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문제 정의
- 본 연구진들은 헛개나무 열매 열수추출물을 알코올에 의한 간손상 보호작용으로 건강기능 식품을 개발한 바가 있으며, 많은 사람들이 헛개나무 열매 열수추출물을 복용한 후 피로를 덜 느낀다고 하였다. 이를 바탕으로 본 연구에서는 헛개나무 열매 열수추출물의 항피로 작용 및 지구력 작용을 관찰하고자 실험동물을 사용하여 헛개나무 열매 열수 추출물이 탈진될 때까지 강제유영(forced swimming)을 할 수 있는 지구력에 대하여 관찰하였다.
제안 방법
- 17) 헛개나무 열매 열수추출물(HD)의 지구력 운동에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 HD를 kg당 100 mg(HD-100)과 200 mg(HD-200군)을 2주간과 4주간 투여한 후 탈진 때까지 수영하는 강제수영능력을 측정하였다(Fig. 1). 2주간 HD를 투여하였을 때 대조군은 42.
- 간내 항산화 효소활성 및 과산화지질 분석 − 운동은 생체내의 자유기(free radical) 형성을 증가시키고 이는 세포의 막들을 산화적 손상을 유발하므로 탈진 때까지 강제수영한 생쥐로부터 간을 적출하여 항산화 효소활성 및 과산화지질 정도를 분석하였다.
- 강제 유영 운동 − 헛개나무 열매 열수추출물 투여가 생쥐의 운동 지구력에 미치는 영향을 평가하기 위하여 강제유영시험을 실시하였으며, 강제유영시험은 Jung 등의 방법20)을 변형시켜 실시하였다.
- 본 연구에서는 헛개나무열매 열수추출물이 지구력에 미치는 영향에 대하여 HD를 2주 또는 4주간 투여한 후 생쥐가 탈진될 때까지 강제유영시키는 동물모델(weight-loaded forced swim test)을 이용하여 수영시간의 증가를 측정하였다. 그리고 기전을 확인하기 위하여 산화적 스트레스 예방, 호기성 포도당 대사의 촉진 및 피로와 관련된 생화학 파라미터 등에 초점을 맞춰 실험을 실시하였다. 생쥐를 매주 수영훈련 시켰으며, 생쥐 2주와 4주 대조군을 비교하였을 때 수영시간이 약 60%가 증가되었으며, 특히 HD 투여에 의하여 투여기간 및 투여 농도에 따라 대조군에 비하여 최대 수영시간이 유의적으로 증가되었으며, 특히 200 mg/kg HD를 4주간 투여한 군에서는 대조군에 비하여 2.
- 본 연구에서는 헛개나무열매 열수추출물이 지구력에 미치는 영향에 대하여 HD를 2주 또는 4주간 투여한 후 생쥐가 탈진될 때까지 강제유영시키는 동물모델(weight-loaded forced swim test)을 이용하여 수영시간의 증가를 측정하였다. 그리고 기전을 확인하기 위하여 산화적 스트레스 예방, 호기성 포도당 대사의 촉진 및 피로와 관련된 생화학 파라미터 등에 초점을 맞춰 실험을 실시하였다.
- 실험동물 − 5주령의 ICR 수컷생쥐(Central Lab. Animal Inc., Korea)를 구입하여 1주일간 순화시킨 후 건강상태에 이상이 없고 운동적응훈련에 저항하지 않으며, 순화기간 종료일의 평균체중에 가까운 생쥐를 음성대조군(control), 헛개나무 열매 열수추출물(HD) 100 및 200 mg/kg 용량의 저용량(HD-100), 고용량(HD-200) 총 3 군으로 나누어 각 군당 20 마리씩 배정하였다.
- , Korea)를 구입하여 1주일간 순화시킨 후 건강상태에 이상이 없고 운동적응훈련에 저항하지 않으며, 순화기간 종료일의 평균체중에 가까운 생쥐를 음성대조군(control), 헛개나무 열매 열수추출물(HD) 100 및 200 mg/kg 용량의 저용량(HD-100), 고용량(HD-200) 총 3 군으로 나누어 각 군당 20 마리씩 배정하였다. 실험동물은 온도(18.1-22.7℃), 습도(32-61%), 12시간 조명(12시간 명/암)이 자동적으로 유지되는 사육실에서 무균음수와 실험동물사료(Harlan Laboratories, Inc., U.S.A.)가 자유롭게 공급되는 환경에서 사육하였다. 본 시험은 동물보호법에 근거한 ㈜바이오톡스텍의 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다.
- 알코올성 간손상 보호 작용으로 기능성 식품으로 사용하고 있는 헛개나무 열수추출물이 지구력 향상 및 항피로 작용이 있다고 하여 생쥐의 강제수영능력 동물모델을 이용하여 평가를 실시하였다. HD를 100 또는 200 mg/kg 용량을 2주 또는 4주간 생쥐에 경구투여하여 탈진 때까지 강제수영 능력 시간을 측정하였을 때 수영시간이 2주째에는 대조군은 42.
- , Germany)를 이용하여 25±2℃의 수온을 유지시켰다. 유영운동 적응 훈련은 시험 물질 투여 1시간 후에 마우스 체중의 4%에 해당하는 무게추를 마우스꼬리에 부착하고 20분동안 강제수영을 실시하였으며, 최대수영시간 측정 전까지 2주차에는 30분, 3주차에는 40분까지 운동시간을 점차적으로 증가시켜 주 1회 유영운동 적응훈련을 실시하였다. 최대유영능(exhaustive swimming)측정은 시험물질 투여 2, 4주째에 유영운동 적응 훈련과 같은 방법으로 각 시험군당 10 마리의 동물에 대하여 생쥐의 코가 수면 아래로 5초 이상 가라앉을 시점(탈진)까지 강제수영운동을 실시하였다.
- )의 분석 Kit ECLC-100, EFFA-100를 이용하여 제조사의 권장 프로토콜에 따라 각각 측정하였다. 조직 내 항산화 활성 분석은 액체질소로 급속 동결시킨 간 조직 시료에 대한 분석 kit들을 이용하여 Commercial thiobarbituric acid reactive substance(TBARS; Cell Biolabs Inc., U.S.A.), superoxide dismutase(SOD; Cell Biolabs. Inc., U.S.A.), catalase(CAT; Bioassay System, U.S.A.)의 제조사의 권장 프로토콜에 따라 각각의 활성을 측정하였다.
- 조직적출 및 중량측정 − 혈당은 최대유영능 측정 후 수면에서 생쥐를 꺼내 간이 혈당측정기(Onetouch ultra™, LifeScan Inc., U.S.A.)를 이용하여 혈당을 측정한 후 Isoflurane(중외제약)으로 마취한 후 개복하여 복대정맥으로부터 혈액을 채취하였다.
- 유영운동 적응 훈련은 시험 물질 투여 1시간 후에 마우스 체중의 4%에 해당하는 무게추를 마우스꼬리에 부착하고 20분동안 강제수영을 실시하였으며, 최대수영시간 측정 전까지 2주차에는 30분, 3주차에는 40분까지 운동시간을 점차적으로 증가시켜 주 1회 유영운동 적응훈련을 실시하였다. 최대유영능(exhaustive swimming)측정은 시험물질 투여 2, 4주째에 유영운동 적응 훈련과 같은 방법으로 각 시험군당 10 마리의 동물에 대하여 생쥐의 코가 수면 아래로 5초 이상 가라앉을 시점(탈진)까지 강제수영운동을 실시하였다.
- 6 µg/g 이었으며, 한국기능식품연구원(분당, 경기도)에서 분석하였다. 추출물은 100 mg/10 ml/kg(HD-100군) 또는 200 mg/10 ml/kg(HD-200군) 용량으로 투여 직전에 주사용수에 용해시켜 1일 1회 2주 또는 4주간 경구투여 하였으며, 대조군은 10 ml/kg 용량의 주사용수를 투여하였다.
- 헛개나무 열수추출물은 지표성분이 quercetin 량을 Tosoh ODS column(4.6×150 mm, 5 µm)을 이용하여 an Agilent Technologies 1200 Series HPLC system(Model Agilent Technologies 1200 Series DAD SL G1315C. USA)으로 분석하였으며, quercetin peak는 254 nm에서 측정하였다.
- 혈장내의 임상생화학적 성상 측정 − 채취된 혈액은 heparin이 함유된 tube에 넣고 항 응고 처리한 후 3000xg로 10분간 원심 분리하여 혈장을 분리하고, 혈액생화학 분석기(7080, HITACHI, Japan)를 이용하여 blood urea nitrogen(BUN), lactate dehydrogenase(LDH), Alanine aminotransferase (ALT), creatinine(Crea), aspartate aminotransferase(AST), total cholesterol(T-Chol) 및 triglyceride(TG)를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 헛개나무 열수추출물 분말 내 quercetin 함량은 7.6 µg/g 이었으며, 한국기능식품연구원(분당, 경기도)에서 분석하였다.
- 실험물질 조제 및 경구투여 − 본 실험에 사용한 헛개나무 열매 열수추출물은 ㈜생명의 나무(수원, 경기도)에서 제공하였다.
데이터처리
- 등 분산성이 기각된 경우에는 Kruskal-Wallis test 를 실시(P<0.05)하여 유의성이 관찰되어 대조군에 대한 각 시험군의 유의성을 확인하기 위해 Steel's test를 실시(P<0.05)하였다.
- 등분산성인 경우 One-way analysis of variance (ANOVA)를 실시(P<0.05)하여, 유의성이 관찰되면 대조군에 대한 각 시험군의 유의성을 확인하기 위해 Dunnett's t-test 의 다중검정을 실시하였다(P<양측 0.05).
- 정량치 항목(data type: quantitative value)은 Bartlett test를 실시하여 등분산성을 검정하였다(P<0.05).
- 통계학적 분석 − 실험에서 얻어진 수영시간, 혈당, 장기중량, 혈액생화학적 검사, Lactic acid, free fatty acid 및 항산화 활성 검사의 데이터는 SAS(Version 9.2, SAS Institute Inc., U.S.A.)를 사용하여 검정하였다.
이론/모형
- 실험물질 조제 및 경구투여 − 본 실험에 사용한 헛개나무 열매 열수추출물은 ㈜생명의 나무(수원, 경기도)에서 제공하였다. 헛개나무 열매를 물과 1:10(W/V)의 비율로 95℃에서 4시간 추출한 후 spray-dry 방법으로 건조시켰다. 헛개나무 열수추출물은 지표성분이 quercetin 량을 Tosoh ODS column(4.
- 혈액 및 조직 내 Lactic Acid, Free Fatty Acid 및 항산화활성 분석 − 혈액 내 lactic acid(LA) 및 free fatty acid(FFA) 농도는 Bioassay System사(U.S.A.)의 분석 Kit ECLC-100, EFFA-100를 이용하여 제조사의 권장 프로토콜에 따라 각각 측정하였다.
성능/효과
- Yoshikawa 등(1997)은 헛개나무 열매와 씨 추출물에서 (+)-ampelopsin, laricetrin, myricetin, (+)-gallocatechin 등의 flavonoid류와 hovenitin I, II, III과 같은 dihydroflavonol류를 분리하였으며, 이 중에서 hovenitin I은 생쥐에서 D-galactosamine/lipopolysaccharide 또는 사염화탄소 유도 간독성을 보호한다고 보고하였다.12) 헛개나무 열매 추출물에서 분리한 hovenodulinol은 쥐의 알코올 분해에 효과가 있고, (+)-ampelopsin은 일차배양 rat 간세포에서 사염화탄소 유도 간세포독성을 저해하였으며,13) (+)-dihydromyricetin이 알코올 분해 및 간 기능 회복에 효과가 있다고 발표되었다.14) Li 등(2005)은 헛개나무 씨 추출물로부터 8종의 페놀화합물을 분리하였으며, 그 중에서 (-)-catechin과 afzelechin이 glutamate 유도 신경독성을 저해한다고 보고하였다.
- 고강도 운동시 산소 공급량이 근육의 산소 소모량에 미치지 못하는 경우 근육조직의 젖산 농도가 증가되고 이때 생성된 젖산은 혈액으로 확산되어 간에서 처리된다.2) 따라서 HD가 triglyceride를 fatty acid로의 전환을 촉진하여 에너지 보충을 원활하게 함과 동시에 호기적 ATP 생성 경로가 활발해져서 4주째에는 HD 투여군의 운동시간이 대조군에 비하여 크게 증가되었으나 lactate 생성량이 상대적으로 감소되는 것으로 사료되었다.
- 즉, 과격한 운동 후에 생성된 산소 자유기들(oxygen free radicals) 중 superoxide anion은 SOD에 의하여 과산화수소를 생성하고 이는 catalase에 의하여 물과 산소로 분해되므로 catalase 효소 활성의 증가는 SOD에 의하여 생성된 과산화수소를 제거하여 지질 과산화를 저해한다.2) 수영시간이 대조군에 비하여 2배이상 길었던 HD 처리군들은 산소 자유기들의 생성량이 대조군보다 많았을 것으로 예상되며 2주째에는 HD 처리군의 catalase 활성이 증가되지 않아 수영시간과 비례하여 지질과산화가 일어났으나, 4주째에는 catalase 활성이 증가되어 지질과산화 생성량이 대조군과 유사하게 나타난 것으로 사료되었다.
- 19-22) 동중하초 열수추출물을 150 또는 300 mg/kg 용량으로 1주간 투여하였을 때 탈진될 때까지 수영시간이 약 20% 정도 증가되었으며,19) 복분자 추출물 500 mg/kg 용량을 4주간 투여한 후에는 25% 정도가 증가되었다.20) 녹차추출물을 0.2%와 0.5%로 식이에 섞어 10주간 투여하면서 매주 생쥐가 탈진될 때까지 강제수영 시켰을 때 대조군은 10주 후에 약 25%정도 수영시간이 증가하였으며, 녹차를 0.2와 0.5% 함유하는 식이를 먹인 생쥐에서 각각의 대조군에 비하여 4%와 24%가 각각 증가되었다.21) 그리고 호박추출물(Cucurbita moschata) 250 mg/kg을 2주간 투여하였을 때 수영시간이 1.
- 4주간 HD를 투여하였을 때 대조군 수영시간은 67.7±47.8분으로 HD-100과 HD-200군에서는 각각 127.38±50.63분과 185.05±23.58분으로 증가되었다.
- 일반적으로 운동수행 중 혈중 glucose 농도의 감소와 triglyceride와 free fatty acid의 증가는 에너지 소비를 반영하며, lactate의 증가는 오랜 운동에 피로한 상태를 나타낸다. HD를 2주간 투여했을 때 대조군에 비하여 glucose 농도는 감소되었으며, free fatty acid 농도는 유의적인 변화가 없었으나 TG 농도는 유의적으로 감소되었다. 그리고 혈중 lactate 농도 역시 증가하는 경향을 나타내었으나 통계학적 유의성을 나타내지 않았다.
- Table III에서와 같이 superoxide dismutase(SOD)의 활성 및 과산화 지질량은 2주간이나 4주간 HD 투여군 모두에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 그러나 catalase는 2주간 HD 투여군은 유의적 변화가 없었으나 4주간 HD 투여군에서는 농도의존적으로 유의적으로 증가되었다.
- 7배가 증가되었다. 그러나 혈액 생화학적 지표를 관찰하였을 때 HD 군이수영시간이 크게 증가되었으나 대조군과는 유의적인 차이가 없었으며, 특히 혈중 LDH level은 대조군보다 낮은 경향을 나타내었다(Table II). 천연물 추출물의 항피로 및 지구력 작용에 대한 보고는 많이 있으며 지구력 및 항피로 작용에 대한 지표로서 생쥐가 탈진될 때까지 강제수영 시키는 동물모델을 사용하고 있다.
- 반면에 HD를 4주간 투여했을 때 역시 운동시간이 용량의존적으로 증가되는 양상이 나타났으나 혈중 glucose level은 전반적으로 유의적인 변화가 나타나지 않았으며, HD-200군에서는 오히려 증가하는 듯한 경향이 나타났다. 그리고 triglyceride나 free fatty acid는 군간의 차이가 나타나지 않았으며, lactate 농도는 통계학적으로 유의적이지는 않았으나 HD 용량 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다(Fig 4). 젖산은 해당작용과 TCA cycle의 대사적 연계가 당량비로 진행되지 못하고 해당작용이 부족할 때 생성된다.
- 05), 체중 100 g 당 무게로 환산했을 때에는 유의성을 나타내지 않았다. 근육의 무게는 2주 동안 HD 투여군 모두에서 100 g 당 근육 무게가 유의적으로 증가되었으나 4주간 HD투여군에서는 유의적인 변화가 없었다(Table I).
- 특히 생쥐를 매주 수영 연습을 시켜 대조군도 수영시간이 2주째에는 평균 43분이었으나 4주째에는 평균 68분으로 증가되었으며 이에 따라 혈중 glucose 량과 triglyceride 량이 이 2주째와 비교했을 때 약 55% 정도가 감소되었다. 반면에 HD를 4주간 투여했을 때 역시 운동시간이 용량의존적으로 증가되는 양상이 나타났으나 혈중 glucose level은 전반적으로 유의적인 변화가 나타나지 않았으며, HD-200군에서는 오히려 증가하는 듯한 경향이 나타났다. 그리고 triglyceride나 free fatty acid는 군간의 차이가 나타나지 않았으며, lactate 농도는 통계학적으로 유의적이지는 않았으나 HD 용량 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다(Fig 4).
- 그리고 기전을 확인하기 위하여 산화적 스트레스 예방, 호기성 포도당 대사의 촉진 및 피로와 관련된 생화학 파라미터 등에 초점을 맞춰 실험을 실시하였다. 생쥐를 매주 수영훈련 시켰으며, 생쥐 2주와 4주 대조군을 비교하였을 때 수영시간이 약 60%가 증가되었으며, 특히 HD 투여에 의하여 투여기간 및 투여 농도에 따라 대조군에 비하여 최대 수영시간이 유의적으로 증가되었으며, 특히 200 mg/kg HD를 4주간 투여한 군에서는 대조군에 비하여 2.7배가 증가되었다. 그러나 혈액 생화학적 지표를 관찰하였을 때 HD 군이수영시간이 크게 증가되었으나 대조군과는 유의적인 차이가 없었으며, 특히 혈중 LDH level은 대조군보다 낮은 경향을 나타내었다(Table II).
- 58분으로 증가되었다. 이러한 각 군의 수영시간은 2주간 HD 투여에 의하여 수영시간이 각각 3.6배와 3.7배가 증가되었고, 4주간 HD를 투여하였을 때 각각 1.9배와 2.7배로 증가되었다. 즉, HD 투여에 의하여 2주부터 수영시간이 유의적으로 증가되었으며, 이러한 결과는 HD 투여가 생쥐의 지구력이 증가되었음을 나타내었다.
- 아울러 간 내 catalase 활성이 유의적으로 증가하여 지질과산화 량도 대조군과 유사하게 나타났다. 이러한 결과들은 헛개나무열매 추출물이 항피로 작용와 지구력 증가에 효능을 나타내는 것으로 사료되었다.
- 99배 증가하였으며,22) 그 외 우장지 버섯(Antrodia camphorate) 추출물,23) bacoside 추출물,24) 홍경천,25) 가시오가피26) 등에 의하여 수영시간이 20-300% 정도가 증가됨이 보고되었다. 이러한 여러 천연물 추출물의 항피로작용 결과들과 비교하였을 때 본 연구에서는 4주간 매주 1회씩 mice에 수영연습을 시킨 효과로 인해 대조군의 수영 시간이 상대적으로 매우 오랜 기간임에도 불구하고 4주간 HD를 투여하였을 때 수영시간이 대조군에 비하여 약 275% 정도 증가된 것으로 보아 HD가 우수함을 알 수 있었다.
- 장기 무게에서는 HD 투여에 의하여 간의 무게는 4주간 투여한 HD-200군에서 유의적으로 증가되었으나(P<0.05), 체중 100 g 당 무게로 환산했을 때에는 유의성을 나타내지 않았다.
- 7배로 증가되었다. 즉, HD 투여에 의하여 2주부터 수영시간이 유의적으로 증가되었으며, 이러한 결과는 HD 투여가 생쥐의 지구력이 증가되었음을 나타내었다.
- 이때 혈액생화학적 지표는 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았으나 운동과 관련된 바이오마커들 즉, 혈중 glucose, triglyceride 및 free fatty acid, lactate 량을 비교 하였을 때 4주째에 HD에 의하여 바이오마커들이 개선되었다. 즉, 비록 통계학적 유의성은 없었으나 4주째에는 2배이상 오랫동안 수영한 HD 투여군에서 오히려 혈중 glucose level과 triglyceride가 HD 용량 의존적으로 증가하는 양상을 나타낸 것은, HD가 triglyceride를 fatty acid로의 전환을 촉진하여 에너지 보충을 원활하게 함과 동시에 호기적 ATP 생성 경로가 활발해져서 HD 투여군의 수영시간이 대조군에 비하여 크게 증가되었고, lactate 생성량이 상대적으로 감소되는 양상이 나타난 것으로 예상되었다. 아울러 간 내 catalase 활성이 유의적으로 증가하여 지질과산화 량도 대조군과 유사하게 나타났다.
- 체중 및 장기무게 변화 − 시험기간 동안 각 군별 체중 변화는 Fig. 2와 같았으며, 시험 시작 시 체중과 시험 종료 시 체중의 변화가 없었으며, 즉 HD투여에 의한 체중 증가가 군간의 유의적 변화가 없었다.
- 7배 오랫동안 수영을 했으므로 피로에 대한 지표들이 개선되지 않은 것으로 사료되었다. 특히 생쥐를 매주 수영 연습을 시켜 대조군도 수영시간이 2주째에는 평균 43분이었으나 4주째에는 평균 68분으로 증가되었으며 이에 따라 혈중 glucose 량과 triglyceride 량이 이 2주째와 비교했을 때 약 55% 정도가 감소되었다. 반면에 HD를 4주간 투여했을 때 역시 운동시간이 용량의존적으로 증가되는 양상이 나타났으나 혈중 glucose level은 전반적으로 유의적인 변화가 나타나지 않았으며, HD-200군에서는 오히려 증가하는 듯한 경향이 나타났다.
- 혈액의 생화학적 지표 분석 − 간손상의 지표인 alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), 신장손상의 지표인 blood urea nitrogen(BUN), creatinine과 총 콜레스테롤의 혈중 농도를 측정하였을 때 HD 투여에 의한 유의적인 변화를 나타내지 않았다(Table II).
- 혈중 glucose level(Fig. 3A)은 HD 투여 2주 대조군은118.2±45.9mg/dl이었으나 HD-100군과 HD-200군은 각각 72.7±41.6과 42.0±14.19 mg/dl로 HD 용량이 증가할수록 감소되는 경향을 나타내었다.
- 혈중 triglyceride level(Fig. 3B)은 glucose와 유사한 양상을 나타내었으며, HD 투여 2주 대조군은 160.5±38.3 mg/dl이었으나 HD-100군과 HD-200군은 87.4±44.7와 94.0±30.5 mg/dl로 감소하였으나 HD 투여용량에 따른 차이를 보이지 않았다.
- 혈청 내 Lactate 함량 분석 − Lactate는 운동 후 피로상태를 반영하는 생체지표 중 하나로 HD 투여 2주 대조군은 2.76±0.61 mM로 HD-100군은 3.98±1.36 mM, HD-200군은 3.65±1.23 mM로 측정되어 수영을 오랫동안 실시한 HD 처리군들이 통계학적으로 유의적은 아니지만 lactate 함량이 증가된 것으로 나타났다.
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