[논문]Salmonella spp. 특이적인 검출을 위한 SYBR Green real-time PCR 기법 적용

신승원; 차승빈; 이원정; 신민경; 정명환; 유안나; 정병열; 유한상

doi:10.14405/kjvr.2013.53.1.025

Salmonella spp. 특이적인 검출을 위한 SYBR Green real-time PCR 기법 적용
Application of SYBR Green real-time PCR assay for the specific detection of Salmonella spp. 원문보기

大韓獸醫學會誌 = Korean journal of veterinary research, v.53 no.1 = no.150, 2013년, pp.25 - 28

신승원 (서울대학교 수의과대학 및 BK21 수의과학인력양성 사업단) , 차승빈 (서울대학교 수의과대학 및 BK21 수의과학인력양성 사업단) , 이원정 (서울대학교 수의과대학 및 BK21 수의과학인력양성 사업단) , 신민경 (서울대학교 수의과대학 및 BK21 수의과학인력양성 사업단) , 정명환 (서울대학교 수의과대학 및 BK21 수의과학인력양성 사업단) , 유안나 (서울대학교 수의과대학 및 BK21 수의과학인력양성 사업단) , 정병열 (농림수산검역검사본부 동식물위생연구부 세균질병과) , 유한상 (서울대학교 수의과대학 및 BK21 수의과학인력양성 사업단)

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was to applicate and evaluate a SYBR Green real-time PCR for the specific detection of Salmonella spp. Specificity of the PCR method was confirmed with 48 Salmonella spp. and 5 non-Salmonella strains using invA gene primer. The average threshold cycle ($C_T$) of Salmonella spp. was $11.83{\pm}0.78$ while non-Salmonella spp. was $30.86{\pm}1.19$. Correlation coefficients of standard curves constructed using $C_T$ versus copy number of Salmonella Enteritidis ATCC 13076 showed good linearity ($R^2=0.993$; slope = 3.563). Minimum level of detection with the method was > $10^2$ colony forming units (CFU)/mL. These results suggested that the SYBR Green real-time PCR might be applicable for the specific detection of Salmonella spp. isolates.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이번 연구의 목적은 SYBR Green을 이용한 real-time PCR 기법으로 국내에서 분리된 Salmonella spp.들에서의 적용을 통한, 간단하고 신속한 Salmonella 균 검출을 위한 기법을 개발하고자 하였다.
이번 연구의 목적은 SYBR Green을 이용한 real-time PCR 기법으로 국내에서 분리된 Salmonella spp.

제안 방법

PCR mixture는 2X QuantiTect SYBR Green PCR master mix(QuantiTect SYBR Green PCR buffer, HotStarTaq DNA polymerase, dNTP mix, SYBR Green I dye, passive reference dye ROX) 12.5 µL, primer 각각 1 µM씩, DNA template 1 µL으로 총 25 µL을 반응시켰다.
Real-time PCR amplification condition: 모든 real-time PCR은 ABI 7300 system(Applied Biosystems, USA)을 이용하였다.
Real-time PCR assay에 사용된 dye 및 primer: 본 실험에서는 QuantiTect SYBR green PCR Kit(Qiagen, Korea)를 사용하여 real-time PCR을 진행하였다. 또한 Salmonella spp.
Real-time PCR를 이용해 동정 가능한 최소 균수 측정: 먼저 S. Enteritidis ATCC 13076을 이용하여 real-time PCR assay로 동정 가능한 최소 균수를 측정하고자 하였다. S.
S. Enteritidis ATCC 13076를 positive control로 사용하여 세균의 희석 단계별(100부터 109) 평균 CT 값과 CFU 값을 이용하여 표준곡선을 작성하였다. 평균 CT 값과 CFU의 대수값 사이에는 반비례관계가 성립되었으며, 상관계수는 0.
각 희석단계의 CFU값과 평균 CT 값을 이용하여 표준곡선을 작성하였다. 평균 CT 값과 CFU의 대수값 사이에는 반비례관계가 형성되었으며, 상관계수는 0.
구해진 CFU값을 기준으로 앞서 추출한 genomic DNA를 100부터 109까지 단계 희석하여 real-time PCR assay을 실행한 후, 각 희석 단계의 CFU값과 threshold cycle(CT)값으로 standard curve를 작성하여 동정 가능한 최소 균수를 구하였다.
내에 보존적으로 존재하는 invA 유전자에 특이적인 primer를 제작하여 real-time PCR을 실시하였다.
배양된 균주로부터 genomic DNA를 추출하기 위해 GenElute Bacterial Genomic DNA Kit(Sigma-Aldrich, USA)를 이용하였으며, 추출방법은 제조사의 매뉴얼에 따라 실행하였다.
실험에 사용된 모든 균주들은 Bacteriological Analytical Manual(BAM)에 기초한 생화학적 테스트와 Vitek2 system(Biomerieux, France)을 통해 다시 동정하여 확인하였다.
에 대해 real-time PCR assay를 실행하여 각 군의 평균 CT값 및 melting temperature(Tm)을 구하고 두 실험군 간의 차이를 비교하였다.

대상 데이터

농림수산검역검사본부로부터 제공받은 균주 및 본 연구실에서 분리동정하여 보관 중인 균주를 이용하였다.
실험에 사용된 균주는 총 48주의 Salmonella spp.와 이에 대한 음성대조군으로서 5주의 non-Salmonella spp.

데이터처리

평균 CT값은 Student’s t-test를 실시하여 p < 0.05 일 경우 유의적 차이가 있다고 판단하였다.

이론/모형

배양된 균수를 바탕으로 standard plate count법을 이용하여 colony forming unit(CFU) 값을 구하였다.

성능/효과

특히 SYBR Green과 같은 dye의 사용으로 까다로운 제약 없이 실시간으로 목적 유전자의 유무를 확인할 수 있게 되었다.
각 희석단계의 CFU값과 평균 CT 값을 이용하여 표준곡선을 작성하였다. 평균 CT 값과 CFU의 대수값 사이에는 반비례관계가 형성되었으며, 상관계수는 0.993(slope = 3.5631)으로 나타났다. 이 표준곡선을 바탕으로 Salmonella spp.
평균 CT 값과 CFU의 대수값 사이에는 반비례관계가 성립되었으며, 상관계수는 0.993(slope = 3.5631)로 나왔다.

후속연구

본 연구 결과를 바탕으로 판단하였을 때, real-time PCR을 이용하여 오염된 식육이나 동물의 분변과 같은 살모넬라증 감염원인체에서 적은 양으로도 빠른 시간 내에 오염 여부를 판단할 수 있을 것이다.
이를 바탕으로 간편하고, 신속하고 살모넬라증 원인체 진단에 기여할 수 있을 것이다.
특히 invA gene을 대상으로 한 이전의 real-time PCR 연구들에 비해 낮은 CT 값을 나타내어 보다 적은 양의 template DNA에서도 검출이 가능하며, 또한 검출시간을 단축시킬 수 있을 것으로 판단된다 [21, 27].

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Real-time PCR 기법의 특징은?	이러한 동정 기법들 중 하나가 바로 real-time PCR 기법이다. Real-time PCR 기법은 기존의 conventional PCR에 비해 높은 민감도와 특이도를 가지며, amplicon의 크기를 줄일 수 있으며, PCR 이후의 과정이 필요 없어 PCR product의 오염을 방지할 수 있다 [15, 27].
	Salmonella 균 검출기법의 단점은?	TaqMan 탐침 기반의 real-time PCR을 이용한 Salmonella 균 검출기법들이 여러 차례 소개되었다 [4, 9, 16, 19, 23, 27]. 그러나 이들 검출 기법은 primer와 형광탐침 간의 결합력에 크게 영향을 받는 등 실험조건이 까다로워 쉽게 적용하지 못하는 단점이 있었다 [21]. SYBR Green의 사용은 이러한 한계를 극복하여 형광탐침을 사용하지 않고도 real-time PCR이 가능하게 되었다 [1].
	Salmonella 균은 어떤 위험성을 지니고 있나?	Salmonella 균은 종종 사람에서 식중독과 같은 위장관 질병뿐만 아니라, 장티푸스(typhoid fever)와 같은 급성 전신감염 질환을 유발하는 위험성을 지니고 있다 [8, 22, 24]. 이러한 Salmonella는 대부분 축산 현장에서 감염된 동물들의 도축·가공되는 과정에서 Salmonella 균이 식육 및 축산가공품에 잔재하여 발생한다 [7, 13].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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