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문제 정의
- 소염 · 진통에 유사한 생리효과를 나타낼 수 있는 비스테로이드성 소염진통제 및 스테로이드성 소염진통 성분들의 복합적인 동시분석에 대한 연구는 아직 미미한 실정이며, 따라서 본 연구에서는 검출빈도가 있어 문제가 되고 있는 소염 · 진통 효과를 나타내는 의약품 성분의 선별적인 분석의 일환으로, 비스테로이드성 소염 · 진통제 2종과 스테로이드 의약품 성분 3종에 대해 LC-MS/MS를 이용한 동시분석법을 확립하여 실제 유통 중인 제품에 적용하고자 하였다.
제안 방법
- 다시 이 용액의 1 mL를 10 mL 부피플라스크에 넣고 메탄올로 정용하여 0.22 µm 멤브레인 필터로 여과 후 LCMS/MS 분석을 진행하였다.
- 원심분리기는 Combi-514R Model (Hanil science industrial Co., Incheon, Korea)을 사용하였고, 질량분석기는 API 4000Qtrap (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하였고, LC system은 Agilent 1200 series (Agilent technology, Waldbronn, Germany), 컬럼은 Eclipse plus C18 (2.1 × 150 mm, 3.5 µm, Agilent, USA)을 사용하였다.
- 5 µm, Agilent, USA)을 사용하였다. 표준용액을 positive ion mode로 EP (Entrance Potential), DP (Declustering Potential), CE (Collision Energy), CXP (Collision cell Exit Potential) 등 MS 각각의 파라미터를 최적화한 MRM (Multi Reaction Mode)조건을 확립하고 (Table 2), Ion spray voltage 5500, Temperature 400oC, Ion source gas1 20.0, Ion source gas2 20.0, Curtain gas 20.0으로 Table 1의 HPLC 조건을 이용하여 분석하였고, 재평형시간은 5분을 유지하였다.
- 혼합표준용액을 2~100 ng/mL 수준으로 희석하여 검량선을 작성하였고, 검출한계 및 정량한계는 각각 신호대잡음비 3배 이상, 10배 이상인 농도로 계산하였다. 회수율 측정은 이들 5종 성분이 들어있지 않음을 확인한 공시료에 최종농도가 5.
- 소염 · 진통 의약품 성분인 beclomethasone, dexamethasone, prednisolone, ketoprofen, phenylbutazone 5종에 대한 동시분석을 위해 LC-MS/MS 분석 조건 중 MRM 방식으로 각 성분의 MS 분석 최적조건을 결정하고, 정량이온으로 beclomethasone 409.1/391.0, dexamethasone은 393.1/372.9, prednisolone은 361.0/343.1, ketoprofen은 255.0/209.0, phenylbutazone은 309.1/160.1 을 분석하였다.
대상 데이터
- 아세토니트릴과 메탄올은 Merck사(HPLC Grade, Darmstadt, Germany), 개미산은 LC-MS 분석용으로 Fisher Chemical사(Leicestershire, UK), 인산(HPLC Grade, 85%)은 Fluka Analytical (Buchs, Switzerland)에서 구입하였고, 실험에 사용된 물은 PRIMA & UHQ-MKII water purification (ELGA, High Wycombe, Buckinghamshire, England)을 이용하여 초순수로 정제(18.2 MΩ·cm) 한 후 사용하였다.
- 표준품 ketoprofen (98.0%)은 Wako Chemicals (Osaka, Japan), phenylbutazone과 dexamethasone, prednisolone은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, Mo, USA), beclomethasone은 Steraloids Inc. (RI, USA)에서 구입하여 사용하였다. 아세토니트릴과 메탄올은 Merck사(HPLC Grade, Darmstadt, Germany), 개미산은 LC-MS 분석용으로 Fisher Chemical사(Leicestershire, UK), 인산(HPLC Grade, 85%)은 Fluka Analytical (Buchs, Switzerland)에서 구입하였고, 실험에 사용된 물은 PRIMA & UHQ-MKII water purification (ELGA, High Wycombe, Buckinghamshire, England)을 이용하여 초순수로 정제(18.
- 2 MΩ·cm) 한 후 사용하였다. 분석법 검증에 사용한 공시료는 충남 공주시 소재 업체에서 제조한 것으로, 인터넷 구매 사이트에서 2012년 10월 경 구입한 환형태의 기타가공품이었고, 원료는 홍화씨, 백출, 죽염, 산약, 건강, 찹쌀 등이 혼합된 제품이었다. 실제 유통중인 식품에서 위 5종 성분의 혼입 여부를 모니터링하고자 관절염 등에 소염 및 진통효과가 있다고 기대되는 환형태 및 추출액 형태의 기타가공품 및 추출가공식품 21건, 다류 및 음료류 9건, 건강기능식품 중 개별인정형 제품 9건, 총 39개 제품을 인터넷에서 구매하여 분석하였다.
- 분석법 검증에 사용한 공시료는 충남 공주시 소재 업체에서 제조한 것으로, 인터넷 구매 사이트에서 2012년 10월 경 구입한 환형태의 기타가공품이었고, 원료는 홍화씨, 백출, 죽염, 산약, 건강, 찹쌀 등이 혼합된 제품이었다. 실제 유통중인 식품에서 위 5종 성분의 혼입 여부를 모니터링하고자 관절염 등에 소염 및 진통효과가 있다고 기대되는 환형태 및 추출액 형태의 기타가공품 및 추출가공식품 21건, 다류 및 음료류 9건, 건강기능식품 중 개별인정형 제품 9건, 총 39개 제품을 인터넷에서 구매하여 분석하였다.
- 1. XIC of 5 target compounds. Peak identification: A.
성능/효과
- 혼합표준용액을 2~100 ng/mL 수준으로 희석하여 검량선을 작성하였고, 검출한계 및 정량한계는 각각 신호대잡음비 3배 이상, 10배 이상인 농도로 계산하였다. 회수율 측정은 이들 5종 성분이 들어있지 않음을 확인한 공시료에 최종농도가 5.0 ng/mL, 20.0 ng/mL, 50.0 ng/mL 수준으로 될 수 있도록 첨가한 후 시험용액의 조제 방법에 따라 3회 이상 반복 실험하였고, 분석의 정확성은 3회 반복하여 얻은 회수율의 평균으로써, 재현성은 일내 및 일간 3회 반복 분석하여 얻은 결과의 상대표준편차(%)로써 나타내었다.
- Table 3은 5종 성분 표준용액의 직선성과 검출한계, 정량한계를 나타내고 있다. 약 2-100 ng/mL 범위의 농도에서 모든 성분의 R2 값이 0.999 이상인 훌륭한 직선성을 나타내었고, prednisolone을 제외한 4종 성분의 검출한계가 0.40-0.90 ng/mL, 정량한계는 0.81-2.22 ng/mL 로 낮은 농도까지 정량성을 나타내었다. 이는 Bogusz 등9)의 연구 결과인 ketoprofen, phenylbutazone 각각 검출한계 0.
- 약 5 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 3개 수준의 농도로 표준용액을 공시료에 첨가하여 얻은 회수율 결과를 Table 4에 나타내었다. ketoprofen과 prednisolone을 5 ng/mL 수준으로 첨가한 시료를 제외하고 각 성분 모든 농도에서 80% 이상의 우수한 회수율을 얻을 수 있었다. Piotr 등8)이 보고한 ketoprofen을 15 ng/mL 수준에서 얻은 회수율 93%보다 다소 낮은 수준으로 회수율 84%(20 ng/mL 수준)를 얻었으나(Table 4), 상대표준편차로 비교한 반복 재현성 (RSD, %)은 그들이 얻은 11.
- 위에서 검증한 동시분석법을 이용하여 인터넷에서 구매한 건강기능식품 및 기타식품류 39개 제품에 대해 위 5종 성분의 검출여부를 모니터링 한 결과, 모든 제품에서 검출되지 않았다.
- 1 을 분석하였다. 혼합표준용액을 기울기용매 조건으로 이동상 A(0.1% 개미산), B(0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴)를 이용하여 17분 동안 분석한 결과, prednisolone (tR: 7.34 min), dexamethasone (tR:7.73 min), beclomethasone (tR: 7.82 min), phenylbutazone (tR: 8.31 min), ketoprofen (tR: 9.24 min) 순서로 검출되었다. 5종 성분 모두 약 2-100 ng/mL 농도 수준의 검정곡선에서 R2 값이 0.
- 24 min) 순서로 검출되었다. 5종 성분 모두 약 2-100 ng/mL 농도 수준의 검정곡선에서 R2 값이 0.999 이상의 우수한 직선성을 나타내었고, prednisolone을 제외한 4종 성분의 검출한계는 0.4-0.9 ng/mL, 정량한계는 0.81-2.22 ng/mL 였으며, prednisolone은 그보다 다소 높은 4.60, 11.46 ng/mL 이었다. 환제품의 기타가공품 공시료에 5종 성분 혼합표준용액을 최종농도가 5, 20, 50 ng/mL 이 되도록 직접 첨가하여 분석한 결과, 모든 농도에서 80% 이상의 우수한 회수율을 얻을 수 있었고, 일내 일간 반복 분석의 상대표준편차(%)를 통해 모든 성분에서 비교적 재현성 있는 결과가 나타났다.
- 46 ng/mL 이었다. 환제품의 기타가공품 공시료에 5종 성분 혼합표준용액을 최종농도가 5, 20, 50 ng/mL 이 되도록 직접 첨가하여 분석한 결과, 모든 농도에서 80% 이상의 우수한 회수율을 얻을 수 있었고, 일내 일간 반복 분석의 상대표준편차(%)를 통해 모든 성분에서 비교적 재현성 있는 결과가 나타났다. 실제 인터넷 상에서 유통중인 식품에 이 분석법을 적용한 결과 모든 제품에서 검출되진 않았으나, 소비자들의 건강상 위해를 끼칠 수 있는 이들 성분의 동시분석법을 활용한 지속적인 모니터링이 필요한 실정이다.
후속연구
- LCMS/MS를 이용하여 소염 · 진통에 효과를 나타내는 위 5종 성분의 선택성 및 직선성, 회수율로 측정한 정확성 및 반복 재현성 분석 결과, 효율적인 동시분석법으로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
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