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문제 정의
- , 1994; Gherbawy and Voigt, 2010). 따라서 본 연구에서는 짧은 시간에 고감도로 P. glomerata 균을 검출할 수 있는 DNA 마커를 개발하고, 일반적으로 사용되는 기존의 PCR 방법과 real-time PCR 방법을 이용하여 검출 가능 농도를 조사하였다.
- 또한 만들어진 프라이머의 민감성을 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 민감성 실험은 일반 PCR방법과 real time PCR방법 둘 다 이용하였다.
- glomerata는 국내의 식물검역균으로 관리되고 있다. 본 연구는 국내에 들어오는 목재나 과일에 P. glomerata를 검출할 수 있는 방법 개발코자 수행되었다. Phoma 균주들의 translation elongation factor 1 alpha 유전자 염기서열에 기초하여 P.
제안 방법
- 그리고 마지막으로 72℃에서 10분 동안 증폭 한 후 4℃에서 보관하였다. PCR 산물은 1% agarose gel 전기영동을 통해 증폭이 되었는지 확인하였다. 그 결과 P.
- glomerata를 검출할 수 있는 방법 개발코자 수행되었다. Phoma 균주들의 translation elongation factor 1 alpha 유전자 염기서열에 기초하여 P. glomerata 특이적 PCR 프라이머를 디자인 하였고 그 특이성을 검정하였다. PCR 수행 결과 P.
- glomerata의 genomic DNA 양을 10 ng부터 100 fg까지 10배 단위로 줄인 후 SYBR Premix Extaq (Takara)에 각각 첨가하여 총 25 µL의 PCR 반응액을 조제 하였다. Real time PCR 반응은 95℃에서 30초 반응 후 95℃에서 5초와 52℃에서 30초를 40회 반복하는 과정으로 Takara Thermal Cycler Dice Real Time System TP800을 이용하여 Real time PCR을 수행하였다. DNA 양에 따른 real time PCR 반응산물을 모니터링한 결과 1 pg 수준까지는 30 cycle 내에 증폭되었다.
- glomerata의 genomic DNA 함량을 측정하여 20 µL 반응액에 5 ng, 1 ng, 200 pg, 100 pg, 50 pg, 20 pg, 10 pg, 5 pg, 1 pg씩 담도록 첨가하였다. 각각 첨가된 template DNA를 대상으로 PhoGlo-F/R 프라이머를 앞서 서술한 PCR 반응조건과 같은 반응조건에서 PCR을 수행하였다. PCR 수행으로 얻어진 반응산물을 1% agarose gel에 전기영동하여 분석한 결과 template DNA 10 pg까지는 강하게 증폭된 DNA 밴드를 볼 수 있었고 5 pg과 1 pg에서도 희미하지만 육안으로 식별 가능한 DNA밴드가 보이는 것으로 보아 적은 양의 template DNA로도 P.
- glomerata 균 특이적일 가능성을 보여준다. 따라서 디자인한 프라이머는 바이오니아사(대전)에 의뢰하여 합성 제작하였다. 제작된 프라이머의 특이성은 6개 Phoma균주와 더불어11개 다른 종의 균주에 대해 수행하였다(Table 1).
- 이를 위해 P. glomerata의 genomic DNA 양을 10 ng부터 100 fg까지 10배 단위로 줄인 후 SYBR Premix Extaq (Takara)에 각각 첨가하여 총 25 µL의 PCR 반응액을 조제 하였다.
- 이에 따라 Clustal W프로그램(http://www.clustal.org/clustal2/)을 이용하여 서열을 나열한 후 유사성을 비교 분석하였고 종간 차이가 나는 부분을 염기서열 부분을 바탕으로 하여 Phoma glomerata 검출마커 프라이머인 PhoGlo-F(5’TGC GCA ATA CTC TTG CTT CA 3’)와 PhoGlo-R(5’AGC GAT GTG ATG TTG GAT G 3’)를 디자인하였다(Fig. 1).
- 일반 PCR은 P. glomerata의 genomic DNA 함량을 측정하여 20 µL 반응액에 5 ng, 1 ng, 200 pg, 100 pg, 50 pg, 20 pg, 10 pg, 5 pg, 1 pg씩 담도록 첨가하였다.
- 증폭한 PCR산물은 1% agarose gel 전기영동을 실시하여 ethidium bromide로 염색한 다음 증폭된 DNA밴드를 확인 후 PCR 산물 정제키트(Roche, Germany)를 이용하여 분리 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 마크로젠사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 얻어진 염기서열은 GenBank DNA database (http://www.
- (2004) 등의 방법에 따라PCR을 수행 함으로서 translation elongation factor 1-alpha를 코딩하는 tef1-α 유전자 부분을 증폭하였다. 증폭한 PCR산물은 1% agarose gel 전기영동을 실시하여 ethidium bromide로 염색한 다음 증폭된 DNA밴드를 확인 후 PCR 산물 정제키트(Roche, Germany)를 이용하여 분리 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 마크로젠사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 균주는 Table 1에 제시되었다. 분양을 받은 균주는 PDA 배지에 올려 25℃ 배양기에서 5일간 배양을 하였다.
- 따라서 디자인한 프라이머는 바이오니아사(대전)에 의뢰하여 합성 제작하였다. 제작된 프라이머의 특이성은 6개 Phoma균주와 더불어11개 다른 종의 균주에 대해 수행하였다(Table 1). 특이성 확인을 위한 PCR 반응 조건은 initial denaturation 94℃에서 3분, denaturation 94℃에서 20초, annealing 52℃에서 20초, extention 72℃에서 30초 순으로 30회 반복하였다.
데이터처리
- 3). 한편, 검출 검출감도를 평가하기 위해 Real time PCR을 이용하여 민감성 실험을 수행하였다. 이를 위해 P.
이론/모형
- PCR 반응물은 EmeraldAmp® GT PCR Master Mix(Takara, Japan)에 얻어진 template DNA(10 ng) 및 EF1F과 EF2R 프라이머(10 pmol)을 이용하여 총 20 µL로 만든 후 Jacobs et al. (2004) 등의 방법에 따라PCR을 수행 함으로서 translation elongation factor 1-alpha를 코딩하는 tef1-α 유전자 부분을 증폭하였다.
- 또한 만들어진 프라이머의 민감성을 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 민감성 실험은 일반 PCR방법과 real time PCR방법 둘 다 이용하였다. 일반 PCR은 P.
- 분양을 받은 균주는 PDA 배지에 올려 25℃ 배양기에서 5일간 배양을 하였다. 배양된 균주 중 마커 프라이머를 제작하기 위한 염기서열을 얻기 위해 glass bead방법(Richard et al., 2002)을 이용하여 Phoma속에 속하는 5 균주(KACC45220, KACC45222, KACC45599, KACC45598, KACC45597)의 genomic DNA를 추출하였다. PCR 반응물은 EmeraldAmp® GT PCR Master Mix(Takara, Japan)에 얻어진 template DNA(10 ng) 및 EF1F과 EF2R 프라이머(10 pmol)을 이용하여 총 20 µL로 만든 후 Jacobs et al.
성능/효과
- DNA 양에 따른 real time PCR 반응산물을 모니터링한 결과 1 pg 수준까지는 30 cycle 내에 증폭되었다. 100 fg 수준에서는 34 cycle 에서 증폭이 되기 시작했지만 PCR 증폭량이 다른 DNA 농도보다 많이 낮은 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과는 일반 PCR보다 real time PCR 방법이 민감성면에서 10배 정도 높음을 보여준다.
- glomerata 특이적 PCR 프라이머를 디자인 하였고 그 특이성을 검정하였다. PCR 수행 결과 P. glomerata에서만 170 bp 크기의 밴드가 증폭되었고, 다른 비교 균주에서는 밴드가 증폭되지 않았다. 검출 감도를 평가하기 위해 기존 PCR방법과 real time PCR 방법을 이용하여 실험한 결과 최소 10 pg과 1 pg까지 각각 검출 할 수 있었다.
- 각각 첨가된 template DNA를 대상으로 PhoGlo-F/R 프라이머를 앞서 서술한 PCR 반응조건과 같은 반응조건에서 PCR을 수행하였다. PCR 수행으로 얻어진 반응산물을 1% agarose gel에 전기영동하여 분석한 결과 template DNA 10 pg까지는 강하게 증폭된 DNA 밴드를 볼 수 있었고 5 pg과 1 pg에서도 희미하지만 육안으로 식별 가능한 DNA밴드가 보이는 것으로 보아 적은 양의 template DNA로도 P. glomerata의 검출이 가능한 것을 알 수 있었다(Fig. 3). 한편, 검출 검출감도를 평가하기 위해 Real time PCR을 이용하여 민감성 실험을 수행하였다.
- glomerata에서만 170 bp 크기의 밴드가 증폭되었고, 다른 비교 균주에서는 밴드가 증폭되지 않았다. 검출 감도를 평가하기 위해 기존 PCR방법과 real time PCR 방법을 이용하여 실험한 결과 최소 10 pg과 1 pg까지 각각 검출 할 수 있었다. 본 연구결과는 디자인된 PCR 프라이머가 P.
- PCR 산물은 1% agarose gel 전기영동을 통해 증폭이 되었는지 확인하였다. 그 결과 P. glomerata의 genomic DNA에서만 170 bp크기의 밴드가 증폭되었고 다른 균주에서는 밴드가 증폭되지 않았다(Fig. 2). 이는 제작한 프라이머가 P.
- 1). 디자인된 프라이머의 특이성을 확인하기 위해 다시 Gen Bank DNA database 상에 존재하는 유전자들에 대하여 BlastN검색을 해 본 결과, PhoGlo-F와 완전히 일치하는 DNA염기서열은 존재하지 않았고 PhoGlo-R은 Nectria haematococca 와만 일치하였다. 제작된 프라이머의 염기서열은 Phoma 속에 속하는 다른 종들 및 Phoma 이외의 다른 균들의 tef1-α 염기서열과는 90% 이하의 상동성을 보였다.
- 검출 감도를 평가하기 위해 기존 PCR방법과 real time PCR 방법을 이용하여 실험한 결과 최소 10 pg과 1 pg까지 각각 검출 할 수 있었다. 본 연구결과는 디자인된 PCR 프라이머가 P. glomerata를 특이적으로 검출하는데 유용 할 것 임을 보여준다.
- 얻어진 염기서열은 GenBank DNA database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) 검색을 통하여 tef1-α 유전자 염기서열임을 확인하였다.
- 100 fg 수준에서는 34 cycle 에서 증폭이 되기 시작했지만 PCR 증폭량이 다른 DNA 농도보다 많이 낮은 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과는 일반 PCR보다 real time PCR 방법이 민감성면에서 10배 정도 높음을 보여준다. 표준 커브를 보면 slope가 −3.
- 이러한 수치는 real time PCR이 적절히 수행되었음을 보여준다. 이상의 결과를 보면 일반 PCR 방법과 real time PCR 방법 모두 제작된 PhoGlo-F/R 프라이머을 사용하였을 경우 1 pg까지는 무리 없이 특이적으로 증폭할 수 있음을 알 수 있었고 Real time PCR 방법을 사용시 좀 더 감도 있게 검출이 가능함을 볼 수 있었다.
- 제작된 프라이머의 염기서열은 Phoma 속에 속하는 다른 종들 및 Phoma 이외의 다른 균들의 tef1-α 염기서열과는 90% 이하의 상동성을 보였다.
- 제작된 프라이머의 특이성은 6개 Phoma균주와 더불어11개 다른 종의 균주에 대해 수행하였다(Table 1). 특이성 확인을 위한 PCR 반응 조건은 initial denaturation 94℃에서 3분, denaturation 94℃에서 20초, annealing 52℃에서 20초, extention 72℃에서 30초 순으로 30회 반복하였다. 그리고 마지막으로 72℃에서 10분 동안 증폭 한 후 4℃에서 보관하였다.
후속연구
- glomerata의 직접 검출은 아직 국내외적으로 보고된 바가 없다. 따라서 본 논문은 P. glomerata를 검출하는 방법을 보고하는 첫 번째 논문이며 이 방법을 이용하여 국내에 식물과 과일을 수입할 때 분리된 Phoma 균으로부터 P. glomerata를 신속히 동정 검출하는데 이용 할 수 있을 것으로 기대된다.
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