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문제 정의
- durans 4균주에 분포하였다. 본 연구는 우리나라 원유시료에서 분리한 장알균속의 여러 종의 세균에서 동일한 다중약물 유출 펌프(multidrug efflux pump)의 분포에 대한 첫 번째 보고라 사료되며 E. faecalis 이외의 장알균속에서 이러한 유전자의 분포는 서로 다른 종간의 유전자의 수평적인 이동의 가능성을 시사한다.
- faecium의 16%가 이 유전자를 갖고 있다고 보고하였다. 본 연구에서는 우리나라 원유 시료에서 분리한 장알균을 대상으로 각종 항생제에 대한 내성 패턴을 연구하고 장알균에 존재한다고 보고된 다중약물 유출 펌프인 EmeA, EfrAB 및 Lsa의 분포도를 조사, 비교하고자 하였다. 특히 E.
- 본 연구에서는 우리나라 원유 시료에서 분리한 장알균을 대상으로 각종 항생제에 대한 내성 패턴을 연구하고 장알균에 존재한다고 보고된 다중약물 유출 펌프인 EmeA, EfrAB 및 Lsa의 분포도를 조사, 비교하고자 하였다. 특히 E. faecalis 이외의 다른 종에 속한 장알균속에서 eme(A), efr(A), efr(B) 및 lsa 유전자 분포 율과 유전자의 염기서열의 유사성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 245균주의 장알균을 대상으로 ampicillin(Sigma Co., USA), erythromycin(Sigma Co.), tetracycline(Sigma Co.), chloramphenicol(Sigma Co.), vancomycin(Sigma Co.) 및 ciprofloxacin(Korea united pharm Inc.)에 대한 감수성 검사를 실시하였다. 감수성 검사는 Clinical Laboratory Standards Institute(CLSI, USA)의 고체 배지 희석법으로 실시하였으며(CLSI, 2007) Muller-Hinton (Difco) 배지를 사용하고 표준 장알균으로 E.
- PCR 반응으로 증폭한 DNA 절편이 해당 약물 유출 펌프 유전자인지 확인하기 위하여 DNA 염기서열을 확인하였다. 각 유전자의 PCR 반응 후 전기영동을 실시하여 해당 크기의 DNA 절편을 agarose gel에서 잘라낸 후 GeneAll PCR purificaiotn kit (GeneAll Biotechnology Co.
- PCR 반응으로 증폭한 DNA 절편이 해당 약물 유출 펌프 유전자인지 확인하기 위하여 DNA 염기서열을 확인하였다. 각 유전자의 PCR 반응 후 전기영동을 실시하여 해당 크기의 DNA 절편을 agarose gel에서 잘라낸 후 GeneAll PCR purificaiotn kit (GeneAll Biotechnology Co. Ltd.)을 이용해 agarose gel에서 DNA를 추출, 정제 후 Genotech에 의뢰하여 염기서열을 결정 후 미국국립의학도서관(PubMed)에서 제공하는 염기서열분석(nucleotide blast)을 하여 염기서열의 동질성을 확인하였다.
- 다중약물 유출 펌프 유전자 후보군으로는 eme(A), efr(A), efr(B) 및 lsa를 대상으로 하였으며 drug specific 한 msr(A), msr(C), mef(A), tet(L) 및 tet(K)에 대한 분포도 함께 확인하였다. 장알균의 genomic DNA는 GeneAll Cell SV kit (GeneAll Biotechnology Co.
- 본 실험에 사용한 항생물질은 최고 농도를 64 μg/ml 로 하고 2배 계열 희석하여 최저 농도가 0.03 μg/ml 되도록 항생물질 희석 계열을 만들었다.
- 여기에 하룻밤 전 배양한 균액을 106 CFU/ml 되도록 희석한 후 5 μl씩 항생제 배지에 접종하여 배양하고 균주의 성장을 확인할 수 없는 가장 낮은 항생제의 농도를 최소억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 로 결정하였다
- 원유시료에서 분리한 장알균속 세균 245균주의 항생제 내성에 관여하는 다중약물 유출 펌프 유전자 분포도와 항생제 내성 패턴을 연구하였다. 그 결과 245 장알균속 균주의 ampicillin에 대한 내성률은 44.
- , Seoul, Korea)을 이용하여 분리하였으며 장알균의 세포벽의 분해를 용이하게 하기 위하여 lysozyme (30 mg/ml, Sigma)을 첨가하였다. 유전자의 검출은 gene specific PCR 반응을 실시하였으며 primer는 Genotech (Daejeon, Korea)에서 제작하여 사용하였다. 본 실험에 사용한 primer의 염기서열과 반응조건을 Table 1에 나타내었다.
- 장알균에 존재하는 multidrug efflux pump를 coding 하는 eme(A), efr(A), efr(B) 및 lsa 유전자의 분포를 PCR법으로 확인하였다. 그 결과 총 245균주 중 201균주(82.
- 다중약물 유출 펌프 유전자 후보군으로는 eme(A), efr(A), efr(B) 및 lsa를 대상으로 하였으며 drug specific 한 msr(A), msr(C), mef(A), tet(L) 및 tet(K)에 대한 분포도 함께 확인하였다. 장알균의 genomic DNA는 GeneAll Cell SV kit (GeneAll Biotechnology Co. Ltd., Seoul, Korea)을 이용하여 분리하였으며 장알균의 세포벽의 분해를 용이하게 하기 위하여 lysozyme (30 mg/ml, Sigma)을 첨가하였다. 유전자의 검출은 gene specific PCR 반응을 실시하였으며 primer는 Genotech (Daejeon, Korea)에서 제작하여 사용하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 균주는 본 실험실에서 분리, 동정하여 보관하고 있던 장알균 속 세균 245균주(Kim et al., 2012)를 대상으로 실험을 하였으며 균주의 배양은 Brain Heart Infusion(Difco, USA) 배지를 사용하였다.
이론/모형
- )에 대한 감수성 검사를 실시하였다. 감수성 검사는 Clinical Laboratory Standards Institute(CLSI, USA)의 고체 배지 희석법으로 실시하였으며(CLSI, 2007) Muller-Hinton (Difco) 배지를 사용하고 표준 장알균으로 E. faecalis ATCC29212를 사용하였다. 본 실험에 사용한 항생물질은 최고 농도를 64 μg/ml 로 하고 2배 계열 희석하여 최저 농도가 0.
성능/효과
- 1% (201/245)에 분포하고 있었다. E. faecalis의 경우 199균주 중 184균주에서(92.5%) eme(A) 유전자가 분포함을 확인하였으며 그 외에도 E. faecium 균주에서 25균주 중 4개 균에서(16%), E. avium의 경우 7개 균주 모두에서 (100%), E. durans의 경우 6균주중 4개 균주에서, E. raffinosus 의 경우 4개 균주 중 2개 균주에서 eme(A)가 존재함을 알 수 있었으며 각 유전자의 염기서열의 동질성은 E. faecalis V583 유전자와 98% 이상 동질성이 있음을 알 수 있었다. EmeA는 원래 E.
- faecalis V583 유전자와 98% 이상 동질성이 있음을 알 수 있었다. EmeA는 원래 E. faecalis에 존재하는 MFS 타입의 약물 유출 펌프이나 본 연구 결과에 따르면 E. faecium, E. avium, E. durans 및 E. raffinosus에서도 염기서열이 거의 동일한 eme(A) 유전자가 존재함을 확인할 수 있었으며 이는 같은 속에 속한 균 사이의 유전자의 수평 이동에 대한 가능성을 말해 주고 있다. 한편 ABC 타입의 다중약물 유출 펌프인 lsa, efr(A) 및 efr(B) 유전자의 분포는 lsa의 경우 245균주 중 176균주에서(71.
- 원유시료에서 분리한 장알균속 세균 245균주의 항생제 내성에 관여하는 다중약물 유출 펌프 유전자 분포도와 항생제 내성 패턴을 연구하였다. 그 결과 245 장알균속 균주의 ampicillin에 대한 내성률은 44.1%, erythromycin에 대한 내성률은 79.2%, tetracycline에 대한 내성률은 76.3%, chloramphenicol에 대한내성률은 36.3%였으며 vancomycin과 ciprofloxacin에 대해서는 모두 감수성임을 알 수 있었다. 내성 관련 유전자 중 MFS타입의 eme(A)는 82.
- 장알균에 존재하는 multidrug efflux pump를 coding 하는 eme(A), efr(A), efr(B) 및 lsa 유전자의 분포를 PCR법으로 확인하였다. 그 결과 총 245균주 중 201균주(82.1%)가 eme(A)를 보유하고 있었으며, 178균주(72.7%)가 efr(A) 유전자를, 189균주(77.1%) 가 efr(B) 유전자를 보유하고 있었으며 176균주(71.8%)가 lsa 유전자를 보유하고 있었다. 한편 내성 비율이 높은 erythromycin 과 tetracycline에 특이적인 efflux pump인 mef(A), msr(A), msr(C), tet(K) 및 tet(L)의 분포도 함께 조사한 결과 143 균주(58.
- 3%였으며 vancomycin과 ciprofloxacin에 대해서는 모두 감수성임을 알 수 있었다. 내성 관련 유전자 중 MFS타입의 eme(A)는 82.1%의 장알균에 분포하였으며, ABC 타입의 유전자인 efr(A)는 72.7%, efr(B)는 77.1%, lsa는 71.8%의 장알 균에 분포하였다. 특히 이러한 유전자의 기원 세균인 Enterococcus faecalis의 경우 eme(A)는 92.
- 5 μg/ml, MIC901 μg/ml)로 관찰되었다. 본 연구 결과 장알균의 erythromycin과 tetracycline에 대한 내성균의 비율이 79.2%와 76.3%로 높게 나타났으며 이러한 결과는 다른 국내, 외 다른 연구 결과와도 유사한 경향을 보이고 있음을 알 수 있으며(Mannu et al., 2003; Kwon et al., 2007; Jeong et al., 2008; Nam et al., 2009) 우리나라 축산물 유래 장알균의 erythromycin과 tetracycline에 대한 내성비율이 높음을 알 수 있었다(Table 2).
- 원유시료에서 분리한 245 장알균속 균주의 항생제 내성을 조사한 결과 ampicillin에 대한 내성률은 44.1% (MIC50 8 μg/ml, MIC90 32 μg/ml), erythromycin에 대한 내성률은 79.2% (MIC50> 64 μg/ml, MIC90 > 64 μg/ml), tetracycline에 대한 내성률은 76.3% (MIC50 > 64 μg/ml, MIC90 > 64 μg/ml), chloramphenicol 에 대한 내성률은 36.3% (MIC50 8 μg/ml, MIC90 > 64 μg/ml), vancomycin에 대한 내성률은 0% (MIC50 0.5 μg/ml, MIC90 1 μg/ml) 및 ciprofloxacin에 대한 내성률은 0% (MIC50 0.5 μg/ml, MIC901 μg/ml)로 관찰되었다.
- raffinosus에서도 efr(A), efr(B) 유전자가 존재함을 확인하였다. 특히 본 연구에서 확인된각 유전자의 염기서열의 동질성은 E. faecalis V583과 비교하였을 때 98% 이상 동질성이 있음을 알 수 있었으며 E. faecalis 및 E. faecium이외 장알균 속에서 efr(A), efr(B)가 존재함을 보고한 최초의 보고로 사료되어 더욱 가치가 있는 자료로 판단되다. 한편 원유시료에서 분리된 장알균이 erythromycin과 tetracycline 에 대해 높은 내성률을 나타내어 두 약물에 특이적인 efflux pump의 존재를 조사한 결과 erythromycin에 대한 efflux pump 중에는 mef(A)만이 존재하는 것을 확인하였으며(143/245, 58.
- faecium에서는 13%의 균에 본 유전자가 분포한다고 보고하고 있다. 하지만 본 연구에서 확인된 것으로는 E. faecalis 중 87.4%에서 efr(A) 가, 88.4%에서 efr(B)가 분포하였으며 E. faecium 중 8%에서 efr(A)가, 16%에서 efr(B)가 분포하고 있었다. 한편 그외 다른 장알균인 E.
- raffinosus에서도 염기서열이 거의 동일한 eme(A) 유전자가 존재함을 확인할 수 있었으며 이는 같은 속에 속한 균 사이의 유전자의 수평 이동에 대한 가능성을 말해 주고 있다. 한편 ABC 타입의 다중약물 유출 펌프인 lsa, efr(A) 및 efr(B) 유전자의 분포는 lsa의 경우 245균주 중 176균주에서(71.8%) 관찰되었으며 efr(A)는 245균중 178균주에서(72.7%), efr(B)는 189균주에서(77.1%) 관찰되 었다. Singh 등(2002)의 보고에 따르면 환자에게서 분리된 장알 균을 대상으로 한 연구 결과 E.
- faecalis가 lsa 유전자를 소유하고 있었으며 그 외 다른 종에선 lsa 유전자가 존재하지 않았다. 한편 가장 최근에 알려진 새로운 ABC 타입의 유출 펌프인 EfrAB 펌프 유전자는 E. faecalis 외에도 efr(A)는 E. faecium 2균주, E. durans 2균주에 존재함을 확인하였으며 efr(B)는 E. faecium 4균주, E. avium 5균주, E. durans 4균주에 존재하는 것을 확인하였다. 장알균속에 존재하는 efr(A)와 efr(B) 유전자 분포를 보고한 Sanchez 등 (2013)의 연구에 따르면 E.
- faecium 중 8%에서 efr(A)가, 16%에서 efr(B)가 분포하고 있었다. 한편 그외 다른 장알균인 E. avium, E. durans 및 E. raffinosus에서도 efr(A), efr(B) 유전자가 존재함을 확인하였다. 특히 본 연구에서 확인된각 유전자의 염기서열의 동질성은 E.
- 8%)가 lsa 유전자를 보유하고 있었다. 한편 내성 비율이 높은 erythromycin 과 tetracycline에 특이적인 efflux pump인 mef(A), msr(A), msr(C), tet(K) 및 tet(L)의 분포도 함께 조사한 결과 143 균주(58.4%)가 erythromycin specific pump인 mef(A)를 30균주(12.2%)가 tetracycline specific pump인 tet(L)을 갖고 있음을 확인하였다 (Table 3). 장알균속에서 알려진 대표적인 다중약물 유출 펌프인 EmeA는 MFS 계열에 속하는 펌프로 S.
- faecium이외 장알균 속에서 efr(A), efr(B)가 존재함을 보고한 최초의 보고로 사료되어 더욱 가치가 있는 자료로 판단되다. 한편 원유시료에서 분리된 장알균이 erythromycin과 tetracycline 에 대해 높은 내성률을 나타내어 두 약물에 특이적인 efflux pump의 존재를 조사한 결과 erythromycin에 대한 efflux pump 중에는 mef(A)만이 존재하는 것을 확인하였으며(143/245, 58.4%) tetracycline에 특이적인 efflux pump는 tet(L)만이 존재하는 것을(30/245, 12.2%) 확인하였다. 특히 tetracycline에 대한 높은 내성률에 비해 tet(L)의 분포률은 상대적으로 낮으나 이는 이미 본 연구자 등이 보고한 대로(Kim and Choi, 2012) 63.
후속연구
- 7%의 균이 표적부위를 변화시키는 tet(M)을 갖고 있기 때문인 것으로 사료된다. 본 연구는 우리나라의 축산물 유래 장알균에서 다중약물 유출 펌프 유전자인 eme(A), efr(A), efr(B), 및 lsa 유전자의 분포비율을 연구한 첫 보고라 사료되며 또한 E. faecalis 이외 다른 종의 장알균에서 E. faecalis에 존재한다고 알려진 다중 약물 유출 펌프 유전자인 eme(A), efr(A) 및 efr(B)가 존재함을 규명한 연구로서 동일속에 속한 다른 종의 균주간의 내성 유전자의 수평이동에 대한 가능성을 시사하는 결과로 추후에도 지속적인 모니터링이 필요된다.
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