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문제 정의
- 식물체에서 수분의 부족도는 생육과 대사활동에 매우 중요한 인자로서 본 연구는 토양 내 수분의 부족 정도에 따라 식물이 적응하는 효소적반응이 아스코브산의 산화환원작용과 관련된 반응에 미치는 영향을 예측하기 위하여 상추를 공시작물로하여 수행되었다. 특히, 아스코브산의 산화환원에 관련된 효소들의 활성이 토양 내 수분의 부족도를 판단하는 지표로서 활용될 수 있는 가능성의 평가에 주안을 두었다.
- 토양의 수분상태에 따른 상추의 엽 내 상대수분함량 (Relative Water content)과 항산화 관련 효소의 활성도와의 연관성을 확인하여 수분부족에 적응하는 상추의 생화학적 반응이 본 연구에서 확인되었다. 토양 중 수분의 함량과 잎 내 수분함량은 정의 상관 (R2=0.
- 식물체에서 수분의 부족도는 생육과 대사활동에 매우 중요한 인자로서 본 연구는 토양 내 수분의 부족 정도에 따라 식물이 적응하는 효소적반응이 아스코브산의 산화환원작용과 관련된 반응에 미치는 영향을 예측하기 위하여 상추를 공시작물로하여 수행되었다. 특히, 아스코브산의 산화환원에 관련된 효소들의 활성이 토양 내 수분의 부족도를 판단하는 지표로서 활용될 수 있는 가능성의 평가에 주안을 두었다.
제안 방법
- APX (Genbank accession No. D85864), DHAR (Genbank accession No. AF195783)와 MDHAR (accession. No. AB063289)의 mRNA 로부터 프라이머 [APX: 5'-CTGATGGGTGA GAAAGAAGG-3' (F), 5'-ATGTTGCTTGCTTTGGTAAT-3' (R); DHAR: 5'-AG TCGCGTATTCAC TTTCAT-3' (F), 5'-AGATTGCATTGGGA CATTAC-3' (R); MDHAR: 5'-TAAATCAGCTCAG CATTGTG-3 (F), 5'-AGAACTCCTTTCAGTCTCCC-3' (R)]를 제작 프로그램 (Primer3, Whitehead Institute, USA)을 사용하여 제작하고 PCR의 방법으로 증폭하였다.
- APX의 활성도는 5 mM 아스코브산, 10 mM 과산화수소와 조효소액이 들어있는 50 mM K-Pi 완충액 (pH 7.0, 총부피 1 mL)에서 아스코브산 (ε=2.7 mM-1cm-1)의 산화정도 (ΔA)를 측정하여 계산하였다 (Nakano and Asada, 1981).
- DHAR (EC 1.8.5.1)의 활성도는 10 mM GSH, 5 mM DHA와 조효소액을 첨가한 50 mM K-Pi 완충액 (pH 7.0, 총부피 1 mL)에서 아스코브산 (ε=2.7 mM-1․cm-1)의 생성량으로 측정하였다 (Hossain and Asada, 1984).
- Northern Blot분석을 위한 RNA의 추출은 Chang et al. (1993)의 방법을 약간 변형하여 수행하였으며 추출한 총 RNA (11.7 µg each)는 10% (v/v) formaldehyde가 함유된 1.2% (w/v) 아가로스 젤 전기영동을 한 후 nylon membrane (Sigma, Co., USA)에 전이시켰다.
- 공시작물 상추 (Lactuca sativa L. cv. Baronet, Journey Co.)를 육묘용 상토 (Metro-Mix 350®)와 10% (v/v)의 모래를 섞어 채운 포트 (8×8×7 cm)에 3립씩 파종하였다.
- 과산화수소 표준곡선으로부터 과산화수소의 함량을 계산하였으며 생체중량 당 µM로 나타내었다.
- 과산화수소의 함량은 시료 0.2 g을 액체질소에서 마쇄하고 10배 부피의 0.1% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)로 추출하였다. 현탁액을 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 수집한 상징액 500 µL를 10 mM 인산완충액 (pH 7.
- 발아한 유식물 중 건전한 1주를 생육상 (주/야 20℃/18℃, 200 µmol·m-2·s-1)에서 포장용수량이 유지되도록 저면관수 방식으로 수분을 공급하면서 4 주간 생육시켰다.
- 생육 기간 중 영양용액 [N-P-K (20-10-20), Peat Lite®]의 질소 농도를 250 ppm으로 조정하여 주 1회 공급하였다.
- 생육 기간 중 영양용액 [N-P-K (20-10-20), Peat Lite®]의 질소 농도를 250 ppm으로 조정하여 주 1회 공급하였다. 생육이 균일한 공시작물을 선정하여 대조구 (Wc)는 포장용수량의 수분상태를 유지하였고, 처리구 (W1, W2)는 수분의 공급을 일정 기간 제한하였다. 3 수준으로 처리한 공시식물의 잎 시료를 일정한 시간에 채취하여 액체질소에서 동결시켜 -70℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 아스코브산의 함량은 상징액 100 µL와 900 µL의 인산완충액 (pH 12.7)을 넣은 직후 265 nm에서 측정한 흡광도와 5 unit의 아스코브산 산화효소를 넣은 후 측정한 흡광도차이를 표준곡선에 의하여 계산하였다.
- 엽록소 a와 b, 카로티노이드의 함량은 시료 0.2 g을 액체질소에서 마쇄한 후 10배 부피의 인산완충액 [100mM K-Pi, pH 7.0, 20% (w/v) sorbitol, 1 mM EDTA와 0.1% (w/v) PMSF]으로 현탁하였다. 이 현탁액 100 µL에 10배 부피의 95% (v/v) 에탄올을 넣어 혼합하면서 추출하고 -20℃에서 하룻밤 방치하였다.
- 즉, 30~50 µL의 조효소액을 50 mM 인산완충액 (pH 7.6), 0.3 mM NADH 및 2.5 mM 아스코브산이 들어있는 반응용액 (최종부피 1 mL)에 넣고 0.5 unit 아스코브산 산화효소 (ascorbate oxidase)를 첨가하여 NADH의 산화 정도 (ε=6.2 mM-1cm-1)를 측정하였다 (Hossain et al., 1984).
- 총 아스코브산의 함량은 1 mL의 추출액에 400 µL 의 1.2 M K2CO3첨가하여 최종 pH를 6.0으로 조정한 후 원심 분리한 상징액에 10 mM의 dithiothreitol (DTT)를 넣고 25℃에서 10분간 반응시켜 아스코브산의 함량 측정과 동일한 방법으로 측정하였다 (Foyer et al., 1983; Yoshimura et al., 2000).
- 3 수준으로 처리한 공시식물의 잎 시료를 일정한 시간에 채취하여 액체질소에서 동결시켜 -70℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 토양과 잎 내 상대 수분함량 (relative water content : RWC)을 측정하였으며 (Tambussi et al., 2000), 잎의 수분포텐셜은 Psychrometer (Decagon Co. USA)를 사용하여 측정하였다.
- 현탁액을 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 수집한 상징액 500 µL를 10 mM 인산완충액 (pH 7.0)과 1 mL의 1 M KI를 첨가하여 발색시킨 후 390nm에서 흡광도를 측정하였다 (Alexieva et al., 2001; Foyer et al., 1997).
- 효소의 활성도 측정을 위한 조효소액의 조제는 약 3 g의 잎 시료를 액체질소에서 마쇄한 후 3배 부피의 추출액[100 mM K-Pi 완충액 (pH 7.2), 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% (w/v) BSA]에서 추출하였다. 현탁액을 원심분리 (15,000 rpm, 4℃, 15분)한 후 상징액은 1 mL씩 분주하여 -70℃에서 보관하였다.
이론/모형
- , 1994). 조효소액 중의 단백질 함량은 BSA를 표준단백질로하여 Bradford의 방법 (1976)으로 측정하였다. APX의 활성도는 5 mM 아스코브산, 10 mM 과산화수소와 조효소액이 들어있는 50 mM K-Pi 완충액 (pH 7.
성능/효과
- 1과 같다. 대조구 토양의 수분함량은 67.64% (포장용수량: 70.94%)로 유지되었으며, 수분의 공급을 제한한 처리구의 토양 내 수분의 함량은 45.31% (W1)와 25.76% (W2)를 각각 나타났다 (Fig 1A). 토양내 수분함량의 차이에 따른 공시식물 잎 내 상대 수분함량은 대조구에서는 91.
- , 2000)와 같이 토양 내 수분의 감소가 환경스트레스 요인으로 작용한다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 적절한 수분 수준의 유지는 상추내 아스코브산의 함량을 증가시킬 수 있는 요인이 될 수 있을 것으로 판단된다.
- 토양 내 수분의 감소는 잎 내 상대수분 함량과 밀접하게 연관되어 있으며 토양 내수분의 감소는 산화적 손상을 받게 되고 일차적으로 catalase 와 superoxide dismutase의 영향으로 식물의 잎 세포내 과산화수소의 농도가 일시적인 증가가 유발된다는 보고 (Mittler, 2002)와 같이, 상추 식물에서도 토양 수분의 감소는 산화적 스트레스의 일종임을 확인 할 수 있었다. 또한, 토양 내 수분의 감소로 단백질의 함량이 감소하는 경향을 보여 수분의 공급부족이 잎 내 단백질의 생성량과 밀접한 관련성이 있음을 확인 할 수 있었다.
- 세 종류의 효소활성도가 증가함에 따라 해당 효소단백질의 mRNA수준의 발현도 동일한 경향을 보였다 (Fig. 5 D). 수분 부족 스트레스가 진행됨에 따라 MDHAR의 cDNA의 발현이 증가한다는 보고 (Leterrier 등, 2005)와 바와 같이 상추의 잎에서 MDHAR의 cDNA발현은 수분 부족 스트레스가 증가할수록 증가하였으며 APX와 DHAR의 mRNA수준이 동시에 증가되었음을 알 수 있었다 (Fig.
- 5 D). 수분 부족 스트레스가 진행됨에 따라 MDHAR의 cDNA의 발현이 증가한다는 보고 (Leterrier 등, 2005)와 바와 같이 상추의 잎에서 MDHAR의 cDNA발현은 수분 부족 스트레스가 증가할수록 증가하였으며 APX와 DHAR의 mRNA수준이 동시에 증가되었음을 알 수 있었다 (Fig. 5 D). 시금치에서 고광도에 의해 APX의 mRNA수준이 크게 증가한다는 보고 (Yoshimura et al.
- 48MPa을 나타내었다. 수분부족 조건에서 과산화수소의 생성량은 증가하는 경향이었으며 수용성 단백질과 생체중, 건물중은 각각 감소하는 경향을 나타내었다. 클로로필 a와 b의 생성량은 잎의 상대수분의 함량이 감소할수록 감소하였으나 카로티노이드의 생성량은 증가하는 경향을 보였다.
- 9990)을 나타내었다. 수분스트레스가 증가함에 따라 APX와 DHAR의 활성도와 정의 상관관계를 보였다. 이 결과는 MDHAR 활성도와 정의 상관관계 (R2=0.
- 클로로필 a와 b의 생성량은 잎의 상대수분의 함량이 감소할수록 감소하였으나 카로티노이드의 생성량은 증가하는 경향을 보였다. 아스코브산 (ascorbate) 의 함량의 변화는 잎의 상대수분의 함량이 감소할수록 증가하는 경향을 보였으나 수분부족도가 크게 증가할 경우 다시 감소하였으며, 디하이드로아스코브산 (dehydroascorbate)의 경우도 비슷한 경향을 나타내었다. 아스코브산 과산화효소 (ascorbate peroxidase:APX)의 활성도는 상대수분 함량이 감소할수록 급격한 증가를 보였으며 디하이드로아스코브산환원효소 (dehydroascorbate reductase:DHAR)와 모노디하이드로아스코브산 환원효소(monodehydeoascorbate reductase: MDHAR)의 활성변화도 비슷한 경향으로 증가하였으며 각 효소의 mRNA수준도 동시에 증가하였다.
- 아스코브산 (ascorbate) 의 함량의 변화는 잎의 상대수분의 함량이 감소할수록 증가하는 경향을 보였으나 수분부족도가 크게 증가할 경우 다시 감소하였으며, 디하이드로아스코브산 (dehydroascorbate)의 경우도 비슷한 경향을 나타내었다. 아스코브산 과산화효소 (ascorbate peroxidase:APX)의 활성도는 상대수분 함량이 감소할수록 급격한 증가를 보였으며 디하이드로아스코브산환원효소 (dehydroascorbate reductase:DHAR)와 모노디하이드로아스코브산 환원효소(monodehydeoascorbate reductase: MDHAR)의 활성변화도 비슷한 경향으로 증가하였으며 각 효소의 mRNA수준도 동시에 증가하였다. 특히, 잎의 상대 수분함량과 과산화수소의 생성, 아스코브산 관련 효소의 활성도와는 경향이 명확한 정의 상관 (R2은 각각 0.
- 46%일 때 약간 감소되는 경향을 보여 전체적으로 아스코브산의 수준을 일정하게 유지하는 것으로 생각된다. 이상의 결과에서 아스코브산은 식물체에서 수분 부족스트레스에 적응하기 위한 체내 일련의 반응에 직접 관여 한다는 사실을 예측할 수 있다. 이전의 보고 (Kang, 2008)에서도 수분스트레스가 증가함에 따라 지속적으로 증가하는 경향을 보이다가 일정기간 이후에는 급격하게 감소하는 경향을 보였기 때문에 아스코브산 함량의 평가로 수분 스트레스의 양을 추정할 수 있을 것으로 생각된다.
- 잎 내 상대수분함량이 감소함에 따라 엽록소 a와 b의 함량이 다소 감소하는 경향을 보였으며 (Fig. 3 A), 반면에 카로티노이드 함량은 비교적 증가하는 경향을 나타내었다 (Fig. 3 B). 총 엽록소의 함량은 잎내 상대수분의 함량이 감소하는 경향에 따라 비슷한 경향으로 감소하였으며 이는 정상적으로 생육한 식물체보다 수분 스트레스에 노출된 식물에서 초기에는 증가하는 경향을 보이지만 수분함량이 감소해 감에 따라 대체적으로 감소되었다는 결과 (Kang, 2008)와 같이 상대수분함량의 감소 (87%, 82%)로 엽록소의 함량이 감소되는 것으로 보인다.
- 6과 같다. 잎의 상대수분함량에 따른 총 APX 활성도와는 정의 상관 (R2=0.9849)을 나타내었으며, 상대수분함량과 DHAR 활성도와 MDHAR 활성도 각각 정의 상관 (R2=0.9978, R2=0.9990)을 나타내었다. 수분스트레스가 증가함에 따라 APX와 DHAR의 활성도와 정의 상관관계를 보였다.
- 3 B). 총 엽록소의 함량은 잎내 상대수분의 함량이 감소하는 경향에 따라 비슷한 경향으로 감소하였으며 이는 정상적으로 생육한 식물체보다 수분 스트레스에 노출된 식물에서 초기에는 증가하는 경향을 보이지만 수분함량이 감소해 감에 따라 대체적으로 감소되었다는 결과 (Kang, 2008)와 같이 상대수분함량의 감소 (87%, 82%)로 엽록소의 함량이 감소되는 것으로 보인다. 반면 카로티노이드의 함량의 증가는 식물이 스트레스에 노출되었을 때 항산화작용을 보이는 것으로 볼 수 있다.
- 수분부족 조건에서 과산화수소의 생성량은 증가하는 경향이었으며 수용성 단백질과 생체중, 건물중은 각각 감소하는 경향을 나타내었다. 클로로필 a와 b의 생성량은 잎의 상대수분의 함량이 감소할수록 감소하였으나 카로티노이드의 생성량은 증가하는 경향을 보였다. 아스코브산 (ascorbate) 의 함량의 변화는 잎의 상대수분의 함량이 감소할수록 증가하는 경향을 보였으나 수분부족도가 크게 증가할 경우 다시 감소하였으며, 디하이드로아스코브산 (dehydroascorbate)의 경우도 비슷한 경향을 나타내었다.
- 토양 내 수분 함량의 감소로 잎 내 상대수분함량이 감소하면 APX의 활성도가 급격하게 증가하는 경향을 나타내며 (Fig. 5 A), DHAR의 활성도가 더 큰 증가를 나타내었다 (Fig. 5 B). 토양 내 수분의 함량이 감소하면 과산화수소 양의 증가로 (Fig.
- 식물이 항산화력을 가지기 위해서는 아스코브산 수준의 항상성이 필요하므로 환원형인 모노디하이드로아스코브산을 산화형인 아스코브산으로 재생하는 반응을 촉매하는 효소인 MDHAR의 활성도 변화로 식물이 수분스트레스 환경에 적응하는 기작을 설명할 수 있게 된다. 토양 내 수분의 함량이 감소함에 따라 MDHAR의 활성도도 크게 증가하는 것으로 나타났다 (Fig. 5 C). 전체적으로 이들 효소 활성도는 토양 내 수분함량이 낮은 식물체의 잎에서 더 높게 나타났으므로 수분 부족스트레스가 산화적 손상을 유발함에 따라 적응하거나 내성을 유지하기 위하여 효소적 반응을 나타낸다는 보고 (Kang, 2008) 와 같은 결과가 상추에서도 나타났다.
- 1 C). 토양 내 수분함량과 공시식물의 잎 내 수분함량과는 정의 상관 (R2=0.8728)을 보였으며 (Fig. 1 D), 토양 내 상대수분함량이 감소되면 잎에서 산화적 손상을 유발할 수 있기 때문에 아스코브산 산화환원 관련 효소의 활성도가 잎 내 상대수분함량과 깊은 연관성을 있을 것으로 판단된다.
- 토양내 수분함량의 차이에 따른 공시식물 잎 내 상대 수분함량은 대조구에서는 91.50%이었으며, 잎 내 수분포텐셜은 –1.96 MPa를 나타났다.
후속연구
- , 2009). 따라서, 수분 부족스트레스뿐 만 아니라 다른 환경스트레스에 의하여 총 아스코브산의 함량이 증가하는 것으로 사료되기 때문에 아스코브산의 함량을 높일 수 있는 스트레스 처리량에 관한 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 아스코브산 과산화효소 (ascorbate peroxidase:APX)의 활성도는 상대수분 함량이 감소할수록 급격한 증가를 보였으며 디하이드로아스코브산환원효소 (dehydroascorbate reductase:DHAR)와 모노디하이드로아스코브산 환원효소(monodehydeoascorbate reductase: MDHAR)의 활성변화도 비슷한 경향으로 증가하였으며 각 효소의 mRNA수준도 동시에 증가하였다. 특히, 잎의 상대 수분함량과 과산화수소의 생성, 아스코브산 관련 효소의 활성도와는 경향이 명확한 정의 상관 (R2은 각각 0.9995, 0.9849, 0.9978, 0.999)을 보여 상대수분 함량의 감소는 상추 잎에서 산화적스트레스로 작용함을 알 수 있을 뿐만 아니라 아스코브산 관련 효소의 활성도는 토양 내 수분의 부족도를 판단하는 지표로서 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
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