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문제 정의
- 또한 이렇게 선별된 peptide가 피부 유효 물질의 투과성을 향상시킬 수 있는지 측정하였다. 피부투과 촉진 peptide들은 단순히 타겟 물질과의 배합을 하는 과정으로도 투과성을 촉진한다는 것이 알려져 있는데,20) 본 연구를 통해 선별된 S3-2 peptide의 경우도 이런 chaperone 방식의 투과 촉진력을 기지고 있는지 조사하였다.
- 본 연구에서는 독자적으로 피부 각질투과성을 가지는 peptide를 개발하기 위해서 peptide library에서 각질투과성이 우수한 peptide를 선별하기로 하였고 이를 위해서 phage display library를 사용하였다. Phage Display는 Phage의 표면에 다양한 peptide를 발현시키게 한 뒤, 특정 타겟에 잘 결합하는 peptide를 개발하는 기술이다.
- 본 연구에서는 유효성분, 특히 성장인자의 피부투과성을 개선시킬 수 있는 peptide를 개발하려 하였다. 이를 위해 Phage peptide library에서 피부투과성이 좋은 phage를 선별하였고, 이 phage의 경우 normal 한 phage보다 투과성이 좋았다.
- 이를 극복하기 위해서 growth factor의 생산단계부터 투과촉진 peptide를 N 말단에 재조합하여 생산하였다. 이렇게 재조합된 growth factor의 투과 촉진 가능성을 조사하였다. 이를 위해 12 amino acid peptide와 space peptide를 넣은 상태로 재조합 하여 생산하였다(Fig.
- 또한 이렇게 선별된 peptide가 피부 유효 물질의 투과성을 향상시킬 수 있는지 측정하였다. 피부투과 촉진 peptide들은 단순히 타겟 물질과의 배합을 하는 과정으로도 투과성을 촉진한다는 것이 알려져 있는데,20) 본 연구를 통해 선별된 S3-2 peptide의 경우도 이런 chaperone 방식의 투과 촉진력을 기지고 있는지 조사하였다. 투과촉진 정도를 쉽게 파악하기 위해서, FITC labeled된 peptide를 대상으로 투과 촉진 여부 측정하였다.
가설 설정
- 원하는 peptide를 가지는 phage를 증폭할 수 있고, 염기서열을 분석하여 peptide의 아미노산을 확인 할 수 있는 장점이 있기 때문에, 타겟과의 결합하는 기능성 peptide를 선별하는 연구에 많이 이용되어왔다.16) 이런 Phage display의 장점인 peptide의 증폭, 확인 기능을 in vitro 피부투과 시스템을 접목한다면 피부투과 기능성 peptide를 개발할 수 있다.
제안 방법
- 이 과정을 1회 진행하는 것을 1 Round 선별한 것으로 정의하였다. 1 Round에서 증폭된 Phage를 가지고 다시 2 Round를 진행하는 방식으로 피부 투과력이 좋은 phage를 경쟁하는 방식으로 선별하였고 총 4 Round를 수행하였다.
- 기존에 Surfactant 등을 이용하여 투과성을 향상 시키는 방법이 존재 하지만 피부장벽을 연화시키는 단점이 있다.11,12) 본 연구에서는 성장인자 자체에 투과성을 부여하는 방식을 선택하였고, 피부 투과성 peptide를 개발하여 재조합 하는 방식을 선택하였다.
- 조직 염색을 통한 투과성 분석을 위해서, Franz cell에 동일한 양(10 µg)의 EGF와 S3-2_EGF를 처리하였다. 16시간 뒤에 Franz cell 사이에 있는 돼지피부를 꺼내어 증류수에 세척한 뒤 조직염색 과정을 진행하였다. Donor cell에 노출된 돼지피부 부위를 절단한 뒤에 10% buffered formalin에서 고정시킨 뒤 paraffin block을 제조하였다.
- 대조군은 library에서 random하게 선택되었고 "TDMNKTEIRFVR" peptide 서열을 가지는 phage를 이용하였다. 16시간 반응 후에 투과하여 Receiver에 있는 Phage의 수를 측정하였다. 이를 위해 ER2738 배양액에 300 µl에 Receiver의 TBS 20 µl에 녹아있는 phage를 처리한 뒤, 이를 TOP agar 4 ml에 섞은 후 LB/X-gal/IPTG plate 상단에 처리하고 16시간 추가 배양한 뒤 blue colony의 수를 counting하였다.
- 정확한 투과 효율을 측정하는 단계는 아니지만 선별과정을 통하여 round가 진행될수록 피부 투과성이 증가한 phage의 비율이 증가한다고 유추해 볼 수 있고, 선별은 4 round 이상 진행하지 않았다. 3, 4 round에서 선별된 phage를 20개씩 증폭하여 각각의 peptide 서열과 이 들의 발생 비율을 확인하였다. 그 결과 3, 4 round에서 20~25% 비율로 나오는 두 개의 phage 군을 확인할 수 있었다.
- Donor chamber와 Receiver chamber에는 각각 500 µl와 5 ml의 TBS(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl) 용액에 1% BSA(Sigma)와 0.01% Tween 20을 녹여서 사용하였다.
- ER2738 배양액에 300 µl에 phage를 TBS로 적정량 희석하여 처리한 뒤, 이를 TOP agar 4 ml에 섞은 후 LB/X-gal/IPTG plate 상단에 처리하고 16시간 추가 배양한 뒤 blue colony를 선별하였다.
- 측정하고자 하는 원료의 각질 투과성을 분석하기 위해서 Franz glass cell(Standard 직경 9 mm, Receiver 5 ml, Permegear)을 이용하였다. Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7 mm 두께, Medikinetics)를 장착하였다. 상단과 하단에는 각각 500 µl와 5 ml의 TBS(50 mM Tris pH 7.
- 본 연구에서는 EGF와 S3-2 EGF을 비교 하였고, Franz cell 에서 처리하였던 돼지 피부를 이용하여 투과 정도를 분석하였다. Human EGF에 특이적으로 반응하는 antibody를 사용하여 돼지피부 자체에 있을 수 있는 EGF의 signal를 줄이는 방향으로 진행하였다. DAB 발색 시약을 이용하여21) 갈색을 나타내는 EGF의 분포를 확인할 수 있었다.
- Donor cell에 노출된 돼지피부 부위를 절단한 뒤에 10% buffered formalin에서 고정시킨 뒤 paraffin block을 제조하였다. Microtome을 이용하여 4 mm로 조직을 section하였다. 슬라이드 위에 조직을 mounting한 다음 파라핀을 제거하고 수화과정을 거친 다음 조직 section을 30분간 blocking하였다.
- Donor cell에 노출된 돼지피부 부위를 절단한 뒤에 10% buffered-formalin에서 고정시킨 뒤 paraffin block을 제조하였다. Microtome을 이용하여 조직을 절단한 뒤 파라핀을 제거하고 수화과정을 거친 다음 5% eosin solution 을 이용하여 염색 후 현미경으로 관찰하였다
- coli와 phage를 분리하였다. Phage가 있는 상층액에 6ml의 침전액(20% PEG6000, 2.5 M NaCl)을 처리하여 Phage를 침전시켰다. 8000G로 원심 분리 후 침전된 Phage에 TBS 용액을 처리하여 Phage른 분리 후 보관하였다
- Porcine-skin의 상부에 각각의 peptide를 일정하게(1 µg) 처리한 후, 피부를 투과하여 receiver chamber에 있는 peptide를 형광을 측정하여 비교하였다.
- 선별된 Phage의 피부 투과성을 확인하기 위해서 대조군으로 사용할 Random 하게 선택된 Phage와 S3-2 phage의 투과성을 비교하였다. Porcine-skin의 상부에 각각의 phage를 일정하게(1010pfu) 처리한 후, 피부를 투과하여 receiver chamber 에 있는 phage의 수를 blue colony를 측정하여 비교하였다. 3회 반복하여 측정한 결과 약 투과한 phage의 수를 측정한 결과는 Fig.
- 1) 이를 잘 투과한다면 각질층을 투과하여 표피와 진피조직에 유효물질을 잘 전달할 것으로 예상할 수 있다. Porcine-skin의 상부에 일정량의 phage library(1010pfu)를 처리 하였고, 피부를 투과하여 receiver chamber에 있는 phage를 증폭한 뒤 counting 하여 처음과 같은 양을 첨가한다. 이 과정을 4 Round 진행하였다.
- 이로부터 in vitro selection 과정을 통해 투과성이 증가한 phage를 개발할 수 있다는 것을 알 수 있다. S3-2의 경우 S3-4보다 우수하여(data not shown) 차후 실험은 S3-2의 peptide를 이용하여 진행하였다.
- ER2738 배양액에 300 µl에 phage를 TBS로 적정량 희석하여 처리한 뒤, 이를 TOP agar 4 ml에 섞은 후 LB/X-gal/IPTG plate 상단에 처리하고 16시간 추가 배양한 뒤 blue colony를 선별하였다. 각각의 colony를 5 ml의 ER2738 배양액에 6시간 추가 배양한 뒤 M13 phage spin kit(Qiagen)을 이용하여 DNA를 분리 후 염기서열을 분석하였다. 이를 통해 피부투과 peptide를 선별하였다.
- 이를 위해서 FITC labeled된 peptide(1 µg)에 labeled 되지 않은 대조군 peptide와 S3-2 peptide를 단순 혼합하여 donor cell에 처리하였다. 각각의 unlabeled 된 peptide는 FITC labeled된 peptide의 1배, 5배 10배 의 양으로 추가로 투입하여 투과성의 변화를 비교하였다. 10배 추가 투입한 경우 S3-2 peptide는 대조군에 비하여 약 12배 가량 투과촉진 효과가 우수하였다(Fig.
- 각질-표피-진피 구조를 투과하여 receiver chamber에 많은 성장인자가 존재할 때, 실제 피부 구조 자체 내에서도 처리한 성장인자의 양이 많은 것을 확인하기 위해서 immunohistochemistry실험을 수행하였다. 본 연구에서는 EGF와 S3-2 EGF을 비교 하였고, Franz cell 에서 처리하였던 돼지 피부를 이용하여 투과 정도를 분석하였다.
- 대조군은 library에서 random하게 선택되었고 "TDMNKTEIRFVR" peptide 서열을 가지는 phage를 이용하였다.
- 01% Tween 20을 녹여서 사용하였다. 먼저 Phage의 경우, 선별된 phage들의 피부 투과성을 확인하기 위해서 투과된 phage의 수를 측정하여 비교하였다. 처리하는 phage의 수를 1010개로 일정하게 맞추어서 처리하였다.
- 본 연구에서는 EGF와 S3-2 EGF을 비교 하였고, Franz cell 에서 처리하였던 돼지 피부를 이용하여 투과 정도를 분석하였다.
- 비교대상의 peptide를 1 µg씩 Donor chamber에 처리하고 Receiver chamber에 투과된 Peptide의 양을 Victor fluorescence analyzer를 이용하여 FITC의 intensity를 정량하였다.
- 상단과 하단에는 각각 500 µl와 5 ml의 TBS(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl) 용액에 1% BSA(Sigma), 0.01% Tween 20을 녹여서 사용하였다.
- 선별된 Phage에 결합되어있는 peptide 자체의 피부 투과성이 향상되었는지 여부를 확인 하기 위해서 C-terminal에 FITC가 labeled 된 peptide를 제작하였다. Porcine-skin의 상부에 각각의 peptide를 일정하게(1 µg) 처리한 후, 피부를 투과하여 receiver chamber에 있는 peptide를 형광을 측정하여 비교하였다.
- 선별된 Phage의 피부 투과성을 확인하기 위해서 대조군으로 사용할 Random 하게 선택된 Phage와 S3-2 phage의 투과성을 비교하였다. Porcine-skin의 상부에 각각의 phage를 일정하게(1010pfu) 처리한 후, 피부를 투과하여 receiver chamber 에 있는 phage의 수를 blue colony를 측정하여 비교하였다.
- 선별된 peptide와 fusion된 Growth factor의 피부 투과 측정을 하기 위해서 대조군과 동일한 양의 growth factor(2 µg)를 Donor chamber에 처리하였다.
- 선별된 peptide의 투과활성을 확인하기 위해서 FITC가 fusion된 peptide를 사용하였다. 이 경우 "ACTGSTQHQCGG" 서열을 가진 peptide를 대조군으로 사용하였다.
- 5). 이렇게 재조합된 growth-factor와 일반적인 growth factor를 동일한 양을 투여한 뒤에 돼지피부를 투과하한 growth factor의 양을 비교하였다. 일정시간(16 h) 이후에 receiver chamber에 있는 growth factor의 양을 elisa kit를 이용하여 비교하였다.
- 투과촉진 peptide를 혼합하여 사용하는 방식은 생산된 하나의 peptide로 다양한 타겟에 작용하는 장점이 있지만 촉진 peptide 자체가 비싼 단점이 있다. 이를 극복하기 위해서 growth factor의 생산단계부터 투과촉진 peptide를 N 말단에 재조합하여 생산하였다. 이렇게 재조합된 growth factor의 투과 촉진 가능성을 조사하였다.
- 이를 위해 ER2738 배양액에 300 µl에 Receiver의 TBS 20 µl에 녹아있는 phage를 처리한 뒤, 이를 TOP agar 4 ml에 섞은 후 LB/X-gal/IPTG plate 상단에 처리하고 16시간 추가 배양한 뒤 blue colony의 수를 counting하였다.
- 이를 위해서 FITC labeled된 peptide(1 µg)에 labeled 되지 않은 대조군 peptide와 S3-2 peptide를 단순 혼합하여 donor cell에 처리하였다.
- 피부 각질을 투과한 phage는 Franz cell의receiver chamber에 모이게 된다. 이를 증폭하고 Donor cell에 재투입하는 과정을 여러 번 수행하여 피부투과성이 증가된 phage를 선별하였다. 이를 분석하여 피부 투과성이 좋은 peptide를 선별하게 되었고 이 peptide를 이용하여 성장인자의 각질 투과성을 향상 시킬 수 있었다.
- 각각의 colony를 5 ml의 ER2738 배양액에 6시간 추가 배양한 뒤 M13 phage spin kit(Qiagen)을 이용하여 DNA를 분리 후 염기서열을 분석하였다. 이를 통해 피부투과 peptide를 선별하였다.
- 이 과정을 4 Round 진행하였다. 이후 각각의 round 별로 투과되는 phage의 양을 측정하여 selection의 진행 여부를 판단하였다. Fig.
- 선별된 peptide와 fusion된 Growth factor의 피부 투과 측정을 하기 위해서 대조군과 동일한 양의 growth factor(2 µg)를 Donor chamber에 처리하였다. 이후 피부조직을 투과하여 Receiver chamber 존재하는 Growth factor의 농도를 Elisa kit를 이용하여 정량하여 투과성을 분석하였다.
- 이렇게 재조합된 growth-factor와 일반적인 growth factor를 동일한 양을 투여한 뒤에 돼지피부를 투과하한 growth factor의 양을 비교하였다. 일정시간(16 h) 이후에 receiver chamber에 있는 growth factor의 양을 elisa kit를 이용하여 비교하였다. 그 결과, EGF의 경우 약 3배 hGH의 경우 약 5배의 투과성이 향상된 된 것을 확인할 수 있었다.
- 조직 염색을 통한 투과성 분석을 위해서, Franz cell에 동일한 양(10 µg)의 EGF와 S3-2_EGF를 처리하였다.
- 다음날, PBS로 씻어준 다음 biotinylated 2차 항체를 30분간 처리하고, Horseradish-streptavidin conjugate를 15분간 반응시켰다. 조직의 발색을 위해 DAB(DAKO Glostrup, Denmark) 시약으로 반응시키고, 현미경으로 관찰하였다.
- 먼저 Phage의 경우, 선별된 phage들의 피부 투과성을 확인하기 위해서 투과된 phage의 수를 측정하여 비교하였다. 처리하는 phage의 수를 1010개로 일정하게 맞추어서 처리하였다. 대조군은 library에서 random하게 선택되었고 "TDMNKTEIRFVR" peptide 서열을 가지는 phage를 이용하였다.
- 최종적으로 피부 투과성 Phage가 가지는 peptide를 확인하기 위해서 phage를 single colony에서 증폭하였다. Phage를 가지는 ER2738 E.
- 피부투과 촉진 peptide들은 단순히 타겟 물질과의 배합을 하는 과정으로도 투과성을 촉진한다는 것이 알려져 있는데,20) 본 연구를 통해 선별된 S3-2 peptide의 경우도 이런 chaperone 방식의 투과 촉진력을 기지고 있는지 조사하였다. 투과촉진 정도를 쉽게 파악하기 위해서, FITC labeled된 peptide를 대상으로 투과 촉진 여부 측정하였다. 이를 위해서 FITC labeled된 peptide(1 µg)에 labeled 되지 않은 대조군 peptide와 S3-2 peptide를 단순 혼합하여 donor cell에 처리하였다.
- 투과평가를 하기 위해 사용한 Porcine skin의 구조를 파악하지 위해서 Eosin staining을 진행하였다. Donor cell에 노출된 돼지피부 부위를 절단한 뒤에 10% buffered-formalin에서 고정시킨 뒤 paraffin block을 제조하였다.
- 피부 투과성 peptide를 선별하기 위해서 경피 제제의 용출 실험 방법을 응용하였다. 이를 위해 Franz glass cell(Standard 직경 9 mm, Receiver 5 ml, Permegear)을 이용하였다.
대상 데이터
- Franz glass cell(Standard 직경 9 mm, Receiver 5 ml, Permegear), 돼지 피부(0.7 mm 두께, Medikinetics), M-13 phage spin kit(Qiagen), Human-EGF elisa kit(DEG00, R&D system), Human-hGH elisa kit(DGH00, R&D system), S3-2 peptide와 control peptide(FTIC fusion 형태, Peptron), Modified growth factor(EGF; Epidermal Growth Factor, hGH; Human Growth Hormone, S3-2 fusion EGF, S3-2 fusion hGH, 차바이오디오스텍 주문생산), anti-EGF antibody(Santacruz, sc275), Tween 20과 5% eosin Y solution(Sigma), DAB(DAKO, Glostrup, Denmark) 등의 시약은 표기된 업체에서 구매 혹은 제작하였다.
- Phage library는 Ph.D -12 phage library kit를 New England Biolab에서 구입하여 사용하였다. Franz glass cell(Standard 직경 9 mm, Receiver 5 ml, Permegear), 돼지 피부(0.
- 최종적으로 피부 투과성 Phage가 가지는 peptide를 확인하기 위해서 phage를 single colony에서 증폭하였다. Phage를 가지는 ER2738 E. coli는 LB/X-gal/IPTG plate에서 파란색을 띄는 성질을 이용하였다. ER2738 배양액에 300 µl에 phage를 TBS로 적정량 희석하여 처리한 뒤, 이를 TOP agar 4 ml에 섞은 후 LB/X-gal/IPTG plate 상단에 처리하고 16시간 추가 배양한 뒤 blue colony를 선별하였다.
- Phage를 증폭하기 위해서 Host cell로 E. coli ER2738(New England Biolab)를 이용하였다. 25 ml의 LB배지에 진탕 배양된 ER2738를 접종하고 O.
- 피부 투과성 peptide를 선별하기 위해서 경피 제제의 용출 실험 방법을 응용하였다. 이를 위해 Franz glass cell(Standard 직경 9 mm, Receiver 5 ml, Permegear)을 이용하였다.19) Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.
- 측정하고자 하는 원료의 각질 투과성을 분석하기 위해서 Franz glass cell(Standard 직경 9 mm, Receiver 5 ml, Permegear)을 이용하였다. Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.
- 피부 각질을 투과하는 phage를 선별하기 위해서 0.7 mm의 돼지 피부를 이용하였다. 이 경우 각질구조, 표지, 진피 구조가 있어(Fig.
데이터처리
- 본 연구의 투과성 분석 실험은 세 번 이상 수행하였으며, 이때 결과 값들은 mean±standard deviation(S.D.)으로 나타내었다.
- 실험군에 따른 데이터 사이의 통계적 유의성 검정은 two-tailed Student's t-test를 통하여 검증하였고, P 값이 0.05 이하일 경우 통계학적으로 유의적인 차이가 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- 01% Tween 20을 녹여서 사용하였다. Random한 peptide 서열을 가지는 phage를 가지고 시작하기 위해서, Ph.D-12 phage library kit(New England Biolab)를 사용하였다. 500 µl의 TBS(1% BSA)에 1010개의 phage를 처리하였다.
성능/효과
- 그 결과 투과한 S3-2이 115±47 pfu로 측정 되었고 대조군의 경우 8±4.5 pfu로 측정되어, S3-2의 투과성이 대조군에 비하여 약 14배가량 증가되었다.
- 일정시간(16 h) 이후에 receiver chamber에 있는 growth factor의 양을 elisa kit를 이용하여 비교하였다. 그 결과, EGF의 경우 약 3배 hGH의 경우 약 5배의 투과성이 향상된 된 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 피부투과성이 좋은 peptide가 결합된 성장인자의 경우 전체적인 성장인자 자체의 피부 투과성이 증가된다는 것을 알 수 있었다.
- 대조군의 투과량과 상대적인 값으로 비교할 경우, S3-2(7.9±0.76)의 투과성이 대조군(1±0.16)에 비하여 약 8배 가량 우수하였다(Fig. 4b).
- 확인된 peptide 자체도 대조군 peptide에 비해서 피부의 투과성이 우수한 것을 알 수 있었다. 이렇게 선별된 peptide를 EGF, hGH에 fusion된 상태로 제작하였고 이들 성장인자의 투과성을 분석한 결과 대조군에 비하여 투과력이 향상되었다. 또한 피부 내에서도 높은 농도로 존재하는 것을 확인 할 수 있었다(EGF).
- 4b). 이를 바탕으로 phage display screening 과정을 통해서 피부투과성이 향상된 peptide가 선별이 되었다는 것을 확인 할 수 있었다.
- 이를 증폭하고 Donor cell에 재투입하는 과정을 여러 번 수행하여 피부투과성이 증가된 phage를 선별하였다. 이를 분석하여 피부 투과성이 좋은 peptide를 선별하게 되었고 이 peptide를 이용하여 성장인자의 각질 투과성을 향상 시킬 수 있었다.
- 본 연구에서는 유효성분, 특히 성장인자의 피부투과성을 개선시킬 수 있는 peptide를 개발하려 하였다. 이를 위해 Phage peptide library에서 피부투과성이 좋은 phage를 선별하였고, 이 phage의 경우 normal 한 phage보다 투과성이 좋았다. 이 phage를 분석하여 투과력을 향상시켜 줄 수 있는 peptide를 확인할 수 있었다.
- 그 결과, EGF의 경우 약 3배 hGH의 경우 약 5배의 투과성이 향상된 된 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 피부투과성이 좋은 peptide가 결합된 성장인자의 경우 전체적인 성장인자 자체의 피부 투과성이 증가된다는 것을 알 수 있었다.
- 이 phage를 분석하여 투과력을 향상시켜 줄 수 있는 peptide를 확인할 수 있었다. 확인된 peptide 자체도 대조군 peptide에 비해서 피부의 투과성이 우수한 것을 알 수 있었다. 이렇게 선별된 peptide를 EGF, hGH에 fusion된 상태로 제작하였고 이들 성장인자의 투과성을 분석한 결과 대조군에 비하여 투과력이 향상되었다.
후속연구
- 본 연구를 통해서 개발된 피부투과 촉진 기능성 peptide를 이용한다면 성장인자를 효율적으로 피부에 전달할 것으로 예상할 수 있다.
- 6). 이를 바탕으로 S3-2 peptide가 결합된 성장인자의 경우 각질의 투과성이 증가되고 피부자체에 성장인자를 효율적으로 전달하는 기능을 수행할 것으로 기대 할 수 있다. EGF의 경우 표피를 이루는 keratinocyte의 분화와 활성에 많은 영향을 미치고 keratinocyte에 EGF receptor가 많이 분포하는 것으로 알려져 있다.
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