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문제 정의
- 1). 본 연구는 이러한 대섭이굴 표면에 형성 된 미생물 막의 특성을 관찰하고자 분자생태학적인 기법(16S rRNA 유전자의 PCR 증폭 및 pyrosequencing 기술)을 이용하여 세균 및 고세균의 군집조성을 조사하였다.
가설 설정
- 대섭이굴은 비교적 지상으로부터 얕은 깊이에 위치하고 있다. 그래서 강우에 의해 지상으로부터 각종 무기물과 유기물 등을 포함한 물질들이 침출을 통해 굴의 벽 안 쪽으로 스며들어 벽 표면까지 확산 될 것이라고 추정한다. 대섭이굴 탐사과정에서 동굴 벽면에 빛을 조사했을 때 특이하게도 백색의 생물막에서 빛이 반사되는 것을 육안으로 확인 할 수 있었다(Fig.
제안 방법
- Pyrosequencing에 요구되는 모든 반응은 염기서열 제조사인 454 Life Science (Branford, USA)의 방법에 따라 서울대학교 농업과학공동기기센터(NICEM, Korea)에서 진행 하였으며, GS FLX Titanium system (454 Life Science)을 이용하여 염기서열을 결정하였다. Barcode sorting에 따라 분리된 각 서열들에서 barcode, primer 그리고 linker 서열을 제거 한 뒤 Mothur software (Schloss et al., 2009)의 Chimera-uchime (Edgar et al., 2011)을 통해 chimera로 의심되는 염기서열 제거를 수행하였다. 또한 Ribosomal database project (RDP)의 Pyrosequencing pipeline 중에 pipeline initial process를 통해 낮은 질의 염기서열(<200 bp)을 제거하였다.
- Rarefaction analysis of the bacterial (A) and archaeal (B) 16S rRNA gene sequences recovered from cave Daesubee. The rarefaction curve, plotting the number of observed phylotypes as a function of the number of clones, was computed by PAST. The dotted lines represent 95% confidence intervals.
- 고세균 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 사용한 primer는 고세균 특이적인 primer인 514F (5′-GGTGBCAGCCGCCGCGRKAAHACC-3′)와 918R (5′-TGCYCCCCCGYCWATTSCTTTA-3′)을 쌍으로 이용하였다(Kim et al., 2013).
- , 2007). 고세균의 경우에는 배양이 되지 않은(uncultured) 고세균 그룹의 계통 분류가 정확하지 않기 때문에 GenBank (http://ncbi.nlm.nih.gov)의 database와 비교한 후 BLASTN program으로 상동성 및 계통 분류를 실시하였다. 그 결과 세균은 총 2663개의 raw reads 중 421 reads를 얻었으며, 단독개체(singletons)의 수는 5개였다.
- 또한 Ribosomal database project (RDP)의 Pyrosequencing pipeline 중에 pipeline initial process를 통해 낮은 질의 염기서열(<200 bp)을 제거하였다.
- 본 실험을 위하여, 동굴표면의 미생물 막을 무균조작을 통해 채취하고 얼음이 존재하는 상태에서 하루 내에 실험실로 운반하였다. 또한 미생물 막으로부터 DNA를 추출하기 전에 냉동(-70℃) 보관하였다.
- 동굴환경은 표면 토양환경과는 다른 독특한 생태계를 이루는 것으로 알려져 있다. 본 연구를 통하여 제주도 용암동굴(대섭이굴)의 생물막(biofilm)으로부터 얻은 시료를 pyrosequencing 기술을 통해 16S rRNA 유전자를 증폭하여 세균과 고세균의 군집을 조사하였다. 생물막에 우점하는 세균은 Actinobacteria문 (phylum)의 Pseudonocardia mongoliensis (전체 세균 reads수의 82.
- 세균 및 고세균 유전자의 증폭 반응을 위해 2× EF Taq mixture (SolGent Co., Ltd. Korea) 10 μl와 10 pmol forward와 reverse primer 각각 1 μl와 3차 증류수 7 μl를 넣고, 시료로부터 추출한 DNA를 1 μl씩 넣어 총 20 μl의 반응액을 만들었다.
- , 2008). 세균과 고세균의 정량 PCR을 위하여 16S rRNA 유전자를 이용하였다. 또한 이에 사용한 primer와 자세한 방법은 Jung 등(2011)에서 설명한 바와 같으며 간단히 설명하면 다음과 같다.
- 세균의 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 사용한 primer는 세균 특이적 primer인 8F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)와 338R (5′-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′)을 쌍으로 이용하였다(Ovreas et al., 1997; Vickerman et al., 2007).
- Phylogenetic tree는 RDP의 Pyrosequencing pipeline 중에 Complete linkage clustering (cutoff=97%)을 통해 얻어진 대표 서열을 이용하였 다. 염기서열 정리(Sequence alignment)는 CLUSTER W 알고 리즘으로 정렬한 후 MEGA 5.1 program (Tamura et al., 2011)의 neighbor-joining을 따라 계통도를 작성하여 유전적 유사성을 검토하였다. 군집의 다양성을 분석하기 위하여 Taxonomy-Based Clustering (TBC) program (Lee et al.
- 또한 Ribosomal database project (RDP)의 Pyrosequencing pipeline 중에 pipeline initial process를 통해 낮은 질의 염기서열(<200 bp)을 제거하였다. 이렇게 얻은 염기서열들을 RDP Classifier를 이용해 세균의 계통 분류를 실시하였다(bootstrap cutoff=50%) (Cole et al., 2007). 고세균의 경우에는 배양이 되지 않은(uncultured) 고세균 그룹의 계통 분류가 정확하지 않기 때문에 GenBank (http://ncbi.
- , 2001)에 적용하였다. 이를 통해 Operational Taxonomic Unit (OTU) (세균: 17, 고세균: 8), Chao1 richness estimate (세균: 20.33, 고세균: 9.50) 그리고 Shannon index (세균: 0.81, 고세균: 1.53) 등의 다양성 지수분석 값을 구하였다. 세균과 고세균의 Rarefaction 분석은 PAST program (http://folk.
- 증폭된 16S rRNA 유전자는 PCR purification kit (Cosmo Genetech Co. Ltd, Korea)를 이용하여 정제하였으며, 정제된 산물은 Pyrosequencing 기법을 이용하여 염기서열 분석을 시도하였다. Pyrosequencing에 요구되는 모든 반응은 염기서열 제조사인 454 Life Science (Branford, USA)의 방법에 따라 서울대학교 농업과학공동기기센터(NICEM, Korea)에서 진행 하였으며, GS FLX Titanium system (454 Life Science)을 이용하여 염기서열을 결정하였다.
- , 2004). 추출된 DNA는 Sephadex를 이용한 겔 투과법(gel filteration)을 통해 PCR 저해 물질을 제거하고 최종적으로 세균 및 고세균의 16S rRNA 유전자 증폭에 이용하였다. 세균의 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 사용한 primer는 세균 특이적 primer인 8F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)와 338R (5′-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′)을 쌍으로 이용하였다(Ovreas et al.
- 1 (Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 진행하였으며 모든 유전자의 증폭은 Thermal-cycling parameters를 따랐다. 표준곡선(Standard Curve)은 이미 알려진 기준 유전자(reference gene)의 복제 개수(copy number)와 cycle threshold (CT) 값 사이의 관계를 가지고 산출하였다.
대상 데이터
- 그 결과 세균은 총 2663개의 raw reads 중 421 reads를 얻었으며, 단독개체(singletons)의 수는 5개였다. 고세균의 경우 증폭효율이 낮아 총 295개의 raw reads를 얻을 수 있었으며, 낮은 질의 염기서열을 제거 후 182개의 reads를 확보 하였다. 하지만 이 중 많은 세균의 염기서열(115개의 reads)이 존재하여 이를 제거하고, 최종적으로 총 67 reads의 고세균 염기서 열을 얻을 수 있었으며 단독개체의 수는 3개였다.
이론/모형
- Ltd, Korea)를 이용하여 정제하였으며, 정제된 산물은 Pyrosequencing 기법을 이용하여 염기서열 분석을 시도하였다. Pyrosequencing에 요구되는 모든 반응은 염기서열 제조사인 454 Life Science (Branford, USA)의 방법에 따라 서울대학교 농업과학공동기기센터(NICEM, Korea)에서 진행 하였으며, GS FLX Titanium system (454 Life Science)을 이용하여 염기서열을 결정하였다. Barcode sorting에 따라 분리된 각 서열들에서 barcode, primer 그리고 linker 서열을 제거 한 뒤 Mothur software (Schloss et al.
- 군집의 다양성을 분석하기 위하여 Taxonomy-Based Clustering (TBC) program (Lee et al., 2012)을 이용하고 3% cutoff 기준으로 distance matrix를 만들었으며, 이를 PAST program (Øyvind et al., 2001)에 적용하였다.
- 또한 미생물 막으로부터 DNA를 추출하기 전에 냉동(-70℃) 보관하였다. 냉동 보관된 시료로부터 DNA를 추출하기 위하여 액체질소를 이용한 추출방법으로 수행 하였으며, 그 상세한 방법은 토양에서 DNA를 추출하는 방법을 따랐다(Rhee et al., 2004). 추출된 DNA는 Sephadex를 이용한 겔 투과법(gel filteration)을 통해 PCR 저해 물질을 제거하고 최종적으로 세균 및 고세균의 16S rRNA 유전자 증폭에 이용하였다.
- 53) 등의 다양성 지수분석 값을 구하였다. 세균과 고세균의 Rarefaction 분석은 PAST program (http://folk.uio.no/ohammer/past)의 individual-based Coleman 방법을 사용하였으며, 또한 SigmaPlot (V7.101, SPSS)을 통하여 rarefaction curve 의 plotting을 수행하였다(Park et al., 2008). 세균과 고세균의 정량 PCR을 위하여 16S rRNA 유전자를 이용하였다.
- 또한 이에 사용한 primer와 자세한 방법은 Jung 등(2011)에서 설명한 바와 같으며 간단히 설명하면 다음과 같다. 정량 PCR은 MiniOpticon real-time PCR detection system (Bio-Rad Laboratories, USA)과 Opticon Monitor software version 3.1 (Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 진행하였으며 모든 유전자의 증폭은 Thermal-cycling parameters를 따랐다. 표준곡선(Standard Curve)은 이미 알려진 기준 유전자(reference gene)의 복제 개수(copy number)와 cycle threshold (CT) 값 사이의 관계를 가지고 산출하였다.
- 마지막으로 72℃에서 7분간 최종 신장(extension)을 시켰다. 증폭된 세균 및 고세균의 16S rRNA 유전자는 Agarose gel 전기영동법을 이용하여 크기를 확인하였다.
성능/효과
- 하지만 질소순환의 측면에서 보면 대섭이굴의 동굴 벽의 질산화 과정에 Nitrospira 속의 아질산-산화 세균과 함께 암모니아-산화 고세균이 매우 중요한 기능을 함을 추정할 수 있다. Nitrospira 속의 염기서열이(세균 전체 염기서열의 1.9%) 정량 PCR로 확인된 세균에 대한 고세균의 16S rRNA 유전자 비율(1.4%)과 매우 유사함을 알 수 있다. 이를 통해 지표면에서 암모니아가 침출되어 암모니아 산화 고세균이 자라게 되고 그 부산물로 생긴 아질산을 산화하는 Nitrospira 속의 세균이 생장하였을 것으로 추정된다.
- gov)의 database와 비교한 후 BLASTN program으로 상동성 및 계통 분류를 실시하였다. 그 결과 세균은 총 2663개의 raw reads 중 421 reads를 얻었으며, 단독개체(singletons)의 수는 5개였다. 고세균의 경우 증폭효율이 낮아 총 295개의 raw reads를 얻을 수 있었으며, 낮은 질의 염기서열을 제거 후 182개의 reads를 확보 하였다.
- 대섭이굴 생물막의 고세균중 대부분 (약 66%)은 Thaumarchaeota 중에서도 1.1a-Associated 그룹에 속하는 고세균으로 주로 산성(pH<5)의 토양에서 암모니아 산화에 관여하는 것으로 알려진 고세균 Candidatus Nitrosotalea devanaterra (Lehtovirta-Morley et al., 2011)와 높은 유사성을 가지고 있음이 확인 되었다(Fig. 4B).
- 그래서 강우에 의해 지상으로부터 각종 무기물과 유기물 등을 포함한 물질들이 침출을 통해 굴의 벽 안 쪽으로 스며들어 벽 표면까지 확산 될 것이라고 추정한다. 대섭이굴 탐사과정에서 동굴 벽면에 빛을 조사했을 때 특이하게도 백색의 생물막에서 빛이 반사되는 것을 육안으로 확인 할 수 있었다(Fig. 1). 본 연구는 이러한 대섭이굴 표면에 형성 된 미생물 막의 특성을 관찰하고자 분자생태학적인 기법(16S rRNA 유전자의 PCR 증폭 및 pyrosequencing 기술)을 이용하여 세균 및 고세균의 군집조성을 조사하였다.
- 하지만 대섭이굴에서는 어떻게 이들 방선균들이 같이 발견된 다른 일반 종속영양(heterotroph) 세균인 Proteobacteria나 호산성 종속영양세균인 Acidobacteria보다 우점하고 있는지에 대한 후속 연구가 필요하다. 또한 아질산을 산화하는 것으로 알려진 미생물을 포함하는 phylum인 Nitrospirae와 관련된 염기서열이 약 1.9% 존재하고 있었다(Fig. 3A). 일반적으로 Pseudonocardia를 포함 하는 많은 방선균들이 고체배지 위에서 집락(colony)을 이룰 경우 기균사(aerial hyphae) 및 포자(spore)들은 보통 소수성(hydrophobicity)을 나타내는 것으로 알려져 있다(Clark et al.
- 2A). 또한 총 reads 수(N)와 OTU에서의 singleton 수(n)를 이용하여 만든 공식(1-n/N)을 통해 구한 Good coverage (Good, 1953; Qian et al., 2011)의 값이 약 0.99가 나오기 때문에, 비록 적은 염기의 개수를 얻었지만 자료 분석에는 큰 문제가 없음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 증폭된 세균 16S rRNA 유전자의 분석결과 대부분(약 83%)의 유전자들이 방선균(Actinobacteria) 문(phylum), 특히 그 중에서도 82.
- 본 연구를 통하여 제주도 용암동굴(대섭이굴)의 생물막(biofilm)으로부터 얻은 시료를 pyrosequencing 기술을 통해 16S rRNA 유전자를 증폭하여 세균과 고세균의 군집을 조사하였다. 생물막에 우점하는 세균은 Actinobacteria문 (phylum)의 Pseudonocardia mongoliensis (전체 세균 reads수의 82.5%)와 깊은 근연관계가 있었으며, 동굴유래의 다양한 세균들과 같이 무리(cluster)를 형성하였다. 동굴 벽면에 빛을 조사 하였을 때 반사되어 빛나는 것은 아마도 방선균의 균사(hypha) 들로 이루어진 생물막이 수분을 흡수하지 못하기 때문으로 추정된다.
- 99가 나오기 때문에, 비록 적은 염기의 개수를 얻었지만 자료 분석에는 큰 문제가 없음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 증폭된 세균 16S rRNA 유전자의 분석결과 대부분(약 83%)의 유전자들이 방선균(Actinobacteria) 문(phylum), 특히 그 중에서도 82.5%가 Pseudonocardineae (suborder)에 속하는 것으로 밝혀졌다(Figs. 3A and 4A). 이는 Slovenia 석회암 동굴에서 높은 세균 다양성을 보이는 것과 대조를 이룬다(Park et al.
- 정량 PCR을 통한 분석 결과 추출된 DNA의 ng당 고세균 16S rRNA 유전자가 7.2 × 103(± 2.74 × 102), 세균의 16S rRNA 유전자가 5.2 ×105(± 3.73 × 104)으로 고세균이 세균에 비해 1.4%에 불과하므로 대섭이굴에서 상대적인 고세균의 생지화학적 순환에 대한 기여도가 높지 않을 것으로 추정된다.
- 본 연구에서 Pyrosequencing법을 이용하였음에도 불구하고 적은 reads를 확보하였으나 아래에 설명한 결과로 미루어 보아군집분석에는 심각한 영향을 미치지 않았다. 즉, 세균의 경우 관찰된 OTU (17)와 richness (풍부도: 20.33)에 있어서 큰 차이가 없었으며, rarefaction 분석 결과 rarefaction curve가 점근선 (asymptote)에 거의 도달하는 것을 볼 수 있었기 때문에 비록 pyrosequencing을 통하여 얻은 염기서열의 수가 적으나 분석에는 큰 문제점이 없음을 확인할 수 있었다(Fig. 2A). 또한 총 reads 수(N)와 OTU에서의 singleton 수(n)를 이용하여 만든 공식(1-n/N)을 통해 구한 Good coverage (Good, 1953; Qian et al.
- , 2008). 특히, 대섭이굴 생물막의 방선균 문 염기서열들이 분리된 세균 중에서는 Pseudonocardia mongoliensis MN08-A0270T (Ara et al., 2011)와 가장 가까운 근연관계가 있음을 확인할 수 있었다(16S rRNA 유전자 유사성 95.3%) (Fig. 4A). P.
- 고세균의 경우 증폭효율이 낮아 총 295개의 raw reads를 얻을 수 있었으며, 낮은 질의 염기서열을 제거 후 182개의 reads를 확보 하였다. 하지만 이 중 많은 세균의 염기서열(115개의 reads)이 존재하여 이를 제거하고, 최종적으로 총 67 reads의 고세균 염기서 열을 얻을 수 있었으며 단독개체의 수는 3개였다. Phylogenetic tree는 RDP의 Pyrosequencing pipeline 중에 Complete linkage clustering (cutoff=97%)을 통해 얻어진 대표 서열을 이용하였 다.
후속연구
- 1a-Associated 그룹이 우점하는 다양성이 낮은 세균 및 고세균의 군집을 가진 독특한 생물막의 형성에 기여하는 지는 알 수 없다. 앞으로 곶자왈 지역의 투수과정에서 여과된 유기 및 무기 영양분의 조성에 대한 정밀한 연구를 통하여 대섭이굴의 독특한 미생물 막의 군집조성에 미치는 영향을 규명할 수 있을 것으로 사료된다.
- 하지만, 이 석회암 동굴에서 빛이 적게 반사되는 것은 낮은 방선균의 양(약 16% 방선균 염기서열)과 관계가 있음을 추정 할 수 있다. 이는 앞으로 생물막 자체에 대한 in situ 실험(Fluorescence in situ hybridization 및 방선균 세포벽 구성물질 정량 및 정성분석)을 통해 증명 할 수 있을 것이다.
- 96의 수치가 나왔다. 이러한 결과들은 비록 pyrosequencing을 통해 적은 수의 염기서열을 확보하였으나 본 실험의 목적을 위한 군집분석에 이용할 수 있음을 지지해주고 있다. 증폭된 고세균 16S rRNA 유전자의 대부분(전체 염기서열 개수의 93%)은 놀랍게도 최근 제안된 Thaumarchaeota (Brochier-Armanet et al.
- , 2008). 하지만 대섭이굴에서는 어떻게 이들 방선균들이 같이 발견된 다른 일반 종속영양(heterotroph) 세균인 Proteobacteria나 호산성 종속영양세균인 Acidobacteria보다 우점하고 있는지에 대한 후속 연구가 필요하다. 또한 아질산을 산화하는 것으로 알려진 미생물을 포함하는 phylum인 Nitrospirae와 관련된 염기서열이 약 1.
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