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문제 정의
- 본 연구는 원유의 내냉성 미생물의 계절별 분포에 관해 조사하기 위해서 수행하였다. 내냉성 미생물은 최적 생장 온도가 30℃ 근처이지만, 7℃ 이하에서도 생존가능한 균으로 Pseudomonas, Achromobacter, Aeromonas 속 등이 있다.
- , 1966), Flavobacterium(Andrey and Frazier, 1959), Serratia (Ingraham, 1962) 등이 있다. 본 연구의 목적은 원유에 존재하는 계절별 및 지역별 내냉성 미생물의 분포 및 종류를 조사하기 위해서 수행하였다.
제안 방법
- PCR product를 2% agarose gel에 4 μL를 loading하여 100 V에서 2분 동안 전기영동하여 band를 확인하였다.
- PCR은 MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Applied Biosystems) 를 사용하였으며 (Table 1), 15 μL PCR master mix와 15 λ의 DNA templete를 넣고 반응시켰다.
- 모든 과정이 끝난 반응물 10 μL와 10 μL의 Hi-Di Formamide(Applied Biosystems)를 혼합하여 POP 6 polymer와 4×50 cm capillary를 장착한 3130 genetic analyzer(Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다.
- 지역별 결과는 무작위로 A, B, C, D, E, F, G, H, I 지역으로 표기하였으며, 확보한 시료는 멸균생리식염수에 각 농도별로 희석하여 Standard methods(Wehr and Frank, 2004)에 따라 Plate count agar(Becton, Dickson and Company, Sparks, MD, USA)를 이용하여 7℃에서 10일 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 각 원유시료의 총 내냉성미생물의 균수를 측정하였으며, 그 중 무작위로 colony를 선택하여 최소 3번 이상 plate에 계대배양하여 단일 colony를 취하였다. 지역별로 20개의 colony를 취하여, 총 9개 지역에서 한 계절에 총 180개의 균을 분리배양하였으며, 사계절, 9개 지역으로부터 총 720개의 균을 분리하여 동정에 사용하였다.
- 1). 이 결과는 Elionora와 Malka(2007)의 연구와도 유사한 결과로 나타났는데, 이 연구진들은 이스라엘에서 1월, 4월, 7월 및 9월에 집유한 원유로부터 내냉성 미생물과 중온성 미생물을 분리하여 균수를 측정하여 비교하였다. 실험 결과는 본 연구와 유사하게 계절적 변이를 보였으며, 겨울철 원유에서 가장 높은 수준의 균수가 검출되었고, 봄철 원유에서 가장 낮은 수준의 균수가 검출되었다.
- 계절별로 원유는 경기 동부, 경기 동남부, 경기 동북부, 경기 서부, 경기남부, 경기북부, 경기중부, 안산, 경인지역 목장으로부터 공급받았으며, 시료는 냉장보관하였고 실험을 수행하기까지 2일이 넘지 않도록 하였다. 지역별 결과는 무작위로 A, B, C, D, E, F, G, H, I 지역으로 표기하였으며, 확보한 시료는 멸균생리식염수에 각 농도별로 희석하여 Standard methods(Wehr and Frank, 2004)에 따라 Plate count agar(Becton, Dickson and Company, Sparks, MD, USA)를 이용하여 7℃에서 10일 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 각 원유시료의 총 내냉성미생물의 균수를 측정하였으며, 그 중 무작위로 colony를 선택하여 최소 3번 이상 plate에 계대배양하여 단일 colony를 취하였다.
- PCR product를 2% agarose gel에 4 μL를 loading하여 100 V에서 2분 동안 전기영동하여 band를 확인하였다. 확인한 PCR product는 남은 dNTP와 primer를 제거하기 위해 ExoSAP-IT (USB, Cleveland, Ohio, USA)으로 세척한 뒤, Microseq 16S rDNA bacterial 500 Sequencing Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 sequencing 하였다 (Table 2). 모든 과정이 끝난 반응물 10 μL와 10 μL의 Hi-Di Formamide(Applied Biosystems)를 혼합하여 POP 6 polymer와 4×50 cm capillary를 장착한 3130 genetic analyzer(Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다.
대상 데이터
- 720개의 분리배양한 내냉성 미생물 중 총 706개의 균을 동정하였고 총 87가지의 서로 다른 종이 분석되었으며, 동정 결과는 Table 3과 같다. Pseudomonas fluorescens가 81개로 가장 높은 검출 빈도수를 나타내었으며, Acinetobacter genomospecies가 61개, Acinetobacter johnsonii가 58개, Psychrobacter maritimus가 53개 순으로 높은 검출 빈도수를 나타내었다.
- 연구에 필요한 원유 시료는 계절별로 여름철 원유는 2010년 7월, 가을철 원유는 2010년 10월, 겨울철 원유는 2011년 1월, 봄철 원유는 2011년 4월에 공급받았다. 계절별로 원유는 경기 동부, 경기 동남부, 경기 동북부, 경기 서부, 경기남부, 경기북부, 경기중부, 안산, 경인지역 목장으로부터 공급받았으며, 시료는 냉장보관하였고 실험을 수행하기까지 2일이 넘지 않도록 하였다. 지역별 결과는 무작위로 A, B, C, D, E, F, G, H, I 지역으로 표기하였으며, 확보한 시료는 멸균생리식염수에 각 농도별로 희석하여 Standard methods(Wehr and Frank, 2004)에 따라 Plate count agar(Becton, Dickson and Company, Sparks, MD, USA)를 이용하여 7℃에서 10일 동안 배양하였다.
- 연구에 필요한 원유 시료는 계절별로 여름철 원유는 2010년 7월, 가을철 원유는 2010년 10월, 겨울철 원유는 2011년 1월, 봄철 원유는 2011년 4월에 공급받았다. 계절별로 원유는 경기 동부, 경기 동남부, 경기 동북부, 경기 서부, 경기남부, 경기북부, 경기중부, 안산, 경인지역 목장으로부터 공급받았으며, 시료는 냉장보관하였고 실험을 수행하기까지 2일이 넘지 않도록 하였다.
- 배양이 끝난 후, 각 원유시료의 총 내냉성미생물의 균수를 측정하였으며, 그 중 무작위로 colony를 선택하여 최소 3번 이상 plate에 계대배양하여 단일 colony를 취하였다. 지역별로 20개의 colony를 취하여, 총 9개 지역에서 한 계절에 총 180개의 균을 분리배양하였으며, 사계절, 9개 지역으로부터 총 720개의 균을 분리하여 동정에 사용하였다. 결과 분석을 위해 모든 통계처리는 Statistical Analysis System(SAS Institute Inc.
데이터처리
- 결과 분석을 위해 모든 통계처리는 Statistical Analysis System(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 Duncan's Multiple Range Test를 사용하였다.
이론/모형
- 분리배양한 colony들은 동정을 수행하기 위해 Applied Biosystems(Foster City, CA, USA)의 방법에 따라 PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 분리배양한 균에서 1 μL loop를 이용하여 colony를 취한 후, 100 μL reagent에 30초 동안 강하게 혼합하여 95℃에서 10분 동안 가열하였다.
성능/효과
- 720개의 분리배양한 내냉성 미생물 중 총 706개의 균을 동정하였고 총 87가지의 서로 다른 종이 분석되었으며, 동정 결과는 Table 3과 같다. Pseudomonas fluorescens가 81개로 가장 높은 검출 빈도수를 나타내었으며, Acinetobacter genomospecies가 61개, Acinetobacter johnsonii가 58개, Psychrobacter maritimus가 53개 순으로 높은 검출 빈도수를 나타내었다. 동정된 psychrotrophic bacteria의 지역별 검출 빈도수가 높은 균주는 A 지역은 12개의 Acinetobacter johnsonii가, B 지역은 22개의 Pseudomonas fluorescens, C 지역은 13개의 Enterobacter amnigenus, D 지역은 19개의 Psychrobacter maritimus, E 지역은 19개의 Acinetobacter johnsonii, F 지역은 8개의 Acinetobacter haemolyticus, G 지역은 20개의 Pseudomonas fluorescens, H 지역은 9개의 Acinetobacter johnsonii, I 지역은 17개의 Pseudomonas mucidolens로 나타났다(Table 4).
- 각 지역별 균수를 비교한 결과는 B 지역 원유에서 2.4×105 CFU/mL로 유의적으로 가장 높은 균수가 검출되었고, C 지역과 D 지역 원유에서 8.7×103 CFU/mL로 9개 지역 중 유의적으로 가장 낮은 균수가 검출되었다(p<0.05) (Fig. 2).
- 내냉성 미생물의 총 균수를 측정하여 계절별 분포를 비교해 본 결과, 겨울철 원유에서 3.0×104 CFU/mL로 가장 높은 균수가 검출되었고, 여름철 원유에서 8.7×103 CFU/mL, 가을철 원유에서 5.9×103 CFU/mL가 검출되었으며, 봄철 원유에서 3.9×103 CFU/mL로 가장 낮게 균이 검출되었다(p<0.05) (Fig. 1).
- Pseudomonas fluorescens가 81개로 가장 높은 검출 빈도수를 나타내었으며, Acinetobacter genomospecies가 61개, Acinetobacter johnsonii가 58개, Psychrobacter maritimus가 53개 순으로 높은 검출 빈도수를 나타내었다. 동정된 psychrotrophic bacteria의 지역별 검출 빈도수가 높은 균주는 A 지역은 12개의 Acinetobacter johnsonii가, B 지역은 22개의 Pseudomonas fluorescens, C 지역은 13개의 Enterobacter amnigenus, D 지역은 19개의 Psychrobacter maritimus, E 지역은 19개의 Acinetobacter johnsonii, F 지역은 8개의 Acinetobacter haemolyticus, G 지역은 20개의 Pseudomonas fluorescens, H 지역은 9개의 Acinetobacter johnsonii, I 지역은 17개의 Pseudomonas mucidolens로 나타났다(Table 4). 동정된 균을 강(class)과 속(genus)을 기준으로 분류하였는데, Gamma-proteobacteria 강이 572개로 가장 우세하였고, 그 중 특히 Pseudomonas 속이 185개로 가장 높은 검출빈도수를 나타내었으며 Acinetobacter 속이 164개로 그 다음으로 높게 나타났다(Table 5).
- 동정된 psychrotrophic bacteria의 지역별 검출 빈도수가 높은 균주는 A 지역은 12개의 Acinetobacter johnsonii가, B 지역은 22개의 Pseudomonas fluorescens, C 지역은 13개의 Enterobacter amnigenus, D 지역은 19개의 Psychrobacter maritimus, E 지역은 19개의 Acinetobacter johnsonii, F 지역은 8개의 Acinetobacter haemolyticus, G 지역은 20개의 Pseudomonas fluorescens, H 지역은 9개의 Acinetobacter johnsonii, I 지역은 17개의 Pseudomonas mucidolens로 나타났다(Table 4). 동정된 균을 강(class)과 속(genus)을 기준으로 분류하였는데, Gamma-proteobacteria 강이 572개로 가장 우세하였고, 그 중 특히 Pseudomonas 속이 185개로 가장 높은 검출빈도수를 나타내었으며 Acinetobacter 속이 164개로 그 다음으로 높게 나타났다(Table 5). Martins 등(2006)은 원유의 내냉성 미생물 오염발생 원인균으로 가장 빈번하게 검출되는 균이 Pseudomonas 속이라는 연구 결과를 발표하였으며, Gunasekera 등(2003), Wiedmann 등(2000) 및 Chen 등(2002)도 원유에서 가장 많이 검출되는 내냉성 미생물은 Pseudomonas 속으로 보고하였다.
- 46%로 가장 우세하였다. 동정된 내냉성 미생물 의 지역별 분포는 A 지역은 12개의 Acinetobacter johnsonii, B 지역은 21개의 Pseudomonas fluorescens, C 지역은 13개의 Enterobacter amnigenus, D 지역은 19개의 Psychrobacter maritimus, E 지역은 19개의 Acinetobacter johnsonii, F 지역은 8개의 Acinetobacter haemolyticus, G 지역은 20개의 Pseudomonas fluorescens, H 지역은 9개의 Acinetobacter johnsonii, I 지역은 17개의 Pseudomonas mucidolens가 높은 검출 빈도수를 나타내었다.
- 05). 분리한 총 706개의 균을 동정한 결과는 Gammaproteobacteria 강이 전체의 81.02%로 가장 우세하였고, 그 중 Pseudomonas 속이 32.34%로 가장 높은 검출 빈도수를 나타내었으며, 특히 Pseudomonas fluorescens가 39.46%로 가장 우세하였다. 동정된 내냉성 미생물 의 지역별 분포는 A 지역은 12개의 Acinetobacter johnsonii, B 지역은 21개의 Pseudomonas fluorescens, C 지역은 13개의 Enterobacter amnigenus, D 지역은 19개의 Psychrobacter maritimus, E 지역은 19개의 Acinetobacter johnsonii, F 지역은 8개의 Acinetobacter haemolyticus, G 지역은 20개의 Pseudomonas fluorescens, H 지역은 9개의 Acinetobacter johnsonii, I 지역은 17개의 Pseudomonas mucidolens가 높은 검출 빈도수를 나타내었다.
- 이 결과는 Elionora와 Malka(2007)의 연구와도 유사한 결과로 나타났는데, 이 연구진들은 이스라엘에서 1월, 4월, 7월 및 9월에 집유한 원유로부터 내냉성 미생물과 중온성 미생물을 분리하여 균수를 측정하여 비교하였다. 실험 결과는 본 연구와 유사하게 계절적 변이를 보였으며, 겨울철 원유에서 가장 높은 수준의 균수가 검출되었고, 봄철 원유에서 가장 낮은 수준의 균수가 검출되었다. 또한 Maria 등(2010)이 보고한 연구 결과와 유사하게 여름철에 비해 겨울철 원유에서 더 높은 내냉성미생물 균수가 측정되었으며, 전체적인 균수 분포는 2.
- 원유로부터 분리한 총 내냉성 미생물 균수는 다른 계절에 비해 겨울철 원유에서 3.0×104 CFU/mL로 가장 높은 수준으로 검출되었고, 다른 지역에 비해 B 지역에서 2.4×105 CFU/mL로 유의적으로 높은 균수가 측정되었다(p<0.05).
- 이 연구에서는 총 내냉성 미생물수의 범위가 3.5×104 ~ 9.4×106 CFU/mL로 나타났으며, 평균 1.5×106 CFU/mL로 나타나 본 실험 결과보다 더 높은 수준임을 알 수 있었다.
- Sutherland와 Murdoch(1994)는 겨울철 원유에서보다 여름철 원유에서 내냉성 미생물이 더 많이 검출되고, 이는 중온성 미생물과 내냉성 미생물간의 길항작용 때문으로, 여름철에 중온성 미생물의 증식이 감소하고, 이에 상대적으로 내냉성 미생물이 여름철에 더 활발하게 증식할 수 있기 때문인 것으로 분석하였다. 이처럼 원유 에 존재하는 내냉성 미생물의 계절별 분포는 나라별로 다른 추이를 나타내고 있으며, 원유 집유 조건에 따라서도 계절별 분포에 차이를 나타내고 있음을 알 수 있었다. 각 지역별 균수를 비교한 결과는 B 지역 원유에서 2.
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