[논문]형광상관분광법을 이용한 광세기에 따른 유효 초점 부피 변화에 대한 연구

정찬배; 이재란; 김석원

doi:10.3807/kjop.2013.24.2.071

형광상관분광법을 이용한 광세기에 따른 유효 초점 부피 변화에 대한 연구
Study on the Effective Focal Volume Change due to Light Intensity Using Fluorescence Correlation Spectroscopy 원문보기

한국광학회지 = Korean journal of optics and photonics, v.24 no.2, 2013년, pp.71 - 76

정찬배 (울산대학교 물리학과) , 이재란 (울산대학교 물리학과) , 김석원 (울산대학교 물리학과)

초록
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형광상관분광법을 이용하여 광세기에 따른 공초점 시스템의 유효 초점 부피의 변화를 분석하였다. 형광상관분광장치는 632.8 nm 파장의 He-Ne 레이저에 맞춰서 실험실에서 자체 제작하였고, 시료 또한 레이저 파장에 적합한 두 종류의 시료 AlexaFluor647과 quantum dot 655를 사용하였다. 각 시료에 대해 광원의 세기를 1~50 ${\mu}W$ 범위내에서 변화시켜가며 얻어진 상관함수를 비교 분석하였다. 10 ${\mu}W$ 이하의 약한 광 세기에서는 세기 변화에 따라 입자수와 확산시간이 증가하는 것을 통해 초점 영역의 반지름이 선형적으로 증가하는 결과를 보였다. 반면 10~15 ${\mu}W$ 이상에서는 입자의 수와 확산 시간의 증가율은 감소하였지만 미세하게 계속해서 증가하는 결과를 보였고, 이 결과를 통해 초점영역의 반지름 역시 증가율은 감소하였지만 미세하게 증가한 것을 알 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Using fluorescence correlation spectroscopy, we analyzed the change of effective focal volume of a confocal system with light intensity. The fluorescence correlation spectroscopy system was home-built in accordance with the He-Ne laser with a wavelength of 632.8 nm, and two kinds of samples (AlexaFluor657 and Quantum dot655) suitable for the wavelength of the laser beam were used. For each sample, we analyzed and compared the correlation functions obtained while changing the intensity of the light source in a range of 1~50 ${\mu}W$. The result shows that the radius of the focal area increases linearly through the increase of particle number and diffusion time in response to an intensity change in weak light below 10 ${\mu}W$. In the higher intensity region (>10~15 ${\mu}W$), the increasing rate of particle number and diffusion time keep increasing but at a much slower rate. Through this result, it was also found that the radius increasing rate of the focal area was reduced however, the radius still increased slightly.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 자체 제작된 FCS 시스템을 이용하여 광 세기별로 유효 초점 부피의 크기를 확인하기 위해 AF647과 Qdot655 수용액에 대해 상관함수를 얻었다. 30 s씩 10회 반복 측정한 결과를 평균하였으며, 그 결과를 Fig.

제안 방법

각 시료에 대해 광원의 세기를 1~50 μW 범위 내에서 변화시켜 가며 얻어진 상관함수를 비교 분석하였다.
Figure 4에서 각 상관함수의 x-축은 로그 스케일로 나타낸 상관 지연시간 τ이고, y-축은 각 지연시간에 대한 상관 계수이다. 광 세기별로 기호와 색으로 실험값과 최적 맞춤값을 구분하여 나타내었다. 최적맞춤에 이용된 식 (4)에서의 형태 인자 s는 표준 시료 AF647에 의해 8로 결정되었고, 이를 Qdot655에도 동일하게 적용하였다.
^[9] 하지만, 형광 입자들마다 형광방출 효율이 다르기 때문에 FCS 시스템에 적용될 경우 형광 입자가 흡수 또는 방출하는 광의 세기에 따라 초점 영역이 다르게 분석될 수도 있다. 광 세기에 의해 다르게 관측되는 초점영역을 분석하기 위해 형광방출 효율이 다른 AlexaFluor647과 quantum dot을 새롭게 연구 해보았다.
광세기에 따른 상관함수를 얻기 위해 레이저에 neutral density filter를 두어 1~10 μW 범위에서는 1 μW 간격으로, 10~50 μ W 범위에서는 10 μW 간격으로 광세기를 조절하였다. 광세기는 laser power meter(OPHIR, PD300) 을 사용하여 측정하였고, 시료에 영향을 주는 광세기를 측정하기 위해, 광이 대물렌즈를 통과한 다음 세기를 측정하였다.
광세기에 따른 상관함수를 얻기 위해 레이저에 neutral density filter를 두어 1~10 μW 범위에서는 1 μW 간격으로, 10~50 μ W 범위에서는 10 μW 간격으로 광세기를 조절하였다.
본 연구에서는 632.8 nm 파장의 He-Ne 레이저를 광원으로 사용하는 형광상관분광법 장치를 자체 제작하고, AF647과 Qdot655 각각을 증류수에 희석하여 시료로 사용하였다. 각 시료에 대해 광원의 세기를 1~50 μW 범위 내에서 변화시켜 가며 얻어진 상관함수를 비교 분석하였다.
본 연구에서는 여기광의 세기에 따른 유효 초점의 부피 변화를 분석하기 위해, 모양과 크기가 다른 두 종류의 입자 AlexaFluor647과 quantum dot에 대해 광 세기를 달리하여 FCS 초점 영역 대한 형광 입자수와 확산시간의 상관성을 비교하고, 형광입자의 확산시간을 통해 여기광의 세기에 따른 초점 영역의 변화를 분석하였다.

대상 데이터

공초점현미경의 초점 내에서 확산하는 입자를 이용하여 유효 초점 부피를 확인하기 위해서는 입자가 용액 내에 존재해야 하고, 평균적으로 수 개 내지 수 십개의 입자만 출입하는 상태를 유지해야 한다. 따라서 실제로 실험에 사용한 시료들은 각 입자들을 증류수에 희석한 수 nM 농도의 AF647 수용액과 Qdot655 수용액이다. 사용된 시료 AF647와 Qdot655의 농도는 약 1 nM로 희석하여 실험하였다.
유효 초점 부피 측정을 위해 Fig. 3과 같이 크기가 다른 두 시료 Alexa fluor 647(AF647, Invitrogen, A20006)과 Quantum dot(Qdot655, Invitrogen, Q21321MP)를 준비하였다. AF647은 확산계수가 알려져 있는 표준 시료로서, 분자량이 약 1300 g/M이고, 흡수 및 방출 최대 파장이 각각 650 nm, 668 nm이다.
초기 진폭의 역수는 초점 영역 내에 존재하는 평균적인 입자의 개수를 의미한다. 입자수의 변화는 농도가 서로 다른 시료들에 대해 정확한 농도 변화 측정과 관련이 있지만, 본 연구에서 사용된 시료는 농도가 일정한 시료를 사용함에 따라 농도 영향을 배제하고 유효 초점 영역의 변화를 고려할 수 있다. 초점 영역의 변화에 대해 보다 자세히 확인하기 위해 초기 진폭과 확산 시간을 광 세기별로 Fig.

성능/효과

10 μW 이하의 약한 광 세기에서는 세기 변화에 따라 입자수와 확산시간이 증가하는 것을 통해 초점 영역의 반지름이 선형적으로 증가하는 결과를 보였고, 10~15 μW 이상에서는 초점 영역의 크기 변화율이 크게 감소하는 결과를 보였다.
그리고 10~15 μW를 통해서 다른 두형태의 중간지점이 되는데 여기광의 세기가 10 μW 이하에서는 시료의 형광방출 효율이 낮게 나타나다가 10~15 μW 이상에서는 충분한 형광방출 효율이 나타났다.
두 입자에 대해 10~15 μW 세기를 기준으로 확산시간의 기울기 변화 양상이 동일하다는 것을 통해 유효 초점 영역이 두 입자에 대해 동일하게 적용됨을 알 수 있다.
실제 실험에 측정된 측정영역의 반치폭의 크기는 0.25~0.41 μm이고, 광세기가 증가하여 측정되는 반치폭이 0.644 μm가 된다면 측정영역의 크기는 일정해질 것으로 판단된다.
실험적으로 얻어진 Qdot655의 확산 계수와 확산 시간을 통해 w 를 다시 계산하고, 이를 바탕으로 타원형의 유효 초점의 부피를 계산할 수 있었다. 광세기별로 계산된 유효 초점 부피는 Fig.
유효 초점 영역 확인을 통해 Qdot655의 확산 계수는 12.2±4.1 μm2/s로 결정할 수 있었다.

후속연구

본 연구를 통해 여기 광원의 세기에 따른 측정영역 부피변화를 확인할 수 있었고, 이러한 측정영역 부피변화를 통해 다양한 크기를 가진 형광 입자들의 정보를 좀더 정확하게 분석할 수 있을 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	형광상관분광법가 제공하는 것은?	형광상관분광법(FCS; fluorescence correlation spectroscopy) 은 미소영역에서 형광분자들의 움직임에 따라 방출되는 형광의 세기변화를 상관함수의 형태로 변환하여 그 결과를 분석하는 기술로서, 형광분자에 대한 확산계수, 확산하는 분자의 동역학적 반지름, 수 nM 수준의 낮은 농도에서 용액의 정량적인 농도 등과 같은 다양한 정보들을 제공한다.[1-4] FCS 기술은 1970년대에 Elson, Magde, Webb에 의해 처음 고안되고 개발된 기술이었지만, 광원, 광검출기, 광학시스템과 같은 기술적 한계에 의해 실용화되지 못하다가,[5-7] 1990년대에 들어 발달된 공초점 시스템, 고효율의 광검출기, 고분해능 상관기들에 의해 성능이 향상되면서 오늘날 바이오-메디컬 분야에서 매우 유용한 기술로 자리 매김하고 있다.
	형광상관분광법이란?	형광상관분광법(FCS; fluorescence correlation spectroscopy) 은 미소영역에서 형광분자들의 움직임에 따라 방출되는 형광의 세기변화를 상관함수의 형태로 변환하여 그 결과를 분석하는 기술로서, 형광분자에 대한 확산계수, 확산하는 분자의 동역학적 반지름, 수 nM 수준의 낮은 농도에서 용액의 정량적인 농도 등과 같은 다양한 정보들을 제공한다.[1-4] FCS 기술은 1970년대에 Elson, Magde, Webb에 의해 처음 고안되고 개발된 기술이었지만, 광원, 광검출기, 광학시스템과 같은 기술적 한계에 의해 실용화되지 못하다가,[5-7] 1990년대에 들어 발달된 공초점 시스템, 고효율의 광검출기, 고분해능 상관기들에 의해 성능이 향상되면서 오늘날 바이오-메디컬 분야에서 매우 유용한 기술로 자리 매김하고 있다.
	형광상관분광법을 개발한 사람은?	형광상관분광법(FCS; fluorescence correlation spectroscopy) 은 미소영역에서 형광분자들의 움직임에 따라 방출되는 형광의 세기변화를 상관함수의 형태로 변환하여 그 결과를 분석하는 기술로서, 형광분자에 대한 확산계수, 확산하는 분자의 동역학적 반지름, 수 nM 수준의 낮은 농도에서 용액의 정량적인 농도 등과 같은 다양한 정보들을 제공한다.[1-4] FCS 기술은 1970년대에 Elson, Magde, Webb에 의해 처음 고안되고 개발된 기술이었지만, 광원, 광검출기, 광학시스템과 같은 기술적 한계에 의해 실용화되지 못하다가,[5-7] 1990년대에 들어 발달된 공초점 시스템, 고효율의 광검출기, 고분해능 상관기들에 의해 성능이 향상되면서 오늘날 바이오-메디컬 분야에서 매우 유용한 기술로 자리 매김하고 있다.[8]

참고문헌 (16)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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