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문제 정의
- Zachariads는 시료에 따라 추출효율이 달라질 수 있음을 시사 하였는데27 따라서 각 시료에 따라 최적의 추출방법과 조건을 찾아내어 적용하는 것이 필요할 것으로 판단된다. 시료에서의 셀레늄 화학종을 정량적으로 추출하기 위하여 마이크로파를 이용한 추출법과 여러 효소들을 사용한 추출법들을 비교하고 각 시료에 따른 최적의 추출조건들을 조사하고자 하였다.
- 이 연구에서는 HPLC-ICP-MS를 이용하여 우리가 자주 접하는 농수산물 식품 중의 셀레늄 화학종을 분리분석 하였다. ORC의 충돌기체로 수소를 사용하여 분광학적 방해를 제거하였다.
제안 방법
- 다양한 ion-pairing reagent를 사용하여 여러 식품과 효모 등의 셀레늄 화학종의 분리와 검출에 대한 연구가 성공적으로 수행되고 보고되고 있다.23-26 본 연구에서는 식품중의 셀레늄 화학종들을 정확하게 정성 및 정량분석을 하기 위하여 먼저 셀레늄 화학종들의 분리에 적합한 HPLC 컬럼과 분리 조건을 찾았다. 또한 HPLC와 ICP-MS사이의 최적의 연결조건을 구하였다.
- 이 연구에서는 HPLC-ICP-MS를 이용하여 우리가 자주 접하는 농수산물 식품 중의 셀레늄 화학종을 분리분석 하였다. ORC의 충돌기체로 수소를 사용하여 분광학적 방해를 제거하였다. 효과적인 셀레늄 화학종의 분리를 위해 역상 이온쌍 크로마토그래피법과 양이온교환 크로마토그래피를 비교한 결과, 전자가 더 우수함을 보여주었고 최적의 조건으로 표준시료 Se(IV), Se(VI), SeCys, SeMet, Se-M-C를 분리하였다.
- 시료중의 여러 셀레늄 화학종을 온전히 추출하기 위하여 마이크로파를 이용하거나 protease I + trypsin, protease XIV의 효소를 이용하여 비교하였다. 각 방법은 시료 중의 다른 셀레늄 화학종을 추출할 수 있었으며 각 시료마다 가장 효율적인 추출 방법을 찾아 적용하였다.
- 그런데 효소를 이용한 추출을 하게 되면 효소 자체도 단백질이므로 바탕신호를 나타낼 수 있다. 따라서 시료를 제외하고 추출에 사용된 효소인 protease I, trypsin, protease XIV를 포함한 blank를 분석하였다. 바탕 신호는 비교적 작은 편이었고, protease XIV가 두 개의 피크(Fig.
- 23-26 본 연구에서는 식품중의 셀레늄 화학종들을 정확하게 정성 및 정량분석을 하기 위하여 먼저 셀레늄 화학종들의 분리에 적합한 HPLC 컬럼과 분리 조건을 찾았다. 또한 HPLC와 ICP-MS사이의 최적의 연결조건을 구하였다.
- 컬럼과의 결과를 비교하였다. 먼저 양이온 컬럼인 Hamilton PRP X-200을 사용하여 표준물을 분리하였다. 실험의 조건은 다음의 Table 3에 요약하여 나타내었다.
- 비록 아르곤 화학종들에 의한 분광간섭이 심하지만 최근의 충돌셀 기법의 발전으로 동중간섭(isobaric interference)은 거의 제거되고 있다. 본 연구에서도 팔중극자 충돌셀(ORC:Octopole reaction cell) ICP-MS를 이용하여 셀레늄 분석에 유리한 충돌기체와 흐름조건들을 선택하고 분광학적 방해를 제거하였다.11
- 선행 연구에서는 이온교환컬럼을 사용하여 성공적으로 분리한 경우가 있었으므로 본 연구에서도 이온 교환컬럼을 사용하고 C8 컬럼과의 결과를 비교하였다. 먼저 양이온 컬럼인 Hamilton PRP X-200을 사용하여 표준물을 분리하였다.
- 셀레늄 화학종의 분석을 위한 ICP-MS는 7500CE(Agilent Tech., CA, USA)을 사용하였고, HPLC pump는 Model 626 dual pump(Alltech Inc., IL, USA)을 사용하였으며 컬럼은 SymmetryshieldTM(Waters, MA, USA) RP8(3.5 µm, 4.6 × 150 mm) 및 이온교환 컬럼인 PRP X-200(Hamilton company, NJ, USA)을 사용하였다.
- 효과적인 셀레늄 화학종의 분리를 위해 역상 이온쌍 크로마토그래피법과 양이온교환 크로마토그래피를 비교한 결과, 전자가 더 우수함을 보여주었고 최적의 조건으로 표준시료 Se(IV), Se(VI), SeCys, SeMet, Se-M-C를 분리하였다. 시료중의 여러 셀레늄 화학종을 온전히 추출하기 위하여 마이크로파를 이용하거나 protease I + trypsin, protease XIV의 효소를 이용하여 비교하였다. 각 방법은 시료 중의 다른 셀레늄 화학종을 추출할 수 있었으며 각 시료마다 가장 효율적인 추출 방법을 찾아 적용하였다.
대상 데이터
- 셀레늄 화학종 표준용액은 Sigma-Aldrich (MO, USA)의 sodium selenite(SeIV), sodium selenate(SeVI), seleno-DL-methionine(SeMet), seleno-L-cystine(SeCys), Se-(methyl)selenocystein hydrochloride(Se-M-C)을 초순수에 묽혀 20 µg g−1 용액을 제조하여 사용하였고, 효소 분해에는 Sigma Aldrich사의 protease type I(from bovine pancreas) 및 protease type XIV(from Streptomyces griseus)를 사용하였다. Methanol은 99.8%의 HPLC급 시약(JT Baker, NJ, USA)으로 사용하였고 이온쌍 시약으로는 nonafluorovaleric acid(TCI, Tokyo, Japan) 0.05%를 이동상에 혼합하고 질산으로 pH를 2.5로 맞추어서 사용하였다. 국내산 마늘, 돼지고기, 고등어, 참치시료는 시장에서 구입하여 동결 건조하고 분말화시켜 사용하였다.
- 5로 맞추어서 사용하였다. 국내산 마늘, 돼지고기, 고등어, 참치시료는 시장에서 구입하여 동결 건조하고 분말화시켜 사용하였다. 현재의 연구에서는 주로 시료의 살부분만을 사용하였고 내장 부위별과 지역별 등의 자세한 구분은 하지 않았다.
- 셀레늄 화학종 표준용액은 Sigma-Aldrich (MO, USA)의 sodium selenite(SeIV), sodium selenate(SeVI), seleno-DL-methionine(SeMet), seleno-L-cystine(SeCys), Se-(methyl)selenocystein hydrochloride(Se-M-C)을 초순수에 묽혀 20 µg g−1 용액을 제조하여 사용하였고, 효소 분해에는 Sigma Aldrich사의 protease type I(from bovine pancreas) 및 protease type XIV(from Streptomyces griseus)를 사용하였다.
- 시약 제조나 용기의 세척에 사용된 물은 Millipore direct-Q System에서 얻은 18.2 MΩ cm−1 이상의 초순수 물을 사용하였다.
- 음식시료는 식물성 시료인 마늘과 동물성시료인 돼지고기, 그리고 어류인 고등어와 참치를 대표적으로 선택하였다. 시료의 분석에 앞서 시료 중의 셀레늄 화학종을 추출하기 위하여 마이크로파를 이용한 추출과 여러 효소들을 이용한 추출을 조사였는데 이 것은 시료에 따라 셀레늄화학종의 추출은 달라질 수 있기 때문이다.
성능/효과
- 마늘 시료에서는 마이크로파를 이용한 추출과 protease I 또는 protease XIV를 이용한 추출에서 모두 SeCys이 분리되었고, protease I + trypsin을 이용한 경우에는 무기 Se 종만이 분리되었다. Protease I을 이용하였을 때 가장 다양한 종을 추출할 수 있었고, protease I + trypsin을 사용하였을 때는 오히려 유기 Se 종의 추출이 저해되는 것으로 나타났다. 대표적으로 Protease I 일 때의 결과만을 Fig.
- 실험의 조건은 다음의 Table 3에 요약하여 나타내었다. 결과를 Fig. 3에 보여준 것처럼 무기 셀레늄 Se(IV)와 Se(VI)는 분리가 잘되는 것을 알 수 있지만 유기셀레늄 화학종들은 일부 분리가 되지 않음을 알 수 있었다. 또한 역상 이온쌍 크로마토그래피와 비교해 볼 때에 전반적으로 분석시간이 더 길고 덜 효율적임을 알 수 있었다.
- 돼지고기 시료에서는 마이크로파를 이용한 추출과 protease I을 이용한 추출에서 무기 셀레늄만이 검출되었으나 protease I + trypsin을 이용한 추출에서는 무기 Se 종과 SeCys, SeMet가 모두 추출되었고, protease XIV를 이용한 추출에서는 무기 Se 종과 SeCys가 검출되었다. 즉, protease XIV를 이용하였을 때에도 모든 화학종을 추출하지 못하였다.
- 3에 보여준 것처럼 무기 셀레늄 Se(IV)와 Se(VI)는 분리가 잘되는 것을 알 수 있지만 유기셀레늄 화학종들은 일부 분리가 되지 않음을 알 수 있었다. 또한 역상 이온쌍 크로마토그래피와 비교해 볼 때에 전반적으로 분석시간이 더 길고 덜 효율적임을 알 수 있었다.
- 전체적으로 볼 때에 효소추출법이 마이크로파추출법보다 더 효율적으로 셀레늄 화학종들을 추출하는 것으로 판단된다. 모든 시료에는 공통적으로 무기 셀레늄이 들어있으며 유기셀레늄의 경우에는 마늘 시료에 약간의 SeCys만 포함되어 있었고, 동물시료인 돼지고기 및 어류인 고등어에는 SeCys 외에 SeMet가 포함되어 있었다. 또한 각 시료에는 그밖에 알려지지 않은 몇 가지의 셀레늄 화학종이 분리되었지만 확인할 수 없었다.
- 따라서 시료를 제외하고 추출에 사용된 효소인 protease I, trypsin, protease XIV를 포함한 blank를 분석하였다. 바탕 신호는 비교적 작은 편이었고, protease XIV가 두 개의 피크(Fig. 6)를 보여주었고 나머지 효소들은 150초 부근에서 한 개만의 피크를 나타내었는데 시료에 대하여 직접적인 간섭을 보여주지는 않았으므로 용이하게 사용할 수 있었다.
- 일부 확인되지 않는 피크들이 검출되고 있으나 유기셀레늄과 무기셀레늄화학종은 분리가 잘 일어나고 있는 반면에 유기화학종들의 분리능이 부족한 것으로 판단되었다.
- 셀레늄 화학종과 각 농도를 측정하여 Table 4에 정리하였다. 전체적으로 볼 때에 효소추출법이 마이크로파추출법보다 더 효율적으로 셀레늄 화학종들을 추출하는 것으로 판단된다. 모든 시료에는 공통적으로 무기 셀레늄이 들어있으며 유기셀레늄의 경우에는 마늘 시료에 약간의 SeCys만 포함되어 있었고, 동물시료인 돼지고기 및 어류인 고등어에는 SeCys 외에 SeMet가 포함되어 있었다.
- 셀레늄 화학종 표준시료인 Se(IV), Se(VI), SeCys, SeMet, SeM-C의 5가지를 분리하였는데 분리를 위한 최적조건을 Table 2에 실었다. 최적의 조건에서 C8 컬럼을 사용한 역상 이온쌍 크로마토그래피의 결과를 보면 Fig. 2에서 나타난바와 같이 Se(IV), Se(VI), SeCys, Se-M-C, SeMet의 순서로 5개의 셀레늄 표준물들이 모두 잘 분리되었다.
- ORC의 충돌기체로 수소를 사용하여 분광학적 방해를 제거하였다. 효과적인 셀레늄 화학종의 분리를 위해 역상 이온쌍 크로마토그래피법과 양이온교환 크로마토그래피를 비교한 결과, 전자가 더 우수함을 보여주었고 최적의 조건으로 표준시료 Se(IV), Se(VI), SeCys, SeMet, Se-M-C를 분리하였다. 시료중의 여러 셀레늄 화학종을 온전히 추출하기 위하여 마이크로파를 이용하거나 protease I + trypsin, protease XIV의 효소를 이용하여 비교하였다.
후속연구
- 더 정확한 정량분석을 위하여 동위원소희석법을 적용하는 것이 필요하며 시료의 선택에서도 해산물인 생선 및 갑각류에 국한하여 좀 더 세분화시킨 연구조사가 필요할 것으로 생각된다. 셀레늄은 생체 내 또는 식품 내에서 다양한 형태의 유기화합물로 존재하고 있으며 그 화학종에 따라 활성도와 독성이 매우 다르게 나타나므로 셀레늄의 총량만으로는 생물체에 미치는 독성을 정확히 평가하기가 어렵다.
- 셀레늄은 생체 내 또는 식품 내에서 다양한 형태의 유기화합물로 존재하고 있으며 그 화학종에 따라 활성도와 독성이 매우 다르게 나타나므로 셀레늄의 총량만으로는 생물체에 미치는 독성을 정확히 평가하기가 어렵다. 따라서 이러한 화학종 연구는 매우 의미가 있으며 식품 의약계에서는 셀레늄의 화학종별 통제를 위해 각 셀레늄 화학종의 함량을 정확히 정량하는 이러한 연구가 더욱 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- 셀레늄은 여러 산화상태와 다양한 유, 무기 화학종으로 존재하며 또한 셀레늄은 그 종에 따라 활성도와 독성이 매우 다르게 나타나므로 반드시 각 셀레늄 화학종별로 모니터링이 이루어져야 할 것이다. 따라서 여러 식품이나 의약품 중에 포함된 다양한 셀레늄의 화학종들은 무엇이며 각 화학종에 따른 농도가 어느 정도인지 정확히 분석할 필요가 있다.
- 시료에 따라 추출효율이 달라질 수 있으므로 각 시료에 따른 효율적 추출을 연구하여야 한다. 식물성이거나 생선류일 때에는 마이크로파 추출법이 비교적 간단하므로 사용이 편리하다.
- 4)와 다른 결과를 보여주는데 이는 대부분 크로마토그래피의 차이로 기인한다고 생각된다. 육류시료의 경우에 지방을 제거하면 좀 더 효율적인 셀렌 단백질의 추출이 이루어질 수 있을 것으로 생각되나 대부분의 선행연구들은 특이한 경우를 제외하고는 지방을 제거하지 않았으므로 본 연구에서는 사용하지 않았다.
- SeMet는 무작위로 만들어 지므로 모든 시료에 나타나야 하는 것으로 기대되었으나 참치의 경우에는 거의 나타나지 않았다. 이것은 부위별로 다른 것인지 또는 시료개체에 따라 다른 것인지 좀 더 심화된 연구가 필요한 것으로 생각된다. 마늘의 경우에는 단백질이 많지 않기 때문에 유전자 적으로 만들어지는 SeCys 외의 무작위로 생기는 SeMet가 검출되지 않는것으로 생각된다.
- 식물성이거나 생선류일 때에는 마이크로파 추출법이 비교적 간단하므로 사용이 편리하다. 하지만 추출되는 양은 달라질 수 있으므로 표준물을 잘 선택하여야 정확한 정량분석이 가능할 것으로 기대된다. 육류는 마이크로파 추출법만으로는 부족한 것으로 보이며 반드시 trypsin 효소를 사용하여 잘 분해시켜 셀레늄화학종들을 추출하여야 할 것으로 생각된다.
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