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문제 정의
- cpDNA trnH-psbA, trnL-F 지역의 분석결과도 이를 뒷받침해준다. trnH-psbA 지역의 염기서열를 보면 물피와 돌피의 종의 한계성보다는 포항과 경산의 돌피 한 개씩 2bp 씩의 차이점을 확인 할 수 있다(Fig.
- 따라서, 본 연구는 이전부터 제기 되어온 독도의 돌피와 물피의 종의 실체를 확인하고, 나아가 울릉도 및 육지의 돌피, 물피를 비교하여 이들의 지리적 특징 및 종의 실체를 밝히고자 하였다.
제안 방법
- ) Honda)의 분류학적 실체를 조사하였다. Echinochloa crus-galli complex에 속하는 2분류군 26개체에 대한 ITS, trnH-psbA 및 trnL-F의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 독도의 돌피와 물피를 포함한 조사된 두 분류군은 유전자구간에서 동일한 염기서열을 나타내는 것으로 관찰되었다.
- )와 물피(Echinochloa crus-galli var. echinata (Willd.) Honda)의 분류학적 실체를 조사하였다. Echinochloa crus-galli complex에 속하는 2분류군 26개체에 대한 ITS, trnH-psbA 및 trnL-F의 염기서열을 분석하였다.
- (1991)에 의해 제작된 primer c, d, e, f를 사용하였다. 각 지역의 증폭을 위한 Polymerase Chain Reaction(PCR) 반응용액의 조성은 주형 DNA 20~50n g, 10X Distar-Taq, DNA buffer 2.5 ㎕, 10mM의 dNTPs mix 0.5 ㎕, 10 pmol의 primer 각각 1 ㎕, 2.5 unit의 Distar-Taq DNA polymerase 0.13 ㎕(Solgent Co., Korea)에 total volume이 총 25 ㎕가되도록 증류수를 조절하여 첨가하였다. 조제된 PCR반응 용액은 95℃에서 2분 동안 predenaturation을 한 후, 95 ℃ 20초, 50℃ 40초, 72℃ 1분을 하나의 주기로 하여 35회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 5분간 extension하였다.
- 계통학적 분석으로 각 염기서열들은 Geneious pro v5.4 (Drummond et al., 2011)으로 조합, 정열 하였고 최종 세부 정열은 수작업을 통하여 수행하였다. 정렬된 염기서열은 PAUP* ver.
- , 1992). 이처럼 세 지역 모두 coding 지역보다 빠르게 변화하는 지역을 선정하여 돌피와 물피 사이의 염기치환이나 돌연변이 확인에 주안점을 두었다.
대상 데이터
- 까락이 짧은 돌피, 까락이 긴 물피, 외부형태학적으로 중간 형태를 띠는 개체, 까락이 없는 좀돌피(E. crus-galli var. praticola Ohwi)를 포함한 근연 분류군을 재료로 사용하였다. 본 연구에서 사용된 재료는 2011년 6월부터 10월까지 자생지에서 직접 채집하여 사용하였다(Table 1).
- praticola Ohwi)를 포함한 근연 분류군을 재료로 사용하였다. 본 연구에서 사용된 재료는 2011년 6월부터 10월까지 자생지에서 직접 채집하여 사용하였다(Table 1). 채집된 재료는 건조표본으로 제작하여 영남대학교 식물표본관(YNUH) 에 보관하였다.
- 본 연구에서는 고등식물의 계통분석에 널리 이용되고 있으며, 양친 유전성(bioparental inheritance)을 가지고 coding 지역보다 빠르게 진화하여 유전자간의 변이성이 높은 편인 nuclear ribosomal DNA(nrDNA)의 ITS 지역과 chloroplast DNA(cpDNA)의 비교적 느린 진화가 일어나는 coding 지역이 아닌 높은 변이율을 가지고 있는 non-coding 지역인 trnH-psbA, trnL-F 지역을 사용하였다(Palmer et al., 1988; Clegg et al., 1991; Soltis et al., 1992). 이처럼 세 지역 모두 coding 지역보다 빠르게 변화하는 지역을 선정하여 돌피와 물피 사이의 염기치환이나 돌연변이 확인에 주안점을 두었다.
데이터처리
- 각 분계도의 지지정도를 알아보기 위하여 Bootstrap (Felsenstein, 1985)를 이용하였다. 이러한 분석방법은 무작위로 100회를 반복하였으며 이를 통해 계통수를 찾아내어 Consistency index(CI; Kluge and Farris, 1969), Retention index(RI; Farris, 1989)을 산출하였다.
이론/모형
- 정렬된 염기서열은 PAUP* ver. 4.0b10(Swofford, 2003)으로 Heurastic search 를 이용하여 maximum parsimony(MP) 분석방법을 이용하였다. 각 분계도의 지지정도를 알아보기 위하여 Bootstrap (Felsenstein, 1985)를 이용하였다.
- DNA 추출은 생체을 이용하여 Precellys 24 Homogenizer (Bertin Technologies, France)를 이용하여 분쇄시킨 후, Loockerman and Jansen(1996)의 방법으로 추출하였다. ITS 지역의 증폭은 primer ITS4, ITS5(White et al.
- 0b10(Swofford, 2003)으로 Heurastic search 를 이용하여 maximum parsimony(MP) 분석방법을 이용하였다. 각 분계도의 지지정도를 알아보기 위하여 Bootstrap (Felsenstein, 1985)를 이용하였다. 이러한 분석방법은 무작위로 100회를 반복하였으며 이를 통해 계통수를 찾아내어 Consistency index(CI; Kluge and Farris, 1969), Retention index(RI; Farris, 1989)을 산출하였다.
성능/효과
- 1%로 나타났다. MP tree를 비교 분석한 결과, 독도의 돌피와 물피, 울릉도의 돌피 한 개체가 70%의 bootstrap value로 분계조를 형성하였으며, 울릉도와 육지의 돌피와 물피가 한 분계조를 형성하였다(Fig. 1A). 돌피와 물피의각 분류군에서 염기서열의 차이는 관찰되지 않았으며, 지역에 의한 차이는 확인되었다.
- cpDNA의 trnH-psbA 지역의 비교 분석 결과 총 길이는 620 bp, Pairwise identity는 99%였으며, G + C 함량은 38.4%였다. 염기서열 확인 결과, 돌피와 물피 그리고 근연 분류군인 좀돌피 중 포항의 돌피 한 개체, 경산의 돌피 한 개체를 제외하고는 차이점이 없었다(Fig.
- cpDNA의 trnL-F 지역의 비교 분석 결과 총 길이는 836 bp, Pairwise distance는 100%였으며, G + C 함량은 33.9%로 나타났다. 지역과 종에 상관없이 한 분계조를 나타냈으며 염기서열이 외군을 포함하여 모두 동일하였다(Fig.
- (2007)은 독도의 돌피와 물피의 두 종이 존재하는지, 혹은 돌피의 생태형으로써 물피가 존재하는지에 대하여 문제점을 제기하였다. nrDNA ITS 실험 결과 물피와 돌피의 차이는 없는 것으로 나타났으며, 특이하게 지역별로 나뉘어 졌다(Fig. 4). 육지와 울릉도의 돌피와 물피가 묶여 지며, 그 중 울릉도의 돌피 한 종과 독도의 돌피, 물피가 묶여지는 것을 확인 하였다.
- nrDNA의 ITS 실험 결과, 육지와 울릉도의 돌피가 한 분계조를 이루며, 그 안쪽에 독도의 돌피와 울릉도의 한 개체가 같은 분계조를 이루고 있는 것을 확인하였다(Fig. 1A). 이는 매우 단편적이지만, 육지의 돌피가 울릉도를 거쳐 독도로 이동했다고 가정할 수 있다.
- Echinochloa crus-galli complex에 속하는 2분류군 26개체에 대한 ITS, trnH-psbA 및 trnL-F의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 독도의 돌피와 물피를 포함한 조사된 두 분류군은 유전자구간에서 동일한 염기서열을 나타내는 것으로 관찰되었다. 따라서 호영 및 까락 등의 연속적인 형질로 두 분류군을 구분하는 기존의 형태형질에 근거한 분류학적 처리는 재고가 필요할 것으로 보인다.
- 1A). 돌피와 물피의각 분류군에서 염기서열의 차이는 관찰되지 않았으며, 지역에 의한 차이는 확인되었다. 다른 지역의 돌피, 물피와는 다르게 독도의 돌피, 물피와 울릉도의 한 개체의 경우 한 개의 염기서열이 G가 아닌 C를 나타내고 있었다(Fig.
-
분자계통학적 분석
분자 계통학적 연구로 nrDNA의 ITS 지역 분석결과, 총길이는 592 bp, Pairwise distance는 99.9%였으며 G + C 함량은 60.1%로 나타났다. MP tree를 비교 분석한 결과, 독도의 돌피와 물피, 울릉도의 돌피 한 개체가 70%의 bootstrap value로 분계조를 형성하였으며, 울릉도와 육지의 돌피와 물피가 한 분계조를 형성하였다(Fig.
- 4). 육지와 울릉도의 돌피와 물피가 묶여 지며, 그 중 울릉도의 돌피 한 종과 독도의 돌피, 물피가 묶여지는 것을 확인 하였다. 본 실험 결과에서는 Lee(1978), Sun et al.
- 9%로 나타났다. 지역과 종에 상관없이 한 분계조를 나타냈으며 염기서열이 외군을 포함하여 모두 동일하였다(Fig. 3).
후속연구
- 또한 울릉도 한 개체를 포함한 독도의 돌피는 이동 후 환경에 맞게 적응하고 있다고 추정할 수 있다. 결론적으로 gene flow의 경우를 보면 육지의 돌피가 울릉도로 이동하였고 최근에 독도로 유입되어 적응하고 있다고 생각되며, 이러한 이동경로를 명확하게 하기 위해서는 좀 더 많은 개체수를 포함하여 한반도 돌피의 이동경로를 추적해야 할 것으로 생각된다.
- 그 결과 독도의 돌피와 물피를 포함한 조사된 두 분류군은 유전자구간에서 동일한 염기서열을 나타내는 것으로 관찰되었다. 따라서 호영 및 까락 등의 연속적인 형질로 두 분류군을 구분하는 기존의 형태형질에 근거한 분류학적 처리는 재고가 필요할 것으로 보인다. 한편, ITS 경우, 독도에서 채집된 물피와 돌피 개체들은 울릉도 및 육지에서 채집된 개체들과는 별개의 분계조를 형성함으로써 독립된 진화 경로를 거치고 있음을 보여 주었다.
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