국내 콩에서 발생하는 세균병해인 불마름병, 들불병, 세균점무늬병, 세균갈색점무늬병의 다중 진단을 위한 PCR 방법을 요약하면 다음과 같다. 1. 콩에 발생하는 각각의 세균들은 서로 다른 박테리오신(bacteriocin) 이나 파이토톡신(phytotoxin)을 생산하는데 이와 관련한 유전자를 목적으로 하여 진단프라이머를 설계하였다. 2. 불마름병은 glycinecin A, 들불병은 tabtoxin, 세균점무늬병은 coronatine과 세균갈색점무늬병은 syringopeptin을 목적유전자로 하여 다중 진단프라이머 조합을 설계하였다. 3. 1차 선발로 각각의 균주에 대한 단일 진단 프라이머를 선발하였으며, 여기선 선발된 21개의 프라이머들을 조합하여 4종 다중진단프라이머 선발을 위한 2차 선발에 이용하였다. 최종적으로 280 bp의 불마름병, 355 bp의 세균갈색점무늬병, 563 bp의 들불병과 815 bp의 세균점무늬병으로 구성된 다중진단 프라이머 조합이 개발되었다. 4. 선발된 4종 다중 진단 프라이머 조합의 경우 다른 세균들과의 비특이적 반응이 있는지 확인하기 위한 3차 선발을 거쳐 그 특이성을 검증하였다.
국내 콩에서 발생하는 세균병해인 불마름병, 들불병, 세균점무늬병, 세균갈색점무늬병의 다중 진단을 위한 PCR 방법을 요약하면 다음과 같다. 1. 콩에 발생하는 각각의 세균들은 서로 다른 박테리오신(bacteriocin) 이나 파이토톡신(phytotoxin)을 생산하는데 이와 관련한 유전자를 목적으로 하여 진단프라이머를 설계하였다. 2. 불마름병은 glycinecin A, 들불병은 tabtoxin, 세균점무늬병은 coronatine과 세균갈색점무늬병은 syringopeptin을 목적유전자로 하여 다중 진단프라이머 조합을 설계하였다. 3. 1차 선발로 각각의 균주에 대한 단일 진단 프라이머를 선발하였으며, 여기선 선발된 21개의 프라이머들을 조합하여 4종 다중진단프라이머 선발을 위한 2차 선발에 이용하였다. 최종적으로 280 bp의 불마름병, 355 bp의 세균갈색점무늬병, 563 bp의 들불병과 815 bp의 세균점무늬병으로 구성된 다중진단 프라이머 조합이 개발되었다. 4. 선발된 4종 다중 진단 프라이머 조합의 경우 다른 세균들과의 비특이적 반응이 있는지 확인하기 위한 3차 선발을 거쳐 그 특이성을 검증하였다.
Bacterial diseases in soybean are bacterial pustule by Xanthomonas axonopodis pv. glycines, wildfire by Pseudomonas syringae pv. tabaci, bacterial blight by Pseudomonas savastanoi pv. glycines and bacterial brown spot by Pseudomonas syringae pv. syringae in Korea. It is difficult to identify each di...
Bacterial diseases in soybean are bacterial pustule by Xanthomonas axonopodis pv. glycines, wildfire by Pseudomonas syringae pv. tabaci, bacterial blight by Pseudomonas savastanoi pv. glycines and bacterial brown spot by Pseudomonas syringae pv. syringae in Korea. It is difficult to identify each disease by early symptoms in fields, because the initial symptoms of these diseases are very similar to each other. In this study, we developed multiplex PCR detection method for rapid and accurate diagnosis of bacterial diseases. The glycinecin A of X. axonopodis pv. glycines, the tabtoxin of P. syringae pv. tabaci, the coronatine of P. savastanoi pv. glycines and the syringopeptin of P. syringae pv. syringae have been reported previously. These bacteriocin or phytotoxin producing genes were targeted to design the specific diagnostic primers. The primer pairs for diagnosis of each bacterial diseases were selected without nonspecific reactions. The studies on simultaneous diagnosis method were also conducted with primarily selected 21 primers. As a result, we selected PCR primer sets for multiplex PCR. Sizes of the amplified PCR products using the multiplex PCR primer set consist of 280, 355, 563 and 815 bp, respectively. This multiplex PCR method provides a efficient, sensitive and rapid tool for the diagnosis of the bacterial diseases in soybean.
Bacterial diseases in soybean are bacterial pustule by Xanthomonas axonopodis pv. glycines, wildfire by Pseudomonas syringae pv. tabaci, bacterial blight by Pseudomonas savastanoi pv. glycines and bacterial brown spot by Pseudomonas syringae pv. syringae in Korea. It is difficult to identify each disease by early symptoms in fields, because the initial symptoms of these diseases are very similar to each other. In this study, we developed multiplex PCR detection method for rapid and accurate diagnosis of bacterial diseases. The glycinecin A of X. axonopodis pv. glycines, the tabtoxin of P. syringae pv. tabaci, the coronatine of P. savastanoi pv. glycines and the syringopeptin of P. syringae pv. syringae have been reported previously. These bacteriocin or phytotoxin producing genes were targeted to design the specific diagnostic primers. The primer pairs for diagnosis of each bacterial diseases were selected without nonspecific reactions. The studies on simultaneous diagnosis method were also conducted with primarily selected 21 primers. As a result, we selected PCR primer sets for multiplex PCR. Sizes of the amplified PCR products using the multiplex PCR primer set consist of 280, 355, 563 and 815 bp, respectively. This multiplex PCR method provides a efficient, sensitive and rapid tool for the diagnosis of the bacterial diseases in soybean.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 콩에 발생하는 세균병의 특이 독소 유전자를 진단대상으로 하는 각각의 특이 진단 프라이머를 선발한 후에 이들을 이용하여 4종을 동시에 검출할 수 있는 다중진단법을 개발하고자 하였다.
콩에 발생하는 불마름병균, 들불병균, 세균점무늬병균과 세균갈색점무늬병균의 4종을 동시에 진단할 수 있는 다중진단 프라이머 조합을 개발하기 위하여 1차적으로 각각의 병원세균에만 특이적으로 반응하는 프라이머들을 선발하였다(Table 2). 선발된 프라이머들을 이용하여 15가지의 다중진단 프라이머 종류로 조합(Table 3)하여 4종의 병원세균에 대한 특이성을 검정하였다.
제안 방법
1. 콩에 발생하는 각각의 세균들은 서로 다른 박테리오신(bacteriocin) 이나 파이토톡신(phytotoxin)을 생산하는데 이와 관련한 유전자를 목적으로 하여 진단프라이머를 설계하였다.
11번 조합의 프라이머는 280 bp의 불마름병(glycinecin A), 355 bp의 세균갈색점무늬병(syringopeptin), 563 bp의 들불병(tabtoxin), 815 bp의 세균점무늬병(coronatine)으로 구성되어 있다. 11번 조합의 정확한 다중검정이 이루어지는지 확인하기 위하여 4종의 다중진단 프라이머 세트를 이용하여 주형을 1종, 2종, 3종, 4종으로 첨가하여 PCR을 실시하였다. 그 결과 1종, 2종, 3종, 4종의 세균에 대해 단독 또는 동시적으로 정확한 진단이 이루어지는 것이 확인되었다(Fig.
2. 불마름병은 glycinecin A, 들불병은 tabtoxin, 세균점무늬병은 coronatine과 세균갈색점무늬병은 syringopeptin을 목적유전자로 하여 다중 진단프라이머 조합을 설계하였다.
4. 선발된 4종 다중 진단 프라이머 조합의 경우 다른 세균들과의 비특이적 반응이 있는지 확인하기 위한 3차 선발을 거쳐 그 특이성을 검증하였다.
Table 1. Bacterial strains used for Multiplex PCR in this study.
PCR로 증폭된 생산물은 0.5×TBE buffer(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)를 이용하여 1.5% 아가로즈 겔에서 전기영동 한 후에 ethidium bromide로 염색하여 확인하였다.
axonopodis pv. glycines 를 검정하는 방법을 개발하였다. 이 방법을 이용한다면 종자뿐 아니라 감염된 식물체에서도 감염된 세균을 검출 해낼 수 있을 것이며, 본 연구에서 개발된 다중 진단프라이머 조합을 이용한다면 더욱 빠른 시간에 발생된 병을 진단할 수 있을 것이다.
2). 또한 11번 세트에 대한 다른 균주들의 비특이적 밴드의 확인을 위하여 KACC에서 분양받은 17종의 세균을 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. 그 결과, lane 1에서 대상 병원세균의 4종 혼합에서 목적 밴드가 모두 검출되었다.
목표 유전자의 염기서열은 NCBI GenBank에서 박테리오신(bacteriocin)과 파이토톡신(phytotoxin) 유전자를 탐색하여, DNAstar 프로그램에서 각각의 진단 프라이머를 설계하였다. 불마름병의 glycinecin A 유전자는 AF281069, 들불병의 tabtoxin 유전자는 DQ187985, 세균점무늬병의 coronatine 유전자는 U09027과 세균갈색점무늬병의 syringopeptin 유전자는 AF286216 유전정보를 프라이머 설계에 이용하였다.
설계된 각각의 진단 프라이머들은 1차 선발과정에서 채택된 순방향 10개 프라이머와 역방향 11개 프라이머를 2차 선발에 이용하였다(Table 2). 선발된 프라이머들은 세균 4종의 다중진단을 위해 15가지 종류로 조합하였다(Table 3).
콩에 발생하는 불마름병균, 들불병균, 세균점무늬병균과 세균갈색점무늬병균의 4종을 동시에 진단할 수 있는 다중진단 프라이머 조합을 개발하기 위하여 1차적으로 각각의 병원세균에만 특이적으로 반응하는 프라이머들을 선발하였다(Table 2). 선발된 프라이머들을 이용하여 15가지의 다중진단 프라이머 종류로 조합(Table 3)하여 4종의 병원세균에 대한 특이성을 검정하였다. 15개 조합을 이용하여 multiplex PCR을 하였을 때 3, 7, 9와 11번 조합이 4가지 병원균에 대하여 특이적인 반응을 나타내었다.
세균의 검출을 위한 모든 PCR은 PCR PreMix(BioNeer Co., Korea)를 사용하였으며, 단일 PCR의 경우에는 프리믹스 10 µl에 주형 1 µl, 프라이머 각 1 µl(20 pmol), 멸균수 7 µl를 첨가하여 최종 부피를 20 µl로 하였다.
5% 아가로즈 겔에서 전기영동 한 후에 ethidium bromide로 염색하여 확인하였다. 증폭된 생산물의 크기는 100 bp DNA ladder(BioNeer)와 비교하여 결정하였다.
진주, 의성, 익산과 나주에서 채집된 시료의 진단을 위하여 선발된 다중진단 프라이머 조합을 이용하여 Direct PCR을 실시하였다. 병반 부위를 0.
대상 데이터
3. 1차 선발로 각각의 균주에 대한 단일 진단 프라이머를선발하였으며, 여기선 선발된 21개의 프라이머들을 조합하여 4종 다중진단프라이머 선발을 위한 2차 선발에 이용하였다. 최종적으로 280 bp의 불마름병, 355 bp의 세균갈색점무늬병, 563 bp의 들불병과 815 bp의 세균점무늬병으로 구성된 다중진단 프라이머 조합이 개발되었다.
axonopodis pv. glycines 8ra는 국립식량과학원 기능성작물부에서 보관 중이던 균주를 사용하였으며, 나머지 20개 세균은 농촌진흥청 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양받았다(Table 1). 모든 세균은 -70℃ 초저온 냉동고에 보존하면서, PDA배지(Potato dextrose agar medium)와 TSA배지(Tryptic soy agar medium)에서 배양하여 실험에 사용하였다.
syringae pv. syringae KACC10604 were used in all lanes.
5 µl(20 pmol), 멸균수 4 µl를 첨가하여 최종 부피를 20 µl로 하여 반응시켰으며, PCR 조건은 단일 PCR의 방법과 동일하게 하였다. 본 실험에 사용된 주형들은 PDA배지에서 배양된 세균들을 멸균수 1 ml에 현탁(104～105 CFU/ml)한 것으로 PCR에 직접 이용하였다. PCR로 증폭된 생산물은 0.
목표 유전자의 염기서열은 NCBI GenBank에서 박테리오신(bacteriocin)과 파이토톡신(phytotoxin) 유전자를 탐색하여, DNAstar 프로그램에서 각각의 진단 프라이머를 설계하였다. 불마름병의 glycinecin A 유전자는 AF281069, 들불병의 tabtoxin 유전자는 DQ187985, 세균점무늬병의 coronatine 유전자는 U09027과 세균갈색점무늬병의 syringopeptin 유전자는 AF286216 유전정보를 프라이머 설계에 이용하였다. 설계된 각각의 진단 프라이머들은 1차 선발과정에서 채택된 순방향 10개 프라이머와 역방향 11개 프라이머를 2차 선발에 이용하였다(Table 2).
불마름병의 glycinecin A 유전자는 AF281069, 들불병의 tabtoxin 유전자는 DQ187985, 세균점무늬병의 coronatine 유전자는 U09027과 세균갈색점무늬병의 syringopeptin 유전자는 AF286216 유전정보를 프라이머 설계에 이용하였다. 설계된 각각의 진단 프라이머들은 1차 선발과정에서 채택된 순방향 10개 프라이머와 역방향 11개 프라이머를 2차 선발에 이용하였다(Table 2). 선발된 프라이머들은 세균 4종의 다중진단을 위해 15가지 종류로 조합하였다(Table 3).
15개 조합을 이용하여 multiplex PCR을 하였을 때 3, 7, 9와 11번 조합이 4가지 병원균에 대하여 특이적인 반응을 나타내었다. 최종적으로 비특이적 반응이 없으며, 예상된 생산물의 크기와 정확히 일치하는 11번 조합이 선발되었다(Fig. 1). 11번 조합의 프라이머는 280 bp의 불마름병(glycinecin A), 355 bp의 세균갈색점무늬병(syringopeptin), 563 bp의 들불병(tabtoxin), 815 bp의 세균점무늬병(coronatine)으로 구성되어 있다.
성능/효과
선발된 프라이머들을 이용하여 15가지의 다중진단 프라이머 종류로 조합(Table 3)하여 4종의 병원세균에 대한 특이성을 검정하였다. 15개 조합을 이용하여 multiplex PCR을 하였을 때 3, 7, 9와 11번 조합이 4가지 병원균에 대하여 특이적인 반응을 나타내었다. 최종적으로 비특이적 반응이 없으며, 예상된 생산물의 크기와 정확히 일치하는 11번 조합이 선발되었다(Fig.
11번 조합의 정확한 다중검정이 이루어지는지 확인하기 위하여 4종의 다중진단 프라이머 세트를 이용하여 주형을 1종, 2종, 3종, 4종으로 첨가하여 PCR을 실시하였다. 그 결과 1종, 2종, 3종, 4종의 세균에 대해 단독 또는 동시적으로 정확한 진단이 이루어지는 것이 확인되었다(Fig. 2). 또한 11번 세트에 대한 다른 균주들의 비특이적 밴드의 확인을 위하여 KACC에서 분양받은 17종의 세균을 주형으로 하여 PCR을 실시하였다.
또한 11번 세트에 대한 다른 균주들의 비특이적 밴드의 확인을 위하여 KACC에서 분양받은 17종의 세균을 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. 그 결과, lane 1에서 대상 병원세균의 4종 혼합에서 목적 밴드가 모두 검출되었다. 또한 lane 2에서 X.
Lane 1의 목적 밴드 외에 확인된 lane 2, 16, 17의 밴드는 이미 보고된 병원세균의 특이독소와 그 결과가 일치하였다(Lydon & Patterson, 2001). 포장에서 채집된 시료의 Direct 다중 PCR 진단에서는 10 lane을 제외한 모든 시료에서 불마름병이 확인되었으며, 4와 5 lane에서 들불병이 복합감염되어 있는 것이 확인 되었다(Fig. 4).
후속연구
syringae 계통들의 구분을 위하여 제한효소 Cla I, Pst I, Sma I를 이용한 PCRRFLP 방법을 제안하였다. 금후 PCR-RFLP 방법을 이용하여 동일한 박테리오신(bacteriocin)이나 파이토톡신(phytotoxin)을 분비하는 균주의 구별방법에 대한 연구가 필요할 것이다.
선발된 단일 균주에 대한 다중 프라이머 조합의 경우 다중진단 뿐만 아니라 단일진단에서도 이용가능하며, 다중 진단 프라이머 세트의 경우 기존 보고된 어떠한 진단법에 비해 시간과 비용을 줄일 수 있다. 또한, 이들 병해의 세균성 독소 연구와 병원성 연구에 중요한 기초자료를 제공할 것이다. 콩에서 발생하는 병원세균의 경우 종자감염이 되지만, 육안으로 감염종자를 구별하기는 매우 어렵다.
glycines 를 검정하는 방법을 개발하였다. 이 방법을 이용한다면 종자뿐 아니라 감염된 식물체에서도 감염된 세균을 검출 해낼 수 있을 것이며, 본 연구에서 개발된 다중 진단프라이머 조합을 이용한다면 더욱 빠른 시간에 발생된 병을 진단할 수 있을 것이다. 선발된 다중 프라이머 조합은 각 병원균이 생산하는 서로 다른 박테리오신(bacteriocin) 이나 파이토톡신(phytotoxin)을 생산하는데 관련된 유전자를 이용한 진단프라이머들이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
콩이란?
) Merr.)은 세계적으로 중요한 식량작물이며, 영양 및 건강식품으로서 뿐만 아니라 지력유지와 증진을 위한 작부체계 측면에서도 매우 중요한 작물이다(Kim & Cho, 2005). 우리나라는 콩의 원산지로 발생하는 병원체의 종류도 다양하다.
콩의 병해에 대한 특성은?
우리나라는 콩의 원산지로 발생하는 병원체의 종류도 다양하다. 또한, 품종과 환경여건에 따라 병해 발생 양상이 다르며, 잠재 병해의 대발생 위험성을 항상 가지고 있다. 현재 약 10여 종의 병원체가 콩을 침해하여 경제적으로 큰 피해를 주는 것으로 보고되어 있다.
콩의 병해의 종류는?
현재 약 10여 종의 병원체가 콩을 침해하여 경제적으로 큰 피해를 주는 것으로 보고되어 있다. 바이러스병에는 콩모자이크바이러스병, 세균병으로는 불마름병과 들불병, 곰팡이병에는 검은뿌리썩음병, 점무늬병, 역병, 자주 무늬병과 미이라병이 이들에 속한다. 최근 기후변화에 의한 온도 상승으로 현재와 미래에 경제적 피해를 줄 우려가 있는 병해는 세균병일 것으로 예상된다.
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