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문제 정의
- 다음으로, CRE의 MPTP로 유도한 파킨슨병 마우스 모델에서 행동에 미치는 영향을 살펴보았다. 먼저, CRE가 파킨슨병과 관련된 운동기능의 이상에 나타내는 효과를 조사하기 위해 rotarod test와 pole test를 실시하였다.
- 따라서, 香附子 물 추출물(CRE)을 이용하여 태아중뇌 도파민 세포에서 1-methyl-4-phenylpyridinium(MPP+) 독성에 대한 세포보호 효과와 NO, TNF-α 분비능을 측정하였고, MPTP 독성을 이용한 마우스 모델에서 행동실험, 면역조직화학과 조직분석을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP)독성에 단회 노출된 경우에도 흑질과 선조체의 미세 아교 세포가 활성화되며12) NO/inducible nitric oxide synthase 이외에도 tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-1beta(IL-1 β), IL-6등의 사이토카인을 생성하여 파킨슨병의 염증매개반응을 활성화하여 신경세포의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다13). 미세 아교 세포의 활성화를 저해하는 기전으로 MPTP 독성에 의한 뇌신경세포사멸에 대해 신경세포 보호효과가 있음이 밝혀졌는데 이는 항염증 작용이 있는 약물이 파킨슨병에 응용 될 수 있음을 시사하는 바이다14,15).
- 본 연구에서는 CRE를 이용하여 태아중뇌 도파민 세포에서 MPP+에 대한 세포 보호 효과를 확인한 후, 보호효과의 기전을 밝히기 위해 태아중뇌 도파민 세포에서 MPP+에 의해 유도된 염증인자인 NO와 TNF-α 생성을 측정하였으며, 동물모델에서 면역조직화학을 통해 흑색질 주변 신경 아교 세포의 활성화에 미치는 영향을 알아보았다.
- 본 연구에서는 香附子의 MPP+/MPTP독성에 대한 도파민 세포의 보호효과와 이의 기전으로 항염증 효과를 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 香附子추출물(CRE)의 태아중뇌 도파민 세포 및 동물 모델에서 MPP+/MPTP 신경독성에 대한 도파민 세포 보호 효과 및 신경염증 억제 효과에 대한 연구를 수행하였고 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 본 연구에서는, 한의학적 이론과 기전 연구결과를 바탕으로 香附子가 세포 모델과 동물 모델에서 항 파킨슨 효능을 갖는지를 확인하고 그의 기전을 연구하고자 하였다. 따라서, 香附子 물 추출물(CRE)을 이용하여 태아중뇌 도파민 세포에서 1-methyl-4-phenylpyridinium(MPP+) 독성에 대한 세포보호 효과와 NO, TNF-α 분비능을 측정하였고, MPTP 독성을 이용한 마우스 모델에서 행동실험, 면역조직화학과 조직분석을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 쥐는 5 마리씩 4 군으로 나누었다. 1 주일 적응시킨 후, 제1군(대조군) 및 제2군(MPTP군)은 식염수를 쥐 체중 kg당 5 mL로 5 일간 1 일 1 회 경구 투여하였다. 제3군(Ropinirol 1 mg/kg 투여군)은 식염수에 용해시킨 Ropinirol을 1 mg/kg으로, 제4군(CRE 50 mg/kg 투여군)은 식염수에 용해시킨 CRE를 50 mg/kg으로 5 일간 1 일 1 회 경구투여하였다.
- 고정한 태아중뇌 도파민 세포와 뇌 조직의 선조체 및 흑질 부분을 골라 PBS로 3 회 세척한 후 내인성 peroxidase를 제거하기 위하여 과산화수소로 처리하여, 1차 항체 rabbit anti-TH(1:2000 dilution), rat anti-Mac-1(1:1000 dilution),또는 rabbit anti-GFAP(1:1000 dilution)을 하룻밤 반응시켰다. 2차 항체 biotinylated anti-rabbit 또는 anti-rat(1:200dilution)을 사용하고, ABC 반응을 거쳐 DAB를 이용하여 3분간 발색시켰다. 각 과정 사이에 PBS로 3 회 세척을 행하였다.
- CRE가 파킨슨병과 관련된 운동기능의 이상에 나타내는 효과를 조사하기 위해 rotarod test를 실시하였다. 5 일간의 투여 종료 다음 날 및 셋 째 날, 직경 3 cm, 4 rpm 회전 전 봉위에 올려놓고 20 rpm 까지 속도를 조절하여 연습시킨 3시간 후, 25 rpm에서 본 실험을 시행하였으며 이때 낙하 시간을 측정하였다. 연습은 회당 300 초의 제한 시간을 두고 5분 간격으로 2 회 시행하였고, 본 실험은 3 회 실행하여 평균값을 사용하였다.
- CRE가 파킨슨병과 관련된 운동기능의 이상에 나타내는 효과를 조사하기 위해 Pole test를 실시하였다. 5 일간의 투여종료 다음날 및 셋 째 날, 높이 55 cm, 지름 8 mm의 막대에서 pole test를19) 수행하였다. 막대 위에 C57bl/6 쥐를 머리가 위로 향하게 놓고, 쥐가 꼭대기를 180° 돌아서 쥐의 머리가 완전히 아래로 내려오는 시간을 'time to turn', 쥐가 꼭대기를 180° 돌아서 내려와 네 다리가 땅에 닿을 때까지 걸리는 시간을 'time for locomotion activity'(Time for LA)로표기하였다.
- 제3군(Ropinirol 1 mg/kg 투여군)은 식염수에 용해시킨 Ropinirol을 1 mg/kg으로, 제4군(CRE 50 mg/kg 투여군)은 식염수에 용해시킨 CRE를 50 mg/kg으로 5 일간 1 일 1 회 경구투여하였다. 5 일째 되는 날 acute 모델로 제1군은 생리식염수를 쥐 체중 kg당 5 mL로 2 시간 간격으로 4 회 복강 내 투여하였으며, 제2군, 제3군, 제4군은 MPTP를 20 mg/kg 체중의 농도로 생리식염수에 용해시켜 쥐 체중 kg당 5 mL로 2 시간 간격으로 4 회 복강 내 투여하였다19). 투여가 완료된 각 군의 쥐를 치사시킨 후, 도파민 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 뇌 조직을 분리하였다.
- CRE가 C57bl/6 파킨슨병 모델의 도파민 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MPTP로 유도한 파킨슨병 모델 쥐의 뇌를 적출하여 조직분석을 하였다. 도파민 세포 보호효과는 흑질 치밀부에서 TH 양성 세포 숫자를 세고, 선조체에서 광학밀도를 측정하여 확인하였다.
- CRE가 MPTP로 유발된 운동 완화에 미치는 영향과 더불어, 흑질-선조체의 도파민 세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여 조직학적 분석을 시행하였다. 흑질에서 투사되는 도파민성 신경말단이 분포하는 선조체는 근육의 긴장을 조절하여 운동을 원활하게 하는데 관여하는데, 파킨슨병의 운동장애인 안정시의 진전, 서동, 근경직의 증가 등은 흑질의 도파민 세포의 소실로 인한 선조체의 도파민 결핍으로 인해 일어나는 것으로 알려져 있다19).
- CRE가 파킨슨병 동물 모델의 도파민 세포가 밀집되어 있는 흑색질 주변 신경 아교 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 조직분석을 하였다. MPTP 투여군에서 성상교세포(astrocyte) 및 미세 아교 세포(microglia)가 가지를 내뿜으며 응축되는 형태로 활성화 된 것을 확인할 수 있었으며, CRE 투여에 의해 신경 아교 세포 활성화가 억제된 것을 확인하였다(Fig.
- CRE가 파킨슨병과 관련된 운동기능의 이상에 나타내는 효과를 조사하기 위해 Pole test를 실시하였다. 5 일간의 투여종료 다음날 및 셋 째 날, 높이 55 cm, 지름 8 mm의 막대에서 pole test를19) 수행하였다.
- CRE가 파킨슨병과 관련된 운동기능의 이상에 나타내는 효과를 조사하기 위해 rotarod test를 실시하였다. 5 일간의 투여 종료 다음 날 및 셋 째 날, 직경 3 cm, 4 rpm 회전 전 봉위에 올려놓고 20 rpm 까지 속도를 조절하여 연습시킨 3시간 후, 25 rpm에서 본 실험을 시행하였으며 이때 낙하 시간을 측정하였다.
- CRE의 MPTP 신경독성 유발 파킨슨병 동물 모델에 미치는 영향을 알아보기 위하여 rotarod test와 pole test를 이용한 행동실험을 실시하였다. 행동 장애 개선 효능을 비교하기 위하여 ropinirol을 양성대조군으로 투약하여 실시하였다19).
- Mice were treated with CRE 50 mg/kg for 5 days and with MPTP (four intraperitoneally injections of 20 mg/kg 2 h interval times) on the last day. First day (A and B) and third day (C and D) of the last MPTP injection, we conducted the pole test. The time to turn completely down ward (A and C; time to turn) and to arrive at the floor (B and D; time for LA) were recorded.
- Mice were treated with CRE 50 mg/kg for 5 days and with MPTP (four intraperitoneally injections of 20 mg/kg 2 h interval times) on the last day. First day (A) and third day (B) of the last MPTP injection, we conducted the rotarod test. The latency time to fall off was recorded.
- NO의 농도는 배양액 내의 NO 농도를 griess reagent를 이용하여 측정하였다. 태아중뇌 도파민 세포에 위에 기술한 바와 같이 CRE와 독성 처리 후 배양액인 상징액을 회수하여 상징액 100 μL에 griess reagent 100 μL를 반응 시켜 spectrophotometer(Versamax microplatereader; Molecular Device, Sunnyvale, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 태아중뇌 도파민 세포에 위에 기술한 바와 같이 CRE와 독성 처리 후 배양액인 상징액을 회수하여 상징액 100 μL에 griess reagent 100 μL를 반응 시켜 spectrophotometer(Versamax microplatereader; Molecular Device, Sunnyvale, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite를 이용해 표준곡선을 그려 NO 농도를 결정하였다.
- 막대 위에 C57bl/6 쥐를 머리가 위로 향하게 놓고, 쥐가 꼭대기를 180° 돌아서 쥐의 머리가 완전히 아래로 내려오는 시간을 'time to turn', 쥐가 꼭대기를 180° 돌아서 내려와 네 다리가 땅에 닿을 때까지 걸리는 시간을 'time for locomotion activity'(Time for LA)로표기하였다. 각 실험은 30 초의 제한시간을 두고 시행하였으며, 각 쥐를 3 회씩 연습시킨 후 5 회 본 실험을 행하였다.
- 고정한 태아중뇌 도파민 세포와 뇌 조직의 선조체 및 흑질 부분을 골라 PBS로 3 회 세척한 후 내인성 peroxidase를 제거하기 위하여 과산화수소로 처리하여, 1차 항체 rabbit anti-TH(1:2000 dilution), rat anti-Mac-1(1:1000 dilution),또는 rabbit anti-GFAP(1:1000 dilution)을 하룻밤 반응시켰다. 2차 항체 biotinylated anti-rabbit 또는 anti-rat(1:200dilution)을 사용하고, ABC 반응을 거쳐 DAB를 이용하여 3분간 발색시켰다.
- 관류를 한 쥐의 뇌를 적출하여 4 % PFA에 하루 보관하여 고정시킨 후, 동결 시 생기는 조직의 손상을 막기 위해 4 ℃의 30 % sucrose에 하루 동안 두어, 뇌 조직을 cryostat(CM3000; Leica, Wetzlar, Germany)로 30 μm 동결박편 후, 4 ℃ storing solution에 보관하였다.
- CRE가 C57bl/6 파킨슨병 모델의 도파민 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MPTP로 유도한 파킨슨병 모델 쥐의 뇌를 적출하여 조직분석을 하였다. 도파민 세포 보호효과는 흑질 치밀부에서 TH 양성 세포 숫자를 세고, 선조체에서 광학밀도를 측정하여 확인하였다. CRE를 투여한 경우 흑질 치밀부에서 TH 양성세포 수가 대조군 대비 71.
- 이미지는 optical light microscope를 이용해 촬영하였다. 또한 뇌 조직의 흑질부에서 Mac-1과 GFAP의 양성반응 정도를 관찰하였다.
- 막대 위에 C57bl/6 쥐를 머리가 위로 향하게 놓고, 쥐가 꼭대기를 180° 돌아서 쥐의 머리가 완전히 아래로 내려오는 시간을 'time to turn', 쥐가 꼭대기를 180° 돌아서 내려와 네 다리가 땅에 닿을 때까지 걸리는 시간을 'time for locomotion activity'(Time for LA)로표기하였다.
- 다음으로, CRE의 MPTP로 유도한 파킨슨병 마우스 모델에서 행동에 미치는 영향을 살펴보았다. 먼저, CRE가 파킨슨병과 관련된 운동기능의 이상에 나타내는 효과를 조사하기 위해 rotarod test와 pole test를 실시하였다. Rotarod test는 회전속도를 견디는 시간을 측정해 운동 기능 감퇴 정도를 판단하는 행동실험으로 알려져 있다19).
- 0 μg/mL으로 1 시간 처리한 후 MPP+ 10 μM을 처리하여 23시간을 더 배양하였다. 면역조직화학을 위하여 커버슬라이드에 있는 세포를 4 % PFA로 30 분 고정하였다.
- 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도(22 ± 2 ℃), 습도(53 ± 3 %) 및 명암주기(12 시간)는 자동적으로 조절되도록 하였다.
- MPTP의 대사체인 MPP+는 도파민 세포의 미토콘드리아의 complex Ⅰ을 억제하고, mitochondrial permeability transition의 세공을 열어, 미토콘드리아 막전위의 붕괴와 더불어 세포내 caspase의 활성화를 유도함으로써 신경세포의 자가사멸을 일으킨다21). 본 실험에서 태아중뇌 도파민 세포에서 香附子의 MPP+에 대한 보호 효과를 알아보기 위해 TH로 면역조직화학을 한 후 도파민 세포 수를 세었다. 도파민은 주로 중뇌의 흑질에서 합성되며, TH는 L-tyrosine을 L-DOPA로 전환하는 도파민 생성의 처음에 작용하는 속도제한효소(rate-limiting enzyme)로도파민 세포와 도파민의 간접적 측정 척도로 사용된다22).
- 뇌 조직의 흑질부는 TH 양성세포수를 100 배율에서 세어서 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 선조체는 40 배율에서 ImageJ software(Bethesda,MD, USA)를 사용하여 광학밀도(optical density)를 측정하였으며, background를 제외한 결과 값을 사용하였다. 이미지는 optical light microscope를 이용해 촬영하였다.
- 5 일간의 투여 종료 다음 날 및 셋 째 날, 직경 3 cm, 4 rpm 회전 전 봉위에 올려놓고 20 rpm 까지 속도를 조절하여 연습시킨 3시간 후, 25 rpm에서 본 실험을 시행하였으며 이때 낙하 시간을 측정하였다. 연습은 회당 300 초의 제한 시간을 두고 5분 간격으로 2 회 시행하였고, 본 실험은 3 회 실행하여 평균값을 사용하였다.
- 염색을 시행한 태아중뇌 도파민 세포는 optical light microscope(Olympus Microscope System BX51; Olympus,Tokyo, Japan)를 사용하여 CRE의 세포에 대한 영향을 관찰하였다. TH 양성 세포를 100 배율에서 세어서 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
- 선조체는 40 배율에서 ImageJ software(Bethesda,MD, USA)를 사용하여 광학밀도(optical density)를 측정하였으며, background를 제외한 결과 값을 사용하였다. 이미지는 optical light microscope를 이용해 촬영하였다. 또한 뇌 조직의 흑질부에서 Mac-1과 GFAP의 양성반응 정도를 관찰하였다.
- 26mg/g으로 표준화 하였다18). 잡질을 제거한 후 10배의 증류수를 가하여 2시간 동안 환류추출한 후 감압여과(Whatman No. 2)하였다. 여과액을 -60 ℃ 이하에서 얼려 동결건조 하였고(FDU-550R; Eyela Co, Japan), 동결건조 후의 수득율은 9.
- 1 주일 적응시킨 후, 제1군(대조군) 및 제2군(MPTP군)은 식염수를 쥐 체중 kg당 5 mL로 5 일간 1 일 1 회 경구 투여하였다. 제3군(Ropinirol 1 mg/kg 투여군)은 식염수에 용해시킨 Ropinirol을 1 mg/kg으로, 제4군(CRE 50 mg/kg 투여군)은 식염수에 용해시킨 CRE를 50 mg/kg으로 5 일간 1 일 1 회 경구투여하였다. 5 일째 되는 날 acute 모델로 제1군은 생리식염수를 쥐 체중 kg당 5 mL로 2 시간 간격으로 4 회 복강 내 투여하였으며, 제2군, 제3군, 제4군은 MPTP를 20 mg/kg 체중의 농도로 생리식염수에 용해시켜 쥐 체중 kg당 5 mL로 2 시간 간격으로 4 회 복강 내 투여하였다19).
- 태아중뇌 도파민 세포에 위에 기술한 바와 같이 CRE과 독성을 처리하여 MPP+에 의해 유도되는 NO와 TNF-α의 생성량을 측정하였다.
- 태아중뇌 도파민 세포에 위에 기술한 바와 같이 CRE와 독성 처리 후 배양액인 상징액을 회수하여 TNF-α ELISAkit를 이용하여 매뉴얼에 따라 TNF-α의 양을 측정하였다.
- 태아중뇌 도파민 세포에 위에 기술한 바와 같이 CRE와 독성 처리 후 배양액인 상징액을 회수하여 상징액 100 μL에 griess reagent 100 μL를 반응 시켜 spectrophotometer(Versamax microplatereader; Molecular Device, Sunnyvale, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Sprague-Dawley rat 14 일 태아는 Orient Bio(Osan,Korea)에서 구입하였다. 태아중뇌 조직을 얼음 위에서 박리하여 10 % FBS를 포함한 MEM에 모은 후, 파이펫을 이용하여 기계적으로 dissociation하였다. PLL로 미리 코팅한 커버 슬라이드에 1.
- 5 일째 되는 날 acute 모델로 제1군은 생리식염수를 쥐 체중 kg당 5 mL로 2 시간 간격으로 4 회 복강 내 투여하였으며, 제2군, 제3군, 제4군은 MPTP를 20 mg/kg 체중의 농도로 생리식염수에 용해시켜 쥐 체중 kg당 5 mL로 2 시간 간격으로 4 회 복강 내 투여하였다19). 투여가 완료된 각 군의 쥐를 치사시킨 후, 도파민 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 뇌 조직을 분리하였다. 관류를 한 쥐의 뇌를 적출하여 4 % PFA에 하루 보관하여 고정시킨 후, 동결 시 생기는 조직의 손상을 막기 위해 4 ℃의 30 % sucrose에 하루 동안 두어, 뇌 조직을 cryostat(CM3000; Leica, Wetzlar, Germany)로 30 μm 동결박편 후, 4 ℃ storing solution에 보관하였다.
- CRE의 MPTP 신경독성 유발 파킨슨병 동물 모델에 미치는 영향을 알아보기 위하여 rotarod test와 pole test를 이용한 행동실험을 실시하였다. 행동 장애 개선 효능을 비교하기 위하여 ropinirol을 양성대조군으로 투약하여 실시하였다19). Rotarod test 결과 독성 투여 첫 날 대조군은 91.
대상 데이터
- Minimum essential medium(MEM)은 Gibco Industries Inc.(Auckland, NZ)에서 구입하였고, fetal bovine serum(FBS)은 Hyclone(Auckland, New Zealnad)에서 구입하여 사용하였다. Glutamine, glucose, MPP+, poly-L-Lysine(PLL), paraformaldehyde(PFA), glycerin, MPTP, 3,3-diaminobenzidine(DAB), phosphate buffer(PB), phosphate buffered saline(PBS), ethylene glycol, Triton X-100, dimethyl sulfoxide(DMSO), phosphoric acid, naphthylethylene diamide, sulfanilamide, sodium nitrite 등은 Sigma-Aldrich(St.
- C57bl/6 쥐 8 주령은 Orient Bio에서 구입하였다. 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도(22 ± 2 ℃), 습도(53 ± 3 %) 및 명암주기(12 시간)는 자동적으로 조절되도록 하였다.
- (Auckland, NZ)에서 구입하였고, fetal bovine serum(FBS)은 Hyclone(Auckland, New Zealnad)에서 구입하여 사용하였다. Glutamine, glucose, MPP+, poly-L-Lysine(PLL), paraformaldehyde(PFA), glycerin, MPTP, 3,3-diaminobenzidine(DAB), phosphate buffer(PB), phosphate buffered saline(PBS), ethylene glycol, Triton X-100, dimethyl sulfoxide(DMSO), phosphoric acid, naphthylethylene diamide, sulfanilamide, sodium nitrite 등은 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)에서 구입하였다. Biotinylated anti-rabbit antibody, ABC standard kit 등은 Vector(Burlingame, USA)에서 구입하였고, rat TNF-α kit는 invitrogen(Carlsbad, USA)에서 구입하였고, tyrosine hydroxylase(TH)-rabbit in goat primary antibody, macrophage-1 antigen integrin alpha M(Mac-1)-rat in goat primary antibody, glial fibrillary acidic protein(GFAP)-rabbit in goat primary antibody는 Merck Millipore(Billerica, USA)에서 구입하였다.
- Sprague-Dawley rat 14 일 태아는 Orient Bio(Osan,Korea)에서 구입하였다. 태아중뇌 조직을 얼음 위에서 박리하여 10 % FBS를 포함한 MEM에 모은 후, 파이펫을 이용하여 기계적으로 dissociation하였다.
- 본 실험에서 사용한 香附子(Cyperi Rhizoma)는 정도약업사(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 香附子는 gas chromatography/mass spectrometry를 이용하여 cyperene0.
데이터처리
- 모든 측정값은 mean ± SEM으로 표시하였다. 본 연구의통계처리는 Graphpad Prism 5.0(SAn Die해, CA) 프로그램을 사용하였으며, one-way ANOVA를 이용하였고, 사후검정은 Tukey test를 이용하여 평균값의 유의성을 5 % 미만의 한계로 조사하였다.
- 30 분간 암소에서 방치한 후 Stop Solution을100 μL씩 분주한 다음 450 nm에서 spectrophotometer로 흡광도를 측정하였다. 측정값은 4-parameter algorithm로계산하였다. 4-parameter algorithm은 일반적으로 용량-반응 곡선 같은 생물 검정의 곡선 피팅 분석에 사용된다.
성능/효과
- 1. CRE는 태아중뇌 배양 세포 모델에서 MPP+ 신경독성에 의한 도파민 세포 손상으로부터 보호 효과를 보였다. 또한 CRE 투여는 동물 모델에서 MPTP 신경독성에 의한 흑질과 선조체의 도파민 세포 수와 신경 말단 손상을 보호하였다.
- 2. CRE 투여는 동물모델에서 MPTP로 유도한 파킨슨병 유사 행동장애를 회복시켰으며, 이는 양성대조군인 ropinirol과동등 또는 이상의 효능을 나타내었다.
- 3. CRE는 MPP+로 유도된 염증성 인자인 NO와 TNF-α 생성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 흑질 부위의MPTP로 유도된 신경아교증(gliosis)을 억제한 것이 관찰되었다.
- CRE 전처리에 의해 NO의과생성이 0.2, 1.0 μg/mL 농도에서 유의성 있게 억제되었고, TNF-α의 과생성이 1.0 μg/mL 농도에서 유의성 있게 억제되었으며, 흑색질의 신경 아교 세포 활성화가 억제되는 것을 통해 CRE가 MPP+/MPTP 독성으로 유도한 신경염증반응을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
- 14 %로 증가함으로써 서동이 야기됨을 알 수 있었다(Fig 3). CRE를 50 mg/kg 투여한 경우 통계적으로 유의한 행동장애 개선 효과를 보였으며 이는 양성대조군 보다 뛰어난 서동 회복 효과임을 확인할 수 있었다(Fig 3).
- CRE를 투여한 경우 흑질 치밀부에서 TH 양성세포 수가 대조군 대비 71.10 ± 1.08 %로, MPTP 투여로 인해 36.74 ± 4.94 %로 감소한 TH 양성 세포 수를 유의적으로 증가시켜 도파민 세포의 보호활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- CRE의 MPP+ 신경독성에 대한 도파민 세포 보호 효과를 측정한 결과 MPP+군은 도파민 세포 수가 대조군 대비하여 66.20 ± 1.41 %을 나타내어 도파민 세포의 수를 유의하게 감소시켰고(p < 0.001), CRE과 MPP+를 함께 처리한 결과 MPP+의 세포독성에 대하여 CRE 0.2, 1.0 μg/mL농도에서 대조군 대비하여 각각 78.87 ± 3.92 %, 85.90 ± 0.92 %으로 통계적으로 유의하게 도파민 세포를 증가시켰다(Fig. 1).
- MPP+에 의하여 NO의 생성이 대조군 대비 248 ± 13.38으로 증가하였으며 (*** p < 0.001), CRE 전처리에 의해 0.2, 1.0 μg/mL 농도에서 NO의 과생성이 대조군 대비 각각 206.78 ± 7.59 %, 173.67 ± 6.36 %로유의하게 억제되었다(Fig. 5A).
- MPP+에 의하여 TNF-α의 생성이 대조군에 비해 246.69 ± 24.72 %로 증가하였으며,CRE 전 처리에 의해 TNF-α의 과생성이 농도 의존적으로 감소하였으며, 1.0 μg/mL 농도에서 120.53 ± 19.45 %로유의하게 억제되었다(Fig. 5B).
- CRE가 파킨슨병 동물 모델의 도파민 세포가 밀집되어 있는 흑색질 주변 신경 아교 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 조직분석을 하였다. MPTP 투여군에서 성상교세포(astrocyte) 및 미세 아교 세포(microglia)가 가지를 내뿜으며 응축되는 형태로 활성화 된 것을 확인할 수 있었으며, CRE 투여에 의해 신경 아교 세포 활성화가 억제된 것을 확인하였다(Fig. 6).
- 또한, Pole test는 앞발의 정교한 근육조절 기능을 조사할 수 있으며, 흑질-선조체 도파민성 신경계의 이상 여부를 가장 민감하게 알 수 있는 행동실험으로 알려져 있다23). MPTP 투여군에서 총 운동거리(movement distance)의 감소 및 time to turn과 time forLA의 증가를 확인함으로서 서동이 야기됨을 알 수 있었으며,CRE을 50 mg/kg 투여한 경우 MPTP 투여군에 비해 서동을 회복시킴을 확인할 수 있었다.
- 흑질에서 투사되는 도파민성 신경말단이 분포하는 선조체는 근육의 긴장을 조절하여 운동을 원활하게 하는데 관여하는데, 파킨슨병의 운동장애인 안정시의 진전, 서동, 근경직의 증가 등은 흑질의 도파민 세포의 소실로 인한 선조체의 도파민 결핍으로 인해 일어나는 것으로 알려져 있다19). TH 항체를 이용하여 면역조직화학과조직분석 결과, CRE의 투여가 흑질에서 MPTP 투여로 인해 감소한 TH 양성 도파민 세포의 손상을 억제해 주었을 뿐만 아니라 선조체의 신경세포 손상을 줄여 주는 것을 확인하였다. 이로 인해 CRE가 흑질의 도파민 세포의 보호활성을 통해 흑질-선조체 도파민성 신경계의 손상을 효과적으로 보호함으로서 C57bl/6 파킨슨병 모델의 행동실험에서 서동을 회복시킴을 확인할 수 있었다.
- 독성투여 셋 째 날은 대조군 144.4 ± 20.13 초, MPTP군 69.21± 14.09 초로 신경독성에 의한 행동장애가 일어난 것을 확인하였다.
- CRE는 태아중뇌 배양 세포 모델에서 MPP+ 신경독성에 의한 도파민 세포 손상으로부터 보호 효과를 보였다. 또한 CRE 투여는 동물 모델에서 MPTP 신경독성에 의한 흑질과 선조체의 도파민 세포 수와 신경 말단 손상을 보호하였다.
- 77 초를 보이며, 양성대조군과 동등 또는 이상의 효능을 나타내었다(Fig 2). 또한, pole test 결과 MPTP군은 time to turn과 time for LA의 대조군 대비 독성투여 첫 날 278.61 %, 177.55%로 독성투여 셋 째 날 219.61 %, 206.14 %로 증가함으로써 서동이 야기됨을 알 수 있었다(Fig 3). CRE를 50 mg/kg 투여한 경우 통계적으로 유의한 행동장애 개선 효과를 보였으며 이는 양성대조군 보다 뛰어난 서동 회복 효과임을 확인할 수 있었다(Fig 3).
- 또한, 선조체에서 CRE 투여군의 광학밀도가 대조군 대비 66.78 ± 1.32 %로서,MPTP 투여군 41.45 ± 3.05 %에 비해 유의적으로 도파민 세포의 보호활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 4). 이 결과로서 CRE가 흑질 치밀부 및 선조체에서 우수한 도파민 세포의 보호활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- TH 항체를 이용하여 면역조직화학과조직분석 결과, CRE의 투여가 흑질에서 MPTP 투여로 인해 감소한 TH 양성 도파민 세포의 손상을 억제해 주었을 뿐만 아니라 선조체의 신경세포 손상을 줄여 주는 것을 확인하였다. 이로 인해 CRE가 흑질의 도파민 세포의 보호활성을 통해 흑질-선조체 도파민성 신경계의 손상을 효과적으로 보호함으로서 C57bl/6 파킨슨병 모델의 행동실험에서 서동을 회복시킴을 확인할 수 있었다.
- 이상으로 본 실험을 통해 香附子가 태아중뇌 도파민 세포에서 MPP+ 독성에 대한 보호 효과를 보였으며, 동물 실험에서 MPTP 독성에 대한 흑질-선조체 도파민성 신경계의 보호를 통해 파킨슨병 마우스 모델의 행동실험에서 서동을 회복시킴을 확인하였다. 이는 NO와 TNF-α 생성 억제에 따른 항염증 작용으로 보인다.
- 이상의 결과에서 香附子는 MPP+/MPTP 신경독성에 의한 항염증 효과로 인해 파킨슨병의 주요 병태생리인 흑질의 도파민 세포의 손상으로부터 신경세포를 보호함으로 서동 등의 운동장애를 억제하는 효과가 있음을 확인하였으며, 파킨슨병을 포함한 염증성 퇴행성 뇌질환의 치료약물소재로 이용될 수 있는 가능성을 시사하였다.
- 태아중뇌 도파민 세포에서 MPP+로 유도한 독성에 대해 CRE를 처리한 군은 0.2, 1.0 μg/mL농도에서 MPP+군에 대비하여 도파민 세포수를 통계적으로 유의하게 증가시킴으로 도파민 세포에 대한 보호효과를 확인하였다.
후속연구
- 이는 NO와 TNF-α 생성 억제에 따른 항염증 작용으로 보인다. 본 연구 결과들을 통해서 香附子가 항염증효과로 기인한 도파민 세포의 보호효과로 인해 파킨슨병 등의 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료 약물 후보가 될 수 있을 것으로 기대된다.
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