 결과이다.
제안 방법
- H9-1 균주의 동정을 위해 PCA 배지에 균을 배양한 후 형태학적 특성과 생화학적 특성을 알아보았다(Table 2, Table 3). 분리균주는 glycerol, L-arabinose, D-ribose, D-xylose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, inositol, D-mannitol, D-sorbitol, methyl αD-glucopyranoside, amygdalin, esculin ferric citrate, salicin, D-cellobiose, D-maltose, D-lactose, D-saccharose, D-trehalose, D-raffinose, amidon, glycogen, gentiobiose 등의 탄수화물을 이용하여 생육하였으며 이외의 탄수화물은 이용하지 못함을 확인하였다.
- Bacillus sp. H9-1 균주의 효소 생산 특성을 알아보기 위해 균의 배양온도와 배지의 초기 pH, 배양 시간에 대한 영향을 조사하였다. Fig.
- 마지막으로 유전자 염기서열 분석을 위해 균을 액체 배양한 후 genomic DNA extraction kit (DyneBio, Korea)로 genomic DNA를 추출하고, 16S rDNA universal primer를 이용 하여 PCR을 수행 하였다. PCR product를 T-easy vector 에 ligation 후 형질전환 재조합 균주를 선발 하고 plasmid 추출 후 HindIII, BglII로 DNA 크기를 확인하고 ㈜마크로젠(Daejeon, Korea)에 sequence 분석을 의뢰하였다. 분석된 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 상동성을 분석하고 Clustal X software version 1.
- 선발 균주의 생화학적 특성 분석은 API 50 CHB kit (bioMerieux Vitek, France)를 이용하여 수행되었다. 마지막으로 유전자 염기서열 분석을 위해 균을 액체 배양한 후 genomic DNA extraction kit (DyneBio, Korea)로 genomic DNA를 추출하고, 16S rDNA universal primer를 이용 하여 PCR을 수행 하였다. PCR product를 T-easy vector 에 ligation 후 형질전환 재조합 균주를 선발 하고 plasmid 추출 후 HindIII, BglII로 DNA 크기를 확인하고 ㈜마크로젠(Daejeon, Korea)에 sequence 분석을 의뢰하였다.
- 85% NaCl 용액에 현탁 희석하여 PCA (plate count agar) 배지에 100 µL를 도말한 후 37℃에서1일 혹은 2일 배양하였다. 배양된 배지에서 분리된 colony들을 변형된 YPD (yeast extract, bacto-peptone, 1% CMC) 고체 배지에 계대 배양한 후 congo red 염색을 통해 활성이 있는 균주를 선별하였다.
- 배양온도에 대한 균주의 효소 생산 및 효소 활성의 측정을 위해 1% CMC를 함유한 액체배지 100 mL에 종균 2 mL을 접종하고, 배양 온도를 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃로 달리하면서 150 rpm으로 24 시간 배양하였다. 배양액은 원심분리 (15,000 rpm, 10 min, 4℃) 한 후 상등액만을 조효소로 사용하여 DNS법 [20]으로 효소의 당화정도를 측정하여 알아보았다. 선발 균주의 초기 pH 영향은 1% CMC를 함유한 액체배지에 0.
- 배양온도 및 배지의 초기 pH에 따른 균주의 효소 생산과 효소 활성정도를 알아보기 위하여 변형된 YPD(yeast extract, bacto-peptone, 1% CMC) 액체배지에 고체배지에서 배양된 H9-1 균주를 접종 배양하여 종균으로 사용하였다. 배양온도에 대한 균주의 효소 생산 및 효소 활성의 측정을 위해 1% CMC를 함유한 액체배지 100 mL에 종균 2 mL을 접종하고, 배양 온도를 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃로 달리하면서 150 rpm으로 24 시간 배양하였다.
- 배양온도 및 배지의 초기 pH에 따른 균주의 효소 생산과 효소 활성정도를 알아보기 위하여 변형된 YPD(yeast extract, bacto-peptone, 1% CMC) 액체배지에 고체배지에서 배양된 H9-1 균주를 접종 배양하여 종균으로 사용하였다. 배양온도에 대한 균주의 효소 생산 및 효소 활성의 측정을 위해 1% CMC를 함유한 액체배지 100 mL에 종균 2 mL을 접종하고, 배양 온도를 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃로 달리하면서 150 rpm으로 24 시간 배양하였다. 배양액은 원심분리 (15,000 rpm, 10 min, 4℃) 한 후 상등액만을 조효소로 사용하여 DNS법 [20]으로 효소의 당화정도를 측정하여 알아보았다.
- H9-1균주는 섬유소 분해능이 있으며 colony의 모양이 불균일하고 불투명한 그램 양성의 간균임을 확인할 수 있었다. 분리균의 계통학적 유연관계를 조사하기 위하여 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. Fig.
- 형태학적 특성은 균주를 PCA 배지에 접종 배양한 후 관찰하였다. 선발 균주의 생화학적 특성 분석은 API 50 CHB kit (bioMerieux Vitek, France)를 이용하여 수행되었다. 마지막으로 유전자 염기서열 분석을 위해 균을 액체 배양한 후 genomic DNA extraction kit (DyneBio, Korea)로 genomic DNA를 추출하고, 16S rDNA universal primer를 이용 하여 PCR을 수행 하였다.
- 배양액은 원심분리 (15,000 rpm, 10 min, 4℃) 한 후 상등액만을 조효소로 사용하여 DNS법 [20]으로 효소의 당화정도를 측정하여 알아보았다. 선발 균주의 초기 pH 영향은 1% CMC를 함유한 액체배지에 0.1 N-1 N HCl과 0.1 N-1 N NaOH 시약을 이용하여 pH 를 4에서 10으로 배지를 조정한 후 멸균하여 종균을 접종 배양하고 조효소의 당화정도를 DNS법으로 측정하여 확인하였다.
- H9-1로 명명하였다. 선발 균주의 효소 생산 최적화를 위해 배양 온도와 초기 배지 pH를 최적화 하였다. 최적조건은 배양온도 40℃, 초기 배지 pH 8, 배양시간 48 hr이며, 최적효소활성은 0.
- 선발된 균주의 동정은 형태학적 특성 조사, 생화학적 특성 분석, 16S rDNA 염기 서열 분석을 통해 이루어졌다. 형태학적 특성은 균주를 PCA 배지에 접종 배양한 후 관찰하였다.
- 선발된 균주의 동정은 형태학적 특성 조사, 생화학적 특성 분석, 16S rDNA 염기 서열 분석을 통해 이루어졌다. 형태학적 특성은 균주를 PCA 배지에 접종 배양한 후 관찰하였다. 선발 균주의 생화학적 특성 분석은 API 50 CHB kit (bioMerieux Vitek, France)를 이용하여 수행되었다.
- 반응이 끝난 후 즉시 DNS (Dinitrosalicylic acid) 3 mL을 첨가 하고, 100℃에서 5분간 반응시킨 후 증류수 20 mL을 첨가하여 냉각시키고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 환원당 정량을 위하여 glucose를 표준당으로 0.1~1.0 g/mL 범위의 정량곡선을 작성하였다. 이때 효소의 활성은 IU (International Unit)로 나타내었으며, 1분 동안 1 µmol의 glucose를 생성하는 효소의 양으로 정의한다.
- 본 연구는 초본계 바이오매스를 이용한 바이오에탄올 생산공정에서 필요한 당화효소생산을 위하여 수행되었다. 효소를 생산하는 균주의 선발을 위해 59종의 초식 동물 배설물로부터 균주를 분리하고 congo red 염색법으로 섬유소 분해활성이 있는 균주를 1차 선발한 후, DNS 방법으로 효소의 활성을 측정하여 활성이 우수한 균을 2차 선발하였다. 토끼의 배설물에서 분리된 H9-1 균주가 배양 6일째 0.
- 효소의 활성은 Ghose [19]의 실험을 변형하여 측정하였다. 원심분리한 조효소 상등액 0.
대상 데이터
- Congo red 염색에서 활성을 보인 균주들 중에서 섬유소 분해 활성이 우수한 균주의 2차 선발을 위하여 탄소원으로 1% CMC를 함유한 변형된 100 mL YPD 액체배지에 분리균주를 접종 배양 (37℃, 150 rpm)하고 원심분리 (15,000 rpm, 10 min, 4℃) 한 후 상등액만을 따로 취하여 조효소로 사용하였다.
- 초식동물의 배설물에서 섬유소 분해활성이 있는 균을 분리하기 위해 서울대공원(Gyeonggi-Do, Korea)으로부터 소과(25종), 사슴과 (14종), 낙타과 (4종), 기린과 (1종), 코끼리과(1종), 말과 (6종), 캥거루과 (4종), 하마과 (2종), 토낏과 (1종), 코뿔솟과(1종) 등 총 10과(59종)에 대한 배설물을 분양받았다.
이론/모형
- PCR product를 T-easy vector 에 ligation 후 형질전환 재조합 균주를 선발 하고 plasmid 추출 후 HindIII, BglII로 DNA 크기를 확인하고 ㈜마크로젠(Daejeon, Korea)에 sequence 분석을 의뢰하였다. 분석된 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 상동성을 분석하고 Clustal X software version 1.81을 통해 phylogenetic tree를 작성하였다.
성능/효과
- 2는 H9-1 균주의 congo red 염색을 통한 효소 활성과 그램염색의 결과이다. H9-1균주는 섬유소 분해능이 있으며 colony의 모양이 불균일하고 불투명한 그램 양성의 간균임을 확인할 수 있었다. 분리균의 계통학적 유연관계를 조사하기 위하여 16S rDNA 염기서열을 분석하였다.
- 본 연구에서 분리한 H9-1 균주는 중성과 약알칼리조건에서 효소 활성이 우수한 균주로서, 분리균주 Bacillus sp. H9-1로부터 생산된 효소는 바이오에탄올 생산을 위하여 약알칼리로 전처리하는 초본계 바이오매스를 당화시키는 데 유리한 효소임을 확인하였다.
- 섬유질계 바이오매스의 당화를 위한 전처리에는 acid, alkaline, steam explosion, wet oxidation 등의 방법이 이용되고 있으며, 초본계의 경우 glucan 과 xylose 수득면에서 NaOH 처리 등의 알칼리 처리가 효과적이다고 보고되었다 [16-18]. 따라서 본 연구에서 동정된 Bacillus sp H9-1의 경우 초기 pH 8에서 최적 활성을 보이고 있어 초본계 바이오매스의 당화에 적합하리라 사료된다.
- 04 IU로 섬유소 분해활성이 H9-1 균주보다 낮았다. 또한 H9-1 균주의 효소 활성은 배양 2일째부터 우수하게 나타나 초본계 바이오매스 당화 효소로의 가능성을 확인 할 수 있었다. Feng et al.
- 분리균주는 glycerol, L-arabinose, D-ribose, D-xylose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, inositol, D-mannitol, D-sorbitol, methyl αD-glucopyranoside, amygdalin, esculin ferric citrate, salicin, D-cellobiose, D-maltose, D-lactose, D-saccharose, D-trehalose, D-raffinose, amidon, glycogen, gentiobiose 등의 탄수화물을 이용하여 생육하였으며 이외의 탄수화물은 이용하지 못함을 확인하였다.
- Table 1은 초식동물 10과 59종에 대한 배설물로부터 분리된 균주들을 탄소원이 CMC로 대체된 YPD 배지에 접종 배양한 후 congo red 염색을 통해 clear zone 형성이 우수한 24개의 균주들을 1차 선별한 결과이다. 이후 1차 선별된 각 균주들의 배양액을 조효소로 사용하여 DNS법을 이용한 효소활성 측정 결과, H9-1, H12-2, H13-1의 활성이 다른 균주들에 비해 우수하게 나타났다 (data not shown). Fig.
- 1은 활성이 우수한 H9-1, H12-2, H13-1 균주들의 배양시간에 따른 효소활성과 기존의 섬유소 분해활성이 있다고 알려진 Cellulomonas gelida 등 5개의 균주들을 농촌진흥청 농업유전자원센터로부터 분양받아 효소 활성정도를 비교한 결과이다. 토끼의 배설물에서 분리된 H9-1 균주가 배양 6일째 0.16 IU로 가장 높은 활성을 보였으며, 기존의 섬유소 분해능이 있다고 알려진 균주들의 활성은 0.04 IU로 섬유소 분해활성이 H9-1 균주보다 낮았다. 또한 H9-1 균주의 효소 활성은 배양 2일째부터 우수하게 나타나 초본계 바이오매스 당화 효소로의 가능성을 확인 할 수 있었다.
후속연구
- 따라서 본 연구에서 분리된 Bacillus sp. H9-1균주의 경우 좀 더 낮은 온도에서 효소 활성을 보이므로 당화과정에서 사용될 에너지 절감에 더 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 18 IU로 가장 높게 나타났다. 또한 pH 5-9 범위에서도 0.11 IU 이상의 비교적 높은 활성을 보여 산 또는 알칼리 용매로 가수분해하여 약산성이나 약알칼리성을 띄는 섬유질계 바이오매스를 당화하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 섬유질계 바이오매스를 이용하여 바이오에탄올 생산을 위해서는 섬유소의 당으로의 전환이 필요하며 이 공정에서 섬유소 분해효소가 이용된다.
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