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문제 정의
- GGH(4)의 투여가 식이효율에는 어떤 변화를 주고 혈중 leptin 농도에는 어떻게 반영되는 지에 대해서 알아보았다.
- 본 연구는 GGH(4)가 체중감량에 효과가 있는지와 체중감량 효과가 있다면 이에 따라 NAFLD의 개선효과로 이어지는지를 알아보기 위해, 비만마우스모델을 이용하여 체중변화, 식이효율,혈중 leptin, 지질대사 및 ALT 농도, 지방조직의 형태학적 조직학적 변화와 간조직 내 지방축적을 조사하였다. NAFLD의 발병기전이 인슐린저항성과 연관되어 있으므로 비만 인구의 95%, 당뇨병 인구의 75%에서 NAFLD를 가지고 있다3).
- 비만은 일반적으로 지질대사 불량과 식욕증진을 쉽게 동반한다는 임상적 특성을 고려하여 울금이 가지는 지질대사 개선, 식욕억제, 간의 지방대사 개선효과에 적양과 신곡이 가지는 지질대사 개선, 식욕억제와 간의 지방대사 개선효과가 추가될 경우의 이점까지도 고려하여 울금, 적양과 신곡을 배합한 비만조절 및 개선제로서 적용가능성에 의하여 체중감량에 사용될 수 있을 것으로 생각되고 임상에서도 사용되고 있는 바 이를 실험적으로 검증하고자 본 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 8주령의 고지 방식이 유발 수컷 마우스 비만모델을 이용하여 감비경신환(4)의 투여가 체중 증가량, 식이효율, 혈중 비만조절 관련 지표와 독성 지표, 지방조직의 무게는 어떻게 변화하는지, 특히 지방간의 개선에는 어떤 영향을 주는 지에 대해서 조사하였다.
- 본 연구에서는 고지방식이 마우스 비만모델을 이용하여 GGH(4)의 투여가 체중 증가량의 변화에 따라 지방무게에 어떤 영향을 미치는 지에 대해서 알아보았다.
- 비만은 일반적으로 지질대사 불량과 식욕증진을 쉽게 동반한다는 임상적 특성을 고려하여 울금이 가지는 지질대사 개선, 식욕억제, 간의 지방대사 개선효과에 적양과 신곡이 가지는 지질대사 개선, 식욕억제와 간의 지방대사 개선효과가 추가될 경우의 이점까지도 고려하여 울금, 적양과 신곡을 배합한 비만조절 및 개선제로서 적용가능성에 의하여 체중감량에 사용될 수 있을 것으로 생각되고 임상에서도 사용되고 있는 바 이를 실험적으로 검증하고자 본 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 8주령의 고지 방식이 유발 수컷 마우스 비만모델을 이용하여 감비경신환(4)의 투여가 체중 증가량, 식이효율, 혈중 비만조절 관련 지표와 독성 지표, 지방조직의 무게는 어떻게 변화하는지, 특히 지방간의 개선에는 어떤 영향을 주는 지에 대해서 조사하였다.
제안 방법
- 32%의 체중 감량효과가 있는 것으로 나타났으며, 세 농도 중 GGH(4)-2에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다. 8주 동안 약물을 투여한 뒤에 부검 하여 생식기 주변 백색지방조직(epididymal adipose tissue, EAT), 후복벽 주변 백색지방조직(retroperitoneal adipose tissue, RAT), 사타구니 주변 피하지방조직(inguinal adipose tissue, IAT)과 갈색지방조직(brown adipose tissue, BAT)의 무게를 측정하였다. EAT, RAT, IAT와 BAT의 무게는 정상군에 비하여 대조군에서 통계적으로 증가하였고, 대조군에 비하여 GGH(4)-1,GGH(4)-2와 GGH(4)-3 모두에서 통계적으로 유의하게 감소한 것으로 나타났다(Fig.
- GGH(4)-1, GGH(4)-2와 GGH(4)-3이 식욕과 관련이 있는지를 알아보기 위하여 체중은 매주 2회, 사료섭취량은 매주 1회 8주 동안 측정하였고, 이를 근거로 하여 식이효율을 계산하였다.
- GGH(4)-1, GGH(4)-2와 GGH(4)-3이 체중 증가량에는 어떤 변화를 주는지 알아보기 위하여 매주 2회 8주 동안 체중을 측정하고, 이를 근거로 하여 체중 증가량을 계산하였다.
- GGH(4)가 고지방식이 마우스 비만모델 지방세포의 조직학적, 형태학적 변화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 지방조직을 hematoxylin-eosin 염색법으로 염색한 후 현미경 및 image analysis system으로 관찰하였다. 정상군과 비교하여 대조군에서 지방세포의 크기가 크게 증가되었다(normal, 2669.
- GGH(4)에 의하여 체중감량효과가 고지방식이 마우스 비만 모델의 지방세포와 간세포의 조직학적, 형태학적 변화에 반영하는지를 조사하였다.
- GGH(4)의 투여가 혈중 간장 독성지표인 asparate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT)와 체중 조절 및 지방간과 관련된 지표인 total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, free fatty acid, triglyceride, glucose, insulin의 농도를 조사하였다. 왜냐하면 GGH(4)의 비만 조절효과가 약리작용에 의한 경우도 있지만 이의 독성으로도 생길 수 있기 때문이다.
- 포매과정(embedding)을 거쳐 약 3 ㎛ 의 두께로 박절(paraffin-section)하여 slide 위에 조직을 얹고 건조시킨 후 hematoxylin-eosin 염색을 하였다. Slide의 물기를 없애고 mounting medium(Sigma, MO, USA)을 떨어뜨린 후 조직과 cover glass 주위에 공기가 생기지 않도록 주의하면서 cover glass를 덮어 영구보존 할 수 있도록 하였다. 조직의 사진촬영과 지방세포의 수 및 크기분석은 image analysis system(Image Pro-Plus, MD, USA)을 이용하였다.
- 마우스에서 분리한 조직은 10% phosphate-buffered formalin에서 하루 이상 고정하며 12시간 이상 흐르는 물에서 formalin을 세척한 후 60% ethanol에서 1시간, 70% ethanol에서 1시간, 80% ethanol에서 1시간, 90% ethanol에서 1시간, 95% ethanol에서 1시간, 100% ethanol에서 1시간 씩 단계적으로 탈수시켰다. Xylen에 1시간씩 3번의 투명과정 후 paraffin에 1시간 씩 2번 침투과정을 실시한다. 포매과정(embedding)을 거쳐 약 3 ㎛ 의 두께로 박절(paraffin-section)하여 slide 위에 조직을 얹고 건조시킨 후 hematoxylin-eosin 염색을 하였다.
- 고지방식이 유발 수컷마우스 비만모델을 이용하여 GGH(4)의 투여가 체중 증가량과 지방조직의 무게, 식이효율과 혈중 leptin 농도, 혈중 비만관련 지표, 그리고 지방조직의 조직학적, 형태학적 변화와 간조직의 지방축적을 분석하고 평가하여 다음의 결론을 얻었다.
- 군당 9마리 수컷을 공시하였으며, GGH(4)를 125, 250, 500㎎/㎏의 농도별로 8주간 경구 투여하였다(Table 2).
- 혈액 채취는 실험시작 8주 후 12시간 절식한 뒤 diethyl ether로 마취한 다음 개복하여 복대정맥에서 혈액 1 ㎖을 채취하였으며, 고속원심분리기(Micro 12, Hanil, Korea)를 이용하여 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 분리된 혈장은 냉동고 (-20℃)에 보관하고 혈액생화학분석기(Selectra 2, Vitalab, Netherlands)를 사용하여 asparate aminotransferase, alanine aminotransferase, triglyceride, total cholesterol, high density lipoprotein cholesterol(HDL-cholesterol), low density lipoprotein cholesterol(LDL-cholesterol), free fatty acid, glucose, insulin과 leptin의 혈중 농도를 각각 측정하였다.
- 사육환경은 온도 21±2℃, 습도 55±5%, 환기 횟수 15～17회/hour, 조도 150～300 lux, 그리고 조명은 12시간 명암(점등:06:00, 소등: 18:00)으로 조정하여 실험 기간동안 일정하게 SPF(specific pathogen free) 상태로 유지하였다.
- 식이효율은 아래의 공식에 대입시켜 최종 체중 증가량을 총 사료섭취량으로 나누어 산출하고 통계분석하였다.
- 채혈한 뒤에 부검하여 생식기 주변 백색지방조직(epididymal adipose tissue, EAT), 후복벽 주변 백색지방조직(retroperitoneal adipose tissue, RAT), 사타구니 주변 피하지방 조직(inguinal adipose tissue, IAT)과 갈색지방조직(brown adipose tissue, BAT)을 수집하고 이들의 무게를 측정하였다.
- 혈액 채취는 실험시작 8주 후 12시간 절식한 뒤 diethyl ether로 마취한 다음 개복하여 복대정맥에서 혈액 1 ㎖을 채취하였으며, 고속원심분리기(Micro 12, Hanil, Korea)를 이용하여 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 분리된 혈장은 냉동고 (-20℃)에 보관하고 혈액생화학분석기(Selectra 2, Vitalab, Netherlands)를 사용하여 asparate aminotransferase, alanine aminotransferase, triglyceride, total cholesterol, high density lipoprotein cholesterol(HDL-cholesterol), low density lipoprotein cholesterol(LDL-cholesterol), free fatty acid, glucose, insulin과 leptin의 혈중 농도를 각각 측정하였다.
대상 데이터
- (1) GGH(4)의 조성약물은 화림제약(Busan, South Korea)에서 구입하고, 동의대학교 한의과대학 방제학교실에서 정선한 뒤 분말하였다.
- 실험물질은 울금, 적양과 신곡의 복합처방을 구성하여 減肥輕身丸(4)(gambigyeongsinhwan4, GGH(4))라고 명명하였다. GGH(4)의 95% 에탄올 추출물을 사용하여 다음과 같이 제조하였다(Table 1).
- 공시동물로서는 KOATECH(Gyeonggi province, South Korea)에서 공급한 8주령의 C57BL/6N 수컷 마우스 45마리를 사용하였다. 각 군 당 9마리를 체중범위에 따른 무작위법에 의하여 군 분리를 실시하고, 이를 실험에 사용하였다.
- 공시동물로서는 KOATECH(Gyeonggi province, South Korea)에서 공급한 8주령의 C57BL/6N 수컷 마우스 45마리를 사용하였다. 각 군 당 9마리를 체중범위에 따른 무작위법에 의하여 군 분리를 실시하고, 이를 실험에 사용하였다.
- 대조물질은 autoclaved water(멸균수)를 사용하였다.
- 실험물질은 울금, 적양과 신곡의 복합처방을 구성하여 減肥輕身丸(4)(gambigyeongsinhwan4, GGH(4))라고 명명하였다. GGH(4)의 95% 에탄올 추출물을 사용하여 다음과 같이 제조하였다(Table 1).
데이터처리
- 모든 값은 mean ± standard deviation(SD)으로 표시하며, OriginLab Version 7.5(OriginLab Corporation, MA, USA)의 one way ANOVA를 이용하여 통계적 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- Slide의 물기를 없애고 mounting medium(Sigma, MO, USA)을 떨어뜨린 후 조직과 cover glass 주위에 공기가 생기지 않도록 주의하면서 cover glass를 덮어 영구보존 할 수 있도록 하였다. 조직의 사진촬영과 지방세포의 수 및 크기분석은 image analysis system(Image Pro-Plus, MD, USA)을 이용하였다.
성능/효과
- 8주후 대조군은 정상군에 비하여 몸무게가 46.08%로 크게 증가하였다. GGH(4)-1은 대조군에 비하여 체중 증가량이 감소하는 경향을 보였으나 24일째, 49일째와 마지막 날인 56일째에만 통계적인 유의성을 나타냈다(P<0.
- 8주 동안 약물을 투여한 뒤에 부검 하여 생식기 주변 백색지방조직(epididymal adipose tissue, EAT), 후복벽 주변 백색지방조직(retroperitoneal adipose tissue, RAT), 사타구니 주변 피하지방조직(inguinal adipose tissue, IAT)과 갈색지방조직(brown adipose tissue, BAT)의 무게를 측정하였다. EAT, RAT, IAT와 BAT의 무게는 정상군에 비하여 대조군에서 통계적으로 증가하였고, 대조군에 비하여 GGH(4)-1,GGH(4)-2와 GGH(4)-3 모두에서 통계적으로 유의하게 감소한 것으로 나타났다(Fig. 2). 이를 백분율로 환산하면, EAT의 경우, 대조군에 비하여 GGH(4)-1은 14.
- 6A). Triglyceride의 값은 대조군에 비하여 GGH(4)의 세 농도에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났으며, GGH(4)-3에서 그 정도가 큰 것으로 나타났다(Fig. 6B).
- 결론적으로 GGH(4)는 고지방식이 유발 수컷마우스 비만모델에서 식이효율과 leptin 농도를 낮추고 혈중 비만지표들을 개선시키며 지방량을 줄여 체중감량효과로 나타나고 지방간의 개선도 보여주며, 특히 간내 지방축적의 중요한 지표인 ALT와 triglyceride의 개선을 통하여 NAFLD의 개선에 기여할 수 있음을 보여준다.
- 그러므로 GGH(4)는 식이효율과 leptin 농도를 낮추고 혈중 비만지표들을 개선시키며 지방량을 줄여 체중감량효과로 나타나고 지방간의 개선도 보여주며, 특히 간내 지방축적의 중요한 지표인 ALT와 triglyceride의 개선을 통하여 NAFLD의 개선에 기여할 수 있음을 보여준다.
- 대조군에 비하여 Total cholesterol의 값은 GGH(4)의 세 농도 모두에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났고, HDL-cholesterol의 값은 GGH(4)의 세 농도 모두에서 통계적으로 유의한 차이가 없는 것으로 나타났으며, LDL-cholesterol의 값은 GGH(4)-2와 GGH(4)-3의 두 농도에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났다. 대조군에 비하여 free fatty acid의 값은 GGH(4)의 세 농도 모두에서 낮아지는 경향이 있으나 GGH(4)-3에서만 통계적인 유의한 차이가 있는 것으로 나타났고, Triglyceride의 값은 GGH(4)의 세 농도에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났으며, GGH(4)-3에서 그 정도가 큰 것으로 나타났다.
- 대조군에 비하여 Total cholesterol의 값은 GGH(4)의 세 농도 모두에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났고, HDL-cholesterol의 값은 GGH(4)의 세 농도 모두에서 통계적으로 유의한 차이가 없는 것으로 나타났으며, LDL-cholesterol의 값은 GGH(4)-2와 GGH(4)-3의 두 농도에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났다. 대조군에 비하여 free fatty acid의 값은 GGH(4)의 세 농도 모두에서 낮아지는 경향이 있으나 GGH(4)-3에서만 통계적인 유의한 차이가 있는 것으로 나타났고, Triglyceride의 값은 GGH(4)의 세 농도에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났으며, GGH(4)-3에서 그 정도가 큰 것으로 나타났다. 대조군에 비하여 glucose의 값은 GGH(4)의 세 농도 모두에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났고, Insulin의 값은 GGH(4)의 세 농도 모두에서 낮은 것으로 나타났으나 통계 적으로 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다.
- 대조군에 비하여 free fatty acid의 값은 GGH(4)의 세 농도 모두에서 낮아지는 경향이 있으나 GGH(4)-3에서만 통계적인 유의한 차이가 있는 것으로 나타났고, Triglyceride의 값은 GGH(4)의 세 농도에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났으며, GGH(4)-3에서 그 정도가 큰 것으로 나타났다. 대조군에 비하여 glucose의 값은 GGH(4)의 세 농도 모두에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났고, Insulin의 값은 GGH(4)의 세 농도 모두에서 낮은 것으로 나타났으나 통계 적으로 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다.
- 따라서 체중감량효과와 일치하게 GGH(4)에 의하여 지방세포의 수는 증가하였고 그 크기는 감소하였으며, 간세포의 지방축적은 억제하는 것을 알 수 있다.
- 04%로 나타났다. 반면, 대조군과 비교하여 GGH(4)의 세 농도에서 단위면적당 지방세포의 수는 증가하는 경향이 있으나 GGH(4)-2에서만 통계적으로 유의한 차이를 나타냈으며, 그 증가정도는 7.72%, 8.28%와 11.72%였다. 세 농도 중 GGH(4)-2에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다.
- 식이효율은 대조군에서 정상군에 비하여 통계적으로 유의하게 높은 것으로 나타났으며, GGH(4)-1, GGH(4)-2와 GGH(4)-3의 모두에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났으며, 세 농도 중 GGH(4)-2에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다(P<0.001, Fig. 3A).
- 실험시작 8주 후 혈장 내 asparate aminotransferase와 alanine aminotransferase의 양을 측정한 결과, asparate aminotransferase의 값은 대조군에 비하여 GGH(4)의 세 농도에서 낮게 나타났으나 모두 통계적으로 유의한 차이는 없었다(Fig. 4A). Alanine aminotransferase의 값은 대조군에 비하여 GGH(4)의 세 농도에서 낮게 나타났으며 GGH(4)-2에서만 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났다(Fig.
- 실험시작 8주 후 혈장 내 free fatty acid와 triglyceride의 양을 측정한 결과, free fatty acid의 값은 대조군에 비하여 GGH(4)의 세 농도 모두에서 낮아지는 경향이 있으나 GGH(4)-3에서만 통계적인 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다(Fig. 6A). Triglyceride의 값은 대조군에 비하여 GGH(4)의 세 농도에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났으며, GGH(4)-3에서 그 정도가 큰 것으로 나타났다(Fig.
- 실험시작 8주 후 혈장 내 glucose와 insulin의 양을 측정한 결과, glucose의 값은 대조군에 비하여 GGH(4)의 세 농도 모두에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났다(Fig. 7A). Insulin의 값은 대조군에 비하여 GGH(4)의 세 농도 모두에서 낮은 것으로 나타났으나 통계적으로 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다(Fig.
- 실험시작 8주 후 혈장 내 total cholesterol, HDL-cholesterol과 LDL-cholesterol의 양을 측정한 결과, total cholesterol의 값은 대조군에 비하여 GGH(4)의 세 농도 모두에서 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났다(Fig. 5A). HDL-cholesterol의 값은 대조군에 비하여 GGH(4)의 세 농도 모두에서 통계적으로 유의한 차이는 없었다(Fig.
- 53%의 식이효율이 낮은 것으로 나타났으며, 세 농도 중 GGH(4)-2에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다. 실험시작 8주후 혈장 내 leptin의 양을 측정한 결과, 그 값이 GGH(4)의 모든 농도에서 대조군에 비하여 통계적인 유의성이 있는 것으로 나타났으나 GGH(4)-1과 GGH(4)-2에서 그 정도가 큰 것으로 나타났다(Fig. 3B)
- 이를 백분율로 환산할 경우, 대조군에 비하여 GGH(4)-1은 11.11%, GGH(4)-2는 19.68%, GGH(4)-3은 11.32%의 체중 감량효과가 있는 것으로 나타났으며, 세 농도 중 GGH(4)-2에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다. 8주 동안 약물을 투여한 뒤에 부검 하여 생식기 주변 백색지방조직(epididymal adipose tissue, EAT), 후복벽 주변 백색지방조직(retroperitoneal adipose tissue, RAT), 사타구니 주변 피하지방조직(inguinal adipose tissue, IAT)과 갈색지방조직(brown adipose tissue, BAT)의 무게를 측정하였다.
- 3A). 이를 백분율로 환산할 경우, 대조군에 비하여 GGH(4)-1은 12.89%, GGH(4)-2는 19.90%, GGH(4)-3은 13.53%의 식이효율이 낮은 것으로 나타났으며, 세 농도 중 GGH(4)-2에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다. 실험시작 8주후 혈장 내 leptin의 양을 측정한 결과, 그 값이 GGH(4)의 모든 농도에서 대조군에 비하여 통계적인 유의성이 있는 것으로 나타났으나 GGH(4)-1과 GGH(4)-2에서 그 정도가 큰 것으로 나타났다(Fig.
- 고지방식이의 비만형질을 나타내는 비만마우스는 정상 마우스와 비교하여 상당량의 지방이 축적된 지방간을 보여주었으나 이러한 비만마우스에 GGH(4)를 투여하면 간의 지방축적이 감소되었다. 지방세포의 morphology에 미치는 효과와 유사하게 간세포의 지방축적은 대조군에 비하여 세 농도 모두에서 통계적으로 유의하게 lesion score를 감소시켰으며, 그 감소정도는 39.92%, 56.12%와 45.96%였다. 세 농도 중 GGH(4)-2에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다(Fig.
- 체중 증가량의 경우, 대조군에 비하여 GGH(4)-1은 11.11%,GGH(4)-2는 19.68%, GGH(4)-3은 11.32%의 체중 감량효과가 있는 것으로 나타났으며, 세 농도 중 GGH(4)-2에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다. EAT의 경우, 대조군에 비하여 GGH(4)-1은 14.
- GGH(4)-2는 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 혈중 ALT의 농도가 감소하는 것으로 나타났다. 체중감량효과와 일치하게 GGH(4)에 의하여 지방세포의 수는 증가하였고 그 크기는 감소하였으며, 간세포의 지방축적은 억제하였다.
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