[논문]곡기생(槲寄生)의 항염증 효능 및 암세포 이주저해에 미치는 영향

김현영; 장수영; 정지천; 신현철

곡기생(槲寄生)의 항염증 효능 및 암세포 이주저해에 미치는 영향
The Effects of Gokgisaeng on Anti-inflammation and Rat C6 Glioma Cell Migration 원문보기

대한한방내과학회지 = The journal of internal Korean medicine, v.34 no.1, 2013년, pp.31 - 45

김현영 (대구한의대학교 한의과대학 내과학교실) , 장수영 (대구한의대학교 한의과대학 내과학교실) , 정지천 (동국대학교 한의과대학 내과학교실) , 신현철 (대구한의대학교 한의과대학 내과학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : Gokgisaeng (Korean mistletoe) is used for the treatment of inflammatory and cancer diseases in traditional Korean medicine and its major component lectins have been reported to induce nitric oxide (NO) in RAW 264.7 macrophages, and also induce apoptosis of various types of cancer cells, although its modulatory effects on cancer cell migration and macrophage activation is poorly understood. The aim of this study is to clarify molecular mechanisms of action responsible for the anti-inflammatory and antitumor migration potentials of Korean mistletoe extract (KME). Methods : We investigated the anti-inflammatory activity of KME on NO production and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression by lipopolysaccharide (LPS) in both RAW 264.7 macrophages and rat C6 glioma cells, and also evaluated inhibitory efficacy on glioma cell growth and migration. For assessment, XTT assay, nitrite assay, RT-PCR, scratch-wound and Boyden chamber assay, and western blot analysis were performed. Results : Previously reported, unlike the efficacy of Gokgisaeng lectin, KME inhibited NO production and iNOS expression, and suppressed pro-inflammatory mediators including IL-$1{\beta}$, IL-6, COX-2, iNOS in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Furthermore, KME suppressed tumor cell growth and migration, and it also inhibited LPS-induced NO release and iNOS activation by down-regulating expression of protein kinase C (PKC) and phosphorylation of ERK in C6 glioma cells. Conclusions : Our research findings provide evidence that KME can play a significant role in blocking pro-inflammatory reaction and malignant progression of tumors through the suppression of NO/iNOS by down-regulating of inflammatory signaling pathways, PKC/ERK.

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문제 정의

Fig. 8에서 KME는 LPS의 자극을 받은 C6 신경교종 세포로부터 생성된 NO를 현저하게 억제하였으므로, 이러한 결과가 iNOS의 발현을 저해함에 기인했을 것으로 판단되어 본 실험에서는 단백질수준에서 확인해 보았다. 그 결과, 아무런 처리도하지 않은 대조군에 비해 LPS 단독 처리군에서 iNOS의 발현이 강하게 증가하였다.
7 대식세포를 이용하여 항염증 효능을 확인하고, 흰쥐 C6 신경교종 세포를 대상으로 세포 성장 및 증식에 대한 영향과 이주저해 활성을 검토하였다. 더불어 LPS로 유도된 NO의 과다 생성과 iNOS 및 PKC 단백질 발현에 대한 억제효과를 분석한 결과, 본 약물이 암세포 사멸보다는 PKC 발현 억제를 통한 이주저해기능이 있었기에 보고하는 바이다.
. 따라서 본 연구에서는 PKC 단백질 발현에 대한 KME의 영향을 검토함으로써 암세포 이주억제 기전을 보다 심도있게 규명하고자 하였다. 그 결과, LPS의 자극을받은 신경교종 세포에서 PKC 단백질 발현이 증가하였고, KME는 LPS로 유도된 PKC 단백질 발현을 억제하였다.
이에 KME의 암세포 이주 저해 활성을 보다 구체적으로 규명하기 위하여, C6 신경교종 세포를 LPS로 자극함으로써 NO 과다 생성과 iNOS의 과발현을 유도한 다음, 본 약물의 효능을 검토하였다. 과다 발현된 iNOS와 이로 인해 과다 생성된 NO는 발암, 세포이주 및 침윤을 야기하고^14-16, 정상세포의 변형과 신생혈관 형성을 통해 뇌종양, 유방암및 폐암 등의 악성 진행에 관여하며, 특히 뇌종양에서 iNOS의 높은 발현이 관찰되어지는 것으로 알려져 있다^21,48.
이에 본 연구에서는 槲寄生(한국산 겨우살이)을 증류수로 전탕한 다음 알콜 침전법을 이용해 추출물을 조제해, 신경교종 치료제 혹은 종양의 악화방지제로서의 개발 가능성을 검토하였다. 먼저 RAW 264.
이에 본 연구에서는 槲寄生(한국산 겨우살이)의 신경교종 질환에 대한 새로운 항암제로서의 개발가능성을 알아보고자 RAW 264.7 대식세포를 이용하여 항염증 효능을 확인하고, 흰쥐 C6 신경교종 세포를 대상으로 세포 성장 및 증식에 대한 영향과 이주저해 활성을 검토하였다. 더불어 LPS로 유도된 NO의 과다 생성과 iNOS 및 PKC 단백질 발현에 대한 억제효과를 분석한 결과, 본 약물이 암세포 사멸보다는 PKC 발현 억제를 통한 이주저해기능이 있었기에 보고하는 바이다.

제안 방법

C6 신경교종 세포에서 LPS로 유도된 NO 생성량에 미치는 KME의 영향을 nitrite assay로 관찰하였다. C6 신경교종 세포에 농도별 KME를 전처리하고, NO의 생성을 유도하기 위해 LPS(100 ng/ml)를 처리하였다. 그 결과, 아무런 처리도 하지 않은 대조군(10.
C6 신경교종 세포에서 LPS로 유도된 NO 생성량에 미치는 KME의 영향을 nitrite assay로 관찰하였다. C6 신경교종 세포에 농도별 KME를 전처리하고, NO의 생성을 유도하기 위해 LPS(100 ng/ml)를 처리하였다.
C6 신경교종 세포의 이주에 미치는 KME의 영향을 규명하기 위하여 scratch-wound assay를 이용해 24시간 동안 wound healing의 정도를 관찰하였다. 현미경 사진에서 조밀하게 단층으로 배양된 점선외부의 세포들은 24시간 동안 피펫 팁으로 scratch를가해 세포를 제거한 점선 내부로 점차적인 이주현상을 보인다(Fig.
FBS로 유도된 C6 신경교종 세포의 증식에 미치는 KME의 영향을 검토하기 위하여 혈청 무첨가군(FBS-), 혈청 단독 첨가군(FBS+)에 대한 세포생존율을 XTT assay로 비교 관찰하였다. 그 결과, 혈청 무첨가군에서는 세포생존율이 100.
KME가 혈청으로 유도된 C6 신경교종 세포의 이주에 대하여 억제 활성을 나타내는지를 보다 명확히 규명하고자 Boyden chamber에 세포를 주입하고, 3시간 동안 배양한 다음, polycarbonate membrane을 통과하여 이주가 일어난 세포만을 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 혈청 무처리군(FBS-)에서 일어난 세포의 이주를 100%로 보았을 때, 혈청 단독처리군(FBS+)에서는 이주된 세포가 현저하게 증가(293.
KME의 항염증 효능을 보다 구체적으로 검토하기 위하여 RAW 264.7 세포를 LPS(100 ng/ml)로 자극한 다음, IL-1β, IL-6, COX-2 및 iNOS와 같은 염증반응 매개물질들의 mRNA 발현에 대한 KME의 저해효과를 RT-PCR법으로 검토하였다.
Raw 264.7 세포에서 KME의 세포독성을 검토하고자 농도별 KME를 처리한 다음, XTT assay로 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, KME는 10 µg/ml에서 500 µg/ml의 농도범위에서는 아무런 세포독성을 나타내지 않았으나, 1000 µg/ml 및 2000 µg/ml의고농도 처리군에서는 세포생존율이 각각 74.
Raw 264.7 세포에서 KME의 항염증 효능을 검토하기 위하여 LPS(100 ng/ml)로 유도된 NO 생성량에 대한 효능을 관찰하였다. 그 결과, 아무런 처리도 하지 않은 대조군(3.
XTT assay의 결과를 바탕으로 KME의 암세포이주 저해능을 평가하기 위하여 scratch-wound assay와 Boyden chamber assay를 통해 검토하였다. 그결과, 혈청 첨가로 인해 신경교종 세포의 이주가 현저하게 증가하였고, KME는 혈청으로 유도된 세포 이주를 강하게 억제하였다.
槲寄生(한국산 겨우살이)의 항암효과를 알아보기 위하여 RAW 264.7 대식세포를 이용해 항염증효능을 확인하고, 흰쥐 C6 신경교종 세포를 대상으로 세포성장 및 증식에 대한 영향과 세포 이주저해 활성을 검토하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
하단 chamber에는 FBS와 농도별 KME(0, 10, 100, 200, 500 µg/ml)를 주입한 다음, 5% CO₂, 37 ℃ incubator에서 3시간 동안 배양하여 세포의 이주를 유도하였다. 그 후 membrane 상단 부위의 세포는 면봉으로 제거하고, migration이 진행된 하단 부위의 세포만을 메탄올로 고정해 Giemsa stain(Sigma, St. Luis, MO, USA)으로 염색한 다음, 현미경하에서 관찰하였다.
2)로 여과한 뒤, 감압농축하였다. 농축액에 absolute ethanol을 가하여 단계별로 75%, 85% 및 95% 에탄올 용액으로 만든 다음, 각각의 농도단계에서 4 ℃에서 12시간 침전시킨 후 상등액만을 수거하는 과정을 반복하였다. 그 후, 최종 상등액을 감압 농축하고 다시 동결건조하여 한국산 겨우살이 추출물(Korean mistletoe extract : KME) 10.
다시 FBS가 첨가된 배지를 이용하여 농도별 KME(0, 10, 200, 500 µg/ml)를 처리하였다.
다시 FBS가 첨가된 배지를 이용하여 농도별 KME(0, 10, 200, 500 µg/ml)를 처리하였다. 멸균피펫 팁을 사용하여 plate에 scratching을 가해 세포를 제거한 시점을 0시간으로 하고, 24시간 동안진행된 세포이주의 변화를 현미경(Nikon TMS-F; Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰한 후, 세포를 제거하였던 wound scratch 지역으로 이주되어온 세포 간의 간격을 측정해 이주율(%)로 환산하여 표기하였다.
1% naphthylethylene diamine in water and 1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid)과 혼합하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 반응 종료 후, ELISA reader를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 세포로부터 생성된 NO의 양은 sodium nitrate 표준액의 농도를 기준(standard curve)으로 하여 계산하였다.
실온에서 15분씩 4번 TBST로 membrane을 washing한후, 2차 항체(goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz)를 2%의 skim milk가 들어있는 TBST에 희석(1:2000)하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.실온에서 10분씩 3번 TBST로 washing한 후 ECL용액을 이용해 X-ray film에 감광시킨 후, 단백질의 발현 정도를 분석하였다.
합성된 cDNA는 primer[Table 1].와 함께 thermal cycle을 반복하여 증폭 반응을 유도하였으며, 생성물을 1% agarose gel 상에서 전기영동으로 분리한 다음, ethidium bromide 염색을 통해 발현된 밴드를 분석하였다.
반면, KME 처리군에서는 LPS로 유도된 iNOS의 발현 정도가 감소하였다. 이 결과로부터 KME가 PKC 경로를 통해 iNOS를 저해하는지를 확인하기 위하여, LPS로 C6 신경교종 세포를 자극한 다음, 단백질을 회수하여 발현분석을 하였다. 그 결과, LPS의 처리로 인해 PKC의 발현이 증가하였으나, KME 처리로 인해 PKC 발현이 저해됨을 확인할 수 있었다(Fig.
이 결과를 바탕으로 C6 신경교종 세포의 증식에대한 억제능과 암세포 이주에 대한 저해능을 관찰하고, 그 기전을 이해하기 위하여 NO 생성 억제효과와 iNOS 및 PKC 단백질 발현에 대한 효능을 분석하였다.
이전의 결과에서 LPS로 유도된 C6 신경교종 세포로부터 분비된 NO의 생성 증가는 KME 처리로 감소하였으며, 이는 PKC 활성저해를 통해 iNOS의 발현을 억제함에 기인함을 알 수 있었다. 이와 같은 작용 경로에 대한 보다 구체적인 검토를 위해 C6 신경교종 세포에 LPS를 처리한 다음, ERK, JNK 및 p38을 포함한 MAP kinase의 인산화(phosphorylation)에 미치는 KME의 영향을 관찰하였다. 그 결과, KME는 JNK와 p38 단백질 인산화에는 크게 영향을 미치지 않았으나, LPS의 처리로 인해 ERK의 인산화는 크게 증가시켰으며, KME는 이러한 발현 증가를 강하게 억제하였다(Fig.
즉, 96-well microtiter plate에 RAW 264.7 혹은 C6 glioma 세포를 0.5×105 cells/well이 되도록 분주하여 배양하고, 다양한 농도의 KME를 처리하였다.
하단 chamber에는 FBS와 농도별 KME(0, 10, 100, 200, 500 µg/ml)를 주입한 다음, 5% CO2, 37 ℃ incubator에서 3시간 동안 배양하여 세포의 이주를 유도하였다.

대상 데이터

Mouse leukaemic monocyte macrophage(RAW 264.7)및 흰쥐의 신경교종 세포주인 rat C6 glioma cell line은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받았다. RAW 264.
7)및 흰쥐의 신경교종 세포주인 rat C6 glioma cell line은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받았다. RAW 264.7 세포는 RPMI 1640 배지에, C6 glioma 세포는 DMEM 배지에 각각 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 5% CO₂, 37 ℃ 환경의 incubator에서 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
농축액에 absolute ethanol을 가하여 단계별로 75%, 85% 및 95% 에탄올 용액으로 만든 다음, 각각의 농도단계에서 4 ℃에서 12시간 침전시킨 후 상등액만을 수거하는 과정을 반복하였다. 그 후, 최종 상등액을 감압 농축하고 다시 동결건조하여 한국산 겨우살이 추출물(Korean mistletoe extract : KME) 10.92 g(회수율1.82%)을 회수하여 실험에 사용하였다.
coli)는 Sigma사(St Louis, MO, USA), TRI-reagent는 Molecular Research Center(Cincinnati, OH, USA), ImProm-II Reverse Transcription System은 Promega사(Madison, WI, USA)에서 구입하였다. 기타 시약과 항체들은 Bio-Rad Laboratories(Hercules, CA, USA), Invitrogen Life Technologies(Carldbad, CA, USA) 및 Santa Cruz(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
본 실험에 사용된 槲寄生(Korean mistletoe ; Viscum album L. var. coloratum Ohwi)은 강원도 양구 지방의 재래시장에서 참나무에 기생하는 겨우살이를 구입한 다음, 정선하여 사용하였다. 약재의 추출을 위하여 겨우살이 600 g에 2 L의 증류수를 가하여 3시간 동안 전탕하였다.
세포배양에 사용된 DMEM, RPMI 1640, fetal bovine serum(FBS) 및 penicillin-streptomycin은 모두 Gibco사(Carlsbad, California, USA), 세포생존율측정용 XTT(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carbo xanilide) assat kit은 WelGENE사(Seoul, Korea), LPS(lipopolysaccharide from E. coli)는 Sigma사(St Louis, MO, USA), TRI-reagent는 Molecular Research Center(Cincinnati, OH, USA), ImProm-II Reverse Transcription System은 Promega사(Madison, WI, USA)에서 구입하였다. 기타 시약과 항체들은 Bio-Rad Laboratories(Hercules, CA, USA), Invitrogen Life Technologies(Carldbad, CA, USA) 및 Santa Cruz(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

데이터처리

실험결과는 평균과 표준편차(mean±SD)로 표기하였으며, Student’s t-test 방법을 실시하여 분석하였고, p<0.05일 경우에 유의성을 인정하였다.

이론/모형

C6 신경교종 세포에 대한 농도별 KME의 세포독성을 검토하기 위하여 XTT assay로 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, KME를 처리하지 않은 대조군에서는 100.
C6 신경교종 세포의 이주에 대한 KME의 효능을 Boyden chamber assay로 평가하기 위하여 상하 2개로 구성된 48-well chemotaxis chamber(Neuro-Probe, Gaithersburg, Maryland, USA)를 사용하였다. 상하 각각의 chamber는 서로 1% gelatin을 도포한 8 µm pore 크기의 polycarbonate membrane을 사이에 두고 분리되는 구조이다.
KME가 iNOS, PKC, MAP kinase 단백질 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 western blotting을 수행하였다. C6 glioma 세포에 KME를 1시간 동안 전처리한 후 LPS를 처리하고, lysis buffer(PRO-PREP Protein Extraction Solution, iNtRON)를 첨가해 4 ℃, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상층액을 수거해 BCA assay로 단백질을 정량하였다.
본 실험에서 세포생존율을 측정하기 위해 XTT assay법을 사용하였다. 즉, 96-well microtiter plate에 RAW 264.

성능/효과

KME의 작용 경로를 구체적으로 검토하고자 C6 신경교종 세포에 LPS를 처리한 다음, ERK, JNK 및 p38을 포함한 MAP kinase의 인산화에 미치는 영향을 관찰한 결과, KME는 주로 LPS로 유도된 ERK의 인산화를 강하게 저해함을 알 수 있었다.
槲寄生 추출물은 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 iNOS의 과발현과 NO의 과다 생성을 억제함으로써 강한 항염증 효능을 나타내었다. 또한 혈청으로 유도된 C6 신경교종 세포의 증식과 암세포이주를 저해하였으며, LPS로 유도된 PKC 및 p-ERK 단백질 발현을 억제함으로써 iNOS의 과발현과 NO의 과다 생성을 억제하였다.
그 결과, KME는 10 µg/ml에서 500 µg/ml의 농도범위에서는 아무런 세포독성을 나타내지 않았으나, 1000 µg/ml 및 2000 µg/ml의고농도 처리군에서는 세포생존율이 각각 74.32±4.08% 및 45.13±2.44%로 현저하게 감소하였다(Fig. 1).
이와 같은 작용 경로에 대한 보다 구체적인 검토를 위해 C6 신경교종 세포에 LPS를 처리한 다음, ERK, JNK 및 p38을 포함한 MAP kinase의 인산화(phosphorylation)에 미치는 KME의 영향을 관찰하였다. 그 결과, KME는 JNK와 p38 단백질 인산화에는 크게 영향을 미치지 않았으나, LPS의 처리로 인해 ERK의 인산화는 크게 증가시켰으며, KME는 이러한 발현 증가를 강하게 억제하였다(Fig. 10).
그 결과, KME를 처리하지 않은 대조군에서는 100.0±3.14%의 세포생존율을 보였으나, KME를 50 µg/ml, 100 µg/ml, 150 µg/ml, 200 µg/ml, 250 µg/ml, 300 µg/ml, 350 µg/ml, 400 µg/ml, 450 µg/ml 및 500 µg/ml의 농도로 처리한 실험군에서는 각각 117.5±13.40%, 123.0±14.95%, 121.0±12.83%, 116.7±11.93%, 112.8±9.74%, 109.6±5.66%, 109.3±11.86%, 105.4±5.65%, 106.2±2.91% 및 98.79±4.14%의 세포생존율을 나타내었다.
그 결과, LPS의 자극에 의해 IL-1β, IL-6, COX-2 및 iNOS의 mRNA 발현이 증가되었으며, 이러한 발현증가는 KME(500 µg/ml)의 처리로 인해 감소되었다.
따라서 본 연구에서는 PKC 단백질 발현에 대한 KME의 영향을 검토함으로써 암세포 이주억제 기전을 보다 심도있게 규명하고자 하였다. 그 결과, LPS의 자극을받은 신경교종 세포에서 PKC 단백질 발현이 증가하였고, KME는 LPS로 유도된 PKC 단백질 발현을 억제하였다.
이 결과로부터 KME가 PKC 경로를 통해 iNOS를 저해하는지를 확인하기 위하여, LPS로 C6 신경교종 세포를 자극한 다음, 단백질을 회수하여 발현분석을 하였다. 그 결과, LPS의 처리로 인해 PKC의 발현이 증가하였으나, KME 처리로 인해 PKC 발현이 저해됨을 확인할 수 있었다(Fig. 9).
그 결과, 아무런 처리도 하지 않은 대조군(10.02±2.15 µＭ)에 비해 LPS 단독 처리군(21.39±4.16 µM)에서 NO의 생성이 현저하게 증가하였다.
그 결과, 아무런 처리도 하지 않은 대조군(3.81±0.72 µＭ)에 비해 LPS 단독 처리군(40.60±0.69 µＭ)에서는 NO의 생성이 현저하게 증가하였다.
8에서 KME는 LPS의 자극을 받은 C6 신경교종 세포로부터 생성된 NO를 현저하게 억제하였으므로, 이러한 결과가 iNOS의 발현을 저해함에 기인했을 것으로 판단되어 본 실험에서는 단백질수준에서 확인해 보았다. 그 결과, 아무런 처리도하지 않은 대조군에 비해 LPS 단독 처리군에서 iNOS의 발현이 강하게 증가하였다. 반면, KME 처리군에서는 LPS로 유도된 iNOS의 발현 정도가 감소하였다.
그 결과, 혈청 무첨가군에서는 세포생존율이 100.00±13.84%로 나타났으나, 혈청 단독 첨가군에서는 167.90±9.80%로 현저하게 증가하였다.
그 결과, 혈청만을 처리한 실험군에서는 24시간 후에 세포의 이주가 현저하게 증가(100±4.88%)하였으나, KME를 200 µg/ml (76.60±3.20%) 및 500 µg/ml(62.77±3.69%)의 농도로 처리한 실험군에서는 혈청으로 유도된 C6 신경교종 세포의 이주가 현저하게 억제되었다(Fig. 6B).
XTT assay의 결과를 바탕으로 KME의 암세포이주 저해능을 평가하기 위하여 scratch-wound assay와 Boyden chamber assay를 통해 검토하였다. 그결과, 혈청 첨가로 인해 신경교종 세포의 이주가 현저하게 증가하였고, KME는 혈청으로 유도된 세포 이주를 강하게 억제하였다. 따라서 다른 장기로의 전이는 거의 일어나지 않으면서, 주변 뇌조직으로의 이주와 침윤, 그리고 신속한 성장이 문제시되는 신경교종의 특징^1-5상, 본 약물이 암세포의 이주를 저해함으로써 종양의 악성 진행 과정을 차단할수 있음을 시사하였다.
2). 따라서 KME는 LPS의 자극을 받은 Raw 264.7 세포로부터 분비되는 NO를 효과적으로 저해함을 알 수 있었다.
따라서 KME는 RAW 264.7 세포에서 IL-1β, IL-6 및 COX-2와 같은 염증매개물질의 발현 저해를 통해 항염증 효능을 나타내며, 특히 iNOS의 발현을 강하게 억제함으로써 LPS의 자극에 의한 NO의 생성을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다(Fig. 3).
따라서 KME를 500 µg/ml 이하로 처리할 경우 C6 신경교종 세포에 대해 직접적으로 세포사멸을 유도하지 않음을 알 수 있었다.
11 µＭ)의 농도로 처리한 실험군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 NO 생성량이 유의성 있게 감소하였다. 따라서 LPS의 자극을 받은 C6 신경교종 세포는 NO를 과다 생성하였으며, KME 처리는 LPS로 유도된 NO 과다 생성을 억제함을 알 수 있었다(Fig. 8).
또한 혈청으로 유도된 C6 신경교종 세포의 증식과 암세포이주를 저해하였으며, LPS로 유도된 PKC 및 p-ERK 단백질 발현을 억제함으로써 iNOS의 과발현과 NO의 과다 생성을 억제하였다. 따라서 槲寄生은 신경교종 세포에 대하여 직접적인 세포사멸을 유도하기 보다는 주위 정상조직으로의 암세포이주를 저해함으로써 신경교종의 악성 진행을 방지할 수 있을 것으로 판단된다.
그결과, 혈청 첨가로 인해 신경교종 세포의 이주가 현저하게 증가하였고, KME는 혈청으로 유도된 세포 이주를 강하게 억제하였다. 따라서 다른 장기로의 전이는 거의 일어나지 않으면서, 주변 뇌조직으로의 이주와 침윤, 그리고 신속한 성장이 문제시되는 신경교종의 특징^1-5상, 본 약물이 암세포의 이주를 저해함으로써 종양의 악성 진행 과정을 차단할수 있음을 시사하였다.
본 연구 결과, LPS의 자극을 받은 신경교종 세포에서 iNOS의 발현과 NO의 생성이 크게 증가하였으며, KME는 LPS로 유도된 iNOS단백질 발현 및 NO 생성을 현저하게 억제하였다. 따라서 다양한 종류의 암세포, 특히 뇌종양에서 iNOS가 높게 발현된다는 점을 감안할 때, KME는 iNOS의 과발현을 억제함으로써 NO 과다 생성을 차단해 뇌종양 세포가 주변 정상 조직으로 이주되는 과정를 억제하고, 이로 인해 결국 뇌종양의 악성 진행을 방지할 수 있을 것으로 판단된다.
7 세포에서 LPS로 유도된 NO 생성 및 iNOS 발현을 억제함으로써 강한 항염증 효능을 나타내었으며, C6 신경교종 세포에서는 혈청으로 유도된 암세포이주를 현저하게 저해하였다. 또한 KME는 C6 신경교종 세포에서도 염증매개물질인 NO 생성 및 iNOS 발현을 저해하였으며, 이는 PKC와 p-ERK의 염증성 신호전달경로의 발현증가를 저해함에 기인한 작용임을 확인할 수 있었다. 따라서 KME는 신경교종 세포에 대하여 직접적인 세포사멸을 유도하기 보다는, 신경교종의 특징인 인근 주위 조직으로의 이주 과정을 차단할 가능성이 높으며, 향후 암환자의 생존율과 삶의 질 향상에 기여할 새로운 암치료제로서의 개발 가능성이 시사되었다.
7 세포에서 LPS로 유도된 iNOS의 과발현과 NO의 과다 생성을 억제함으로써 강한 항염증 효능을 나타내었다. 또한 혈청으로 유도된 C6 신경교종 세포의 증식과 암세포이주를 저해하였으며, LPS로 유도된 PKC 및 p-ERK 단백질 발현을 억제함으로써 iNOS의 과발현과 NO의 과다 생성을 억제하였다. 따라서 槲寄生은 신경교종 세포에 대하여 직접적인 세포사멸을 유도하기 보다는 주위 정상조직으로의 암세포이주를 저해함으로써 신경교종의 악성 진행을 방지할 수 있을 것으로 판단된다.
먼저 C6 신경교종 세포 증식에 대한 혈청과 KME의 영향을 XTT assay로 측정한 결과, 혈청 무첨가군에 비해 혈청 첨가군에서 세포의 증식이 현저하게 증가하였으나, KME의 처리로 인해 현저한 감소를 나타내었다. 이 결과에서 고농도의 KME(4000 μg/ml)를 처리하더라도 세포 생존율이 100%에 근접하여 본 약물이 세포독성 보다는 암세포 증식억제 효능에 대한 가능성을 확인할 수 있었다.
먼저 RAW 264.7 세포를 이용해 항염증 효능을 확인한 바, KME는 LPS의 자극에 의한 IL-1β, IL-6 및 COX-2와 같은 염증매개물질의 mRNA 발현을 저해하였으며, 특히 iNOS의 발현을 현저하게 억제함으로써 LPS의 자극에 의한 NO의 생성을 효과적으로 감소시켜 본 약물이 우수한 항염증 효능을 지녔음을 알 수 있었다.
과다 발현된 iNOS와 이로 인해 과다 생성된 NO는 발암, 세포이주 및 침윤을 야기하고^14-16, 정상세포의 변형과 신생혈관 형성을 통해 뇌종양, 유방암및 폐암 등의 악성 진행에 관여하며, 특히 뇌종양에서 iNOS의 높은 발현이 관찰되어지는 것으로 알려져 있다^21,48. 본 연구 결과, LPS의 자극을 받은 신경교종 세포에서 iNOS의 발현과 NO의 생성이 크게 증가하였으며, KME는 LPS로 유도된 iNOS단백질 발현 및 NO 생성을 현저하게 억제하였다. 따라서 다양한 종류의 암세포, 특히 뇌종양에서 iNOS가 높게 발현된다는 점을 감안할 때, KME는 iNOS의 과발현을 억제함으로써 NO 과다 생성을 차단해 뇌종양 세포가 주변 정상 조직으로 이주되는 과정를 억제하고, 이로 인해 결국 뇌종양의 악성 진행을 방지할 수 있을 것으로 판단된다.
이 결과에서 KME는 LPS의 자극에 의한 NO 생성을 농도의존적으로 감소시켰으며, 특히 세포독성을 나타내지 않는 500 µg/ml의 농도로 처리한 실험군에서는 거의 정상군과 유사한 수준을 나타내었다(Fig. 2).
이 결과에서 고농도의 KME(4000 μg/ml)를 처리하더라도 세포 생존율이 100%에 근접하여 본 약물이 세포독성 보다는 암세포 증식억제 효능에 대한 가능성을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 종합하면 KME는 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO 생성 및 iNOS 발현을 억제함으로써 강한 항염증 효능을 나타내었으며, C6 신경교종 세포에서는 혈청으로 유도된 암세포이주를 현저하게 저해하였다. 또한 KME는 C6 신경교종 세포에서도 염증매개물질인 NO 생성 및 iNOS 발현을 저해하였으며, 이는 PKC와 p-ERK의 염증성 신호전달경로의 발현증가를 저해함에 기인한 작용임을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 통해 C6 신경교종 세포에서 LPS로 유도된 iNOS 발현을 KME가 저해한 것은 PKC와 p-ERK를 통한 염증성 신호전달경로를 억제하기 때문임을 확인할 수 있었다.
이상의 결과에서 KME를 50 µg/ml에서 500 µg/ml의 농도범위로 처리한 실험군 모두에서 정상군과 유사한 수준의 세포생존율을 보여 유의할 만한 세포독성을 관찰할 수 없었다(Fig. 4).
국내에서도 한국산 겨우살이에 대한 관심이 높아지면서 본 약물의 약리적활성 규명에 관한 연구가 활발히 이루어져 항산화 효과³⁸, DNA 손상방어³⁹, 항돌연변이⁴⁰, 면역증강⁴¹,신경세포보호⁴², 혈압강하 및 혈청지질 개선효능⁴³등이 규명되었다. 특히 항종양 작용과 관련해서는 한국산 겨우살이로부터 분리 정제된 렉틴의 항암활성에 대한 실험적 연구를 통해 암세포 증식억제⁴⁴, 종양전이 억제⁴⁵, 암세포 사멸유도⁴⁶ 및 신생혈관 억제 활성⁴⁷ 등이 규명되었으며, 실험적 동물 종양모델에서는 간암³⁰, 피부암³⁴ 및 폐암³⁵등에 유효하다는 보고를 접할 수 있었다. 또한 한국산 겨우살이를 원료로 약침제제가 개발될 경우 유럽산 겨우살이 제제에 비해 우수하고도 경제적인 암치료제로 활용될 가능성을 제시한 연구보고²⁹와, 한방에서의 간암 세포주에 대한 항암효과³¹, 세포분열과 관련유전자 발현³² 및 신생혈관인자 발현에 미치는 영향³³등에 대한 실험보고는 확인할 수 있었으나, 뇌종양세포에 대해 이주저해 활성을 통한 암의 진행 악화 방지를 목적으로 접근한 실험적 연구는이루어진 바 없다.
그 결과, LPS의 자극에 의해 IL-1β, IL-6, COX-2 및 iNOS의 mRNA 발현이 증가되었으며, 이러한 발현증가는 KME(500 µg/ml)의 처리로 인해 감소되었다. 특히, KME는 LPS로 유도된 iNOS의 mRNA 발현을 거의 정상군 수준으로 회복시킴을 알 수 있었다. 따라서 KME는 RAW 264.
특히, KME를1000 µg/ml 및 4000 µg/ml의 농도로 처리한 실험군에서 혈청 단독 첨가군에 비해 유의성 있는 세포증식 억제효과를 나타내었다(Fig. 5).

후속연구

또한 KME는 C6 신경교종 세포에서도 염증매개물질인 NO 생성 및 iNOS 발현을 저해하였으며, 이는 PKC와 p-ERK의 염증성 신호전달경로의 발현증가를 저해함에 기인한 작용임을 확인할 수 있었다. 따라서 KME는 신경교종 세포에 대하여 직접적인 세포사멸을 유도하기 보다는, 신경교종의 특징인 인근 주위 조직으로의 이주 과정을 차단할 가능성이 높으며, 향후 암환자의 생존율과 삶의 질 향상에 기여할 새로운 암치료제로서의 개발 가능성이 시사되었다.
특히 혈청으로 유도된 C6 신경교종 세포의 이주는 PKC 단백질이 매개하는 signaling pathway를 통해 일어나며²⁰, C6 신경교종 세포를 lipopolysaccharide(LPS)로 자극할 경우 NO 생성과 iNOS의 발현이 증가하는데, 이 또한 PKC의 활성 증가에 의한 것으로 보고되었다^21-23. 따라서 신경교종 세포에서 PKC 단백질 발현을 효과적으로 저해할 수 있는 약물은 iNOS의 과발현 및 NO의 과다 생성을 억제함으로써 암세포의 이주와 침윤을 차단해 결국 종양의 진행과 악화를 방지할 수 있으며, 이는 신경교종 질환의 치료에 대한 새로운 접근 방법이 될 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Protein kinase C란 무엇인가?	Protein kinase C(PKC)는 세포의 이동, 성장,분화, 증식 등의 기능을 매개함으로써 종양 형성을 촉진하며, 암세포의 이주에 관여하는 결정적 인자로 알려져 있다17-19. 특히 혈청으로 유도된 C6 신경교종 세포의 이주는 PKC 단백질이 매개하는 signaling pathway를 통해 일어나며20, C6 신경교종 세포를lipopolysaccharide(LPS)로 자극할 경우 NO 생성과 iNOS의 발현이 증가하는데, 이 또한 PKC의 활성 증가에 의한 것으로 보고되었다21-23.
	신경교종의 특징은 무엇인가?	신경교종(glioma)은 여타 악성 종양과 달리 다른 장기로의 전이(metastasis)는 거의 일어나지 않으면서 정상조직으로의 이주(migration)와 침윤(invasion), 신속한 성장(growth)이 특징적이며, 수술, 방사선 및 화학요법에 대해 내성을 가져 재발률이 높고, 아직까지 뚜렷한 치료법이 없는 실정이다1-5. 또한 악성 신경교종 세포는 고형암(solid tumor)과는 달리 이동과 분산을 잘 일으키므로, 세포사멸 자극(apoptotic stimulation)을 유도하는 기존의 암치료법에 대해 저항성을 나타내는 특징이 있다6,7.
	槲寄生의 특성은 무엇인가?	coloratum Ohwi)은 겨우살이과(Loranthaceae)에 속한 常綠寄生小灌木인 겨우살이의 帶葉莖枝이다24. 性味는 平苦하고, 肝ㆍ腎經으로 歸經하며, 祛風濕, 補肝腎, 强筋骨 등의 효능으로 風濕痺痛, 腰膝痠痛 등을 다스리고, 폐암, 방광암 등의 癰腫 치료에도 사용되고 있다25-28. 이러한 한국산 겨우살이와 관련해 암치료제로서의 임상의학적 중요성과 적용에 관한 문헌적보고29와 간암30-33, 피부암34, 폐암35 등에 대한 실험보고는 접할 수 있었으나, 뇌종양 세포의 이주와 관련한 실험연구는 접할 수 없는 실정이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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