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제안 방법
- A. tumefaciens 분리주 GV3101을 pCAMBIA3301-TYLCV-1.9로 형질전환시켰다. 형질전환된 A.
- PCR 반응은 50µL 총량으로 100ng의 DNA, 2.5µL의 dNTP(100μM-1), 5µL의 5X PCR 완충액, 1µL의 각각의 프라이머(10pM), 0.5µL의 5U･µL-1의 Platinum Taq DNA polymerase(Invitrogen, USA)을 넣어 반응시켰다.
- PCR 반응의 온도 조건은, 94°C 5분 처리 후, 94°C 15초 변성, 58°C 15초 어닐링(annealing), 72°C 30초 신장(extension) 반응을 40회 반복 반응시킨 후, 마지막으로 72°C에서 5분 동안 반응시켰다.
- , 2005). PCR 증폭은 Chromo4 (Bio-Rad, USA) 실시간 PCR 기계를 사용하였으며, PCR 반응은 DNA의 minor groove를 결합하는 형광색소 SYBR Green I (QuantiFast SYBR Green PCR kit, Qiagen, Germany)을 이용하였다. PCR 반응의 온도 조건은, 94°C 5분 처리 후, 94°C 15초 변성, 58°C 15초 어닐링(annealing), 72°C 30초 신장(extension) 반응을 40회 반복 반응시킨 후, 마지막으로 72°C에서 5분 동안 반응시켰다.
- 9배 복제수를 가지는 감염성 클론을 제작하기 위하여, PCR로 증폭된 TYLCV DNA를 식물형질전환용 벡터에 각각 도입시켰다. TYLCV 저항성 평가를 위하여 저항성 토마토 시판 품종과 육성 계통을 각각 TYLCV 분리주를 가지고 있는 Agrobacterium tumefaciens로 접종하였다. 감수성 품종인 ‘Super-sunroad’ 품종은 접종 30일 후에 상엽에 황화, 위축 증상을 나타낸 반면, TYLCV에 대한 저항성유전자들로 알려진 Ty-1 또는 Ty-3 유전자를 포함하고 있는 TY12, GC9, GC171, GC173 등의 토마토 육성 계통은 전신 잎에 TYLCV 병징 발현이 없었으므로 이들 계통은 TYLCV 저항성으로 판별되었다.
- TYLCV 전체 유전체를 증폭하는 프라이머, TYLCV-For-full(5′-ACCGGATGGCCGCGCCTTTTCTTT-3′)과 TYLCV-Rev-full(5′-AATATTATACGGATGGCCGCTTTA-3′)를 이용하여 분리주별 전체 바이러스 유전체를 PCR 증폭하여 NcoI 제한효소로 처리한 후 pCAMBIA3301-TY-0.9 벡터에 클로닝하여 pCAMBIA3301-TY-1.9를 제작하였다.
- TYLCV를 접종한 후 1개월에 증상등급을 0부터 3까지 4 단계로 구분하여 증상없음(0), 약한증상(1), 황화증상(2), 위축과 심한병징(3)으로 정하여 TYLCV에 대한 저항성 정도를 측정하였다(Fig. 2).
- 담배가루이가 바이러스 전염원 TYLC-NS을 7일 동안 획득하게 한 후 전염원 토마토를 곤충사육 케이지로부터 제거한 후 파종 3주된 12개의 검정용 토마토 식물체를 곤충사육 케이지에 넣었다. 검정할 토마토를 7일 동안 TYLCV보독 담배가루이에 노출시킨 후 담배가루이는 농약을 살포하여 사멸시켰다. TYLCV 보독 담배가루이에 노출시킨 토마토는 약 10일 후 50메쉬 방충망 시설이 된 온실로 이동하여 키웠다.
- 국내에서 채집한 5종의 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 분리주들에 대하여 PCR법을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 전체 유전체의 1.
- 담배가루이는 목화식물에서 키웠으며, 약 200마리 가량의 담배가루이를 40 × 45 × 55cm 크기의 곤충사육 케이지에 넣은 후 바이러스 전염원으로 이용될 TYLCV-NS이 감염되어 황화증상을 나타내는 토마토 식물체를 곤충사육 케이지에 넣었다. 담배가루이가 바이러스 전염원 TYLC-NS을 7일 동안 획득하게 한 후 전염원 토마토를 곤충사육 케이지로부터 제거한 후 파종 3주된 12개의 검정용 토마토 식물체를 곤충사육 케이지에 넣었다. 검정할 토마토를 7일 동안 TYLCV보독 담배가루이에 노출시킨 후 담배가루이는 농약을 살포하여 사멸시켰다.
- 담배가루이는 목화식물에서 키웠으며, 약 200마리 가량의 담배가루이를 40 × 45 × 55cm 크기의 곤충사육 케이지에 넣은 후 바이러스 전염원으로 이용될 TYLCV-NS이 감염되어 황화증상을 나타내는 토마토 식물체를 곤충사육 케이지에 넣었다.
- 본 연구에서는 우리나라에서 채집한 TYLCV-IS, TYLCV-NS, TYLCV-YS, TYLCV-GJ, TYLCV-Cgh의 5개 분리주에 대한 감염성 클론을 제작하여 토마토 유묘 잎에 아그로주입법(agroinfiltration)으로 접종하여 TYLCV 감염에 대한 저항성 반응을 TYLCV-NS를 담배가루이를 통하여 전염시킨 반응과 비교하였다. 또한 TYLCV 감염된 토마토가 나타내는 병징 수준과 감염된 토마토에 존재하는 TYLCV DNA 농도를 비교하기 위하여 TYLCV DNA 축적을 실시간 PCR 방법을 이용하여 조사하였다. 본 연구에 의해 토마토에 대한 TYLCV 저항성 평가방법으로 감염성 클론의 이용이 담배가루이를 대체하여 바이러스를 접종하는 방법으로 이용할 수 있음을 확인하였다.
- 본 연구에서는 우리나라에서 채집한 TYLCV-IS, TYLCV-NS, TYLCV-YS, TYLCV-GJ, TYLCV-Cgh의 5개 분리주에 대한 감염성 클론을 제작하여 토마토 유묘 잎에 아그로주입법(agroinfiltration)으로 접종하여 TYLCV 감염에 대한 저항성 반응을 TYLCV-NS를 담배가루이를 통하여 전염시킨 반응과 비교하였다. 또한 TYLCV 감염된 토마토가 나타내는 병징 수준과 감염된 토마토에 존재하는 TYLCV DNA 농도를 비교하기 위하여 TYLCV DNA 축적을 실시간 PCR 방법을 이용하여 조사하였다.
- 분리주별로 TYLCV DNA를 주형으로 한 쌍의 PCR 프라이머, TYLCV-For-1984(5′-CCATGGCCGCGCAGCGGAAGACACGAC-3′)와 TYLCV-Rev-1967(5′-CCATGGAGACCCATAAGTATTGTCA-3′)를 이용하여 PCR 증폭한 후 PCR 산물을 EcoRI과 NcoI 제한효소로 처리하여 0.9-mer 단편을 만들어 pCAMBIA3301 벡터로 클로닝하여 pCAMBIA3301-TY-0.9라 명명하였다(Fig. 1).
- TYLCV 저항성 검정에 이용한 토마토 식물체는, TYLCV 저항성 유전자가 도입된 TY12, GC9, GC171 및 GC173 계통은 국립원예특작과학원 채소과에서 제공 받았으며, 감수성 대조품종 ‘Super-sunroad’, ‘Tenten’ 품종과 저항성 대조품종 ‘Bacus’ 품종은 시중에서 구입하여 사용하였다. 식물체 반복수는 agroinfiltration 접종의 경우 분리주 클론별 1-2그루에 처리하였으며, 담배가루이 전염의 경우 품종별 1-4그루를 처리하였다. 창문에 50 메쉬망 시설이 된 온실에서 토마토 종자를 원예용 상토에 파종하여 본잎이 1-2 잎 펼쳐질 무렵의 묘를 저항성 검정에 사용하였다.
- 전체 DNA는 접종 30일 후 상엽 3개 잎으로부터 각 잎당 두 군데로부터 채취한 잎 0.1g을 DNeasy mini kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 제조사의 추천 방법에 따라서 DNA를 추출하여 PCR 반응에 100ng의 DNA를 사용하였다. 실시간 PCR 프라이머의 염기서열 정보는 Table 2에 나타낸 바와 같다.
- 국내에서 채집한 5종의 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 분리주들에 대하여 PCR법을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 전체 유전체의 1.9배 복제수를 가지는 감염성 클론을 제작하기 위하여, PCR로 증폭된 TYLCV DNA를 식물형질전환용 벡터에 각각 도입시켰다. TYLCV 저항성 평가를 위하여 저항성 토마토 시판 품종과 육성 계통을 각각 TYLCV 분리주를 가지고 있는 Agrobacterium tumefaciens로 접종하였다.
- 현탁된 균에 10mM MgCl2, 200μM Acetosyringone, 10mM MES 을 넣어서 상온에서 2시간 가량 둔 후에 1mL 주사기를 사용하여 토마토 개체당 떡잎 2개에 총 1mL을 De Felippes and Weigel(2010)의 방법에 따라 바늘을 제거한 1mL 주사기를 잎 뒷면에 대고 일정한 압력으로 균을 주입하면서 균이 주입되는 부위의 바로 반대편 잎에 손가락을 대고 동일한 압력으로 받쳐주면서 접종하였다.
- 형질전환된 A. tumefaciens을 Kanamycin 50µg･mL-1, Rifampicin 100µg･mL-1, Gentamycin 25µg･mL-1을 첨가한 Luria-Bertani (LB) 배지에서 28°C 진동항온기에서 24시간 배양한 후 10µL를 10mL의 LB 배지에 한 후 28°C 진동항온기에서 8시간 가량 배양한 후 4,500rpm에서 10분간 원심분리하여 회수하여 OD600 0.7-0.8 농도로 LB 배지에 현탁하였다.
대상 데이터
- TYLCV 저항성 검정에 이용한 토마토 식물체는, TYLCV 저항성 유전자가 도입된 TY12, GC9, GC171 및 GC173 계통은 국립원예특작과학원 채소과에서 제공 받았으며, 감수성 대조품종 ‘Super-sunroad’, ‘Tenten’ 품종과 저항성 대조품종 ‘Bacus’ 품종은 시중에서 구입하여 사용하였다.
- 9를 제작하였다. TYLCV를 포함하지 않은 pCAMBIA3301 백터만을 접종하여 대조로 조사하였다.
- TYLCV 특이 프라이머는 C1 유전자 부분을 증폭하도록 설계되었으며, 최종 PCR 산물은 185bp이다. 대조로 사용된 프라이머 TYLCV-ActinF와 TYLCV-ActinR은 기존에 보고된 염기서열 정보를 참조하였다(Sinisterra et al., 2005). PCR 증폭은 Chromo4 (Bio-Rad, USA) 실시간 PCR 기계를 사용하였으며, PCR 반응은 DNA의 minor groove를 결합하는 형광색소 SYBR Green I (QuantiFast SYBR Green PCR kit, Qiagen, Germany)을 이용하였다.
- 실험은 2011년 4월에 16 시간 일장, 5,000-7,000lux의 광세기, 25°C온도가 유지되는 생장실에서 수행하였다.
- 익산, 논산, 예산, 제주도 및 광주 지역에서 TYLCV에 감염된 토마토를 채집하여 각각 TYLCV-IS, TYLCV-NS, TYLCV-YS, TYLCV-GJ, TYLCV-Cgh로 명명하였다(Table 1). 이들 5개 분리주에 대한 감염성 클론을 제작하기 위하여 전체 염기서열을 PCR법으로 결정하였다.
- 식물체 반복수는 agroinfiltration 접종의 경우 분리주 클론별 1-2그루에 처리하였으며, 담배가루이 전염의 경우 품종별 1-4그루를 처리하였다. 창문에 50 메쉬망 시설이 된 온실에서 토마토 종자를 원예용 상토에 파종하여 본잎이 1-2 잎 펼쳐질 무렵의 묘를 저항성 검정에 사용하였다.
이론/모형
- 익산, 논산, 예산, 제주도 및 광주 지역에서 TYLCV에 감염된 토마토를 채집하여 각각 TYLCV-IS, TYLCV-NS, TYLCV-YS, TYLCV-GJ, TYLCV-Cgh로 명명하였다(Table 1). 이들 5개 분리주에 대한 감염성 클론을 제작하기 위하여 전체 염기서열을 PCR법으로 결정하였다. TYLCV 유전체(full-length genome)를 1.
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