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문제 정의
- 본 연구는 사람에 위암 및 위궤양을 유발하여 심각한 임상결과를 초래하는 H. pylori에 herb추출물로부터 효과적인 천연물 유래 항균물질을 개발하고 천연물 유래 H. pylori 항균물질의 개발로 효과적인 치료 및 예방을 위한 신약개발의 기초자료를 제공하고자 계획되었다.
제안 방법
- H. pylori 균주를 10% calf serum이 첨가된 브루셀라 한천 배지 플레이트에 도말(Streak)하고 대조를 위한 항생제 디스크 겐타마이신(바이엘동물약품, 한국), 가나마이신(바이엘동물약품, 한국) 및 엔로플록사신(바이엘동물약품, 한국)을 각각 0.25, 0.5, 0.25 mg씩 적용하였다. 시료로 사용된 각각의 천연물 추출물들은 dimethl sulfoxide(DMSO; Sigma-Aldrich, USA)로 300 mg/mL 농도로 녹여 5 µL 용량을 시험에 적용하였다.
- H. pylori(ATCC 43504; American Tissue Culture Collection, USA) 균주를 10% calf serum이 첨가된 브루셀라 한천배지에 접종 후, 10% CO2, 100% 습도가 유지되는 37℃항온기에서 3일간 배양하였다. 배양된 H.
- 7 mm)를 배치하고, 이후 10% CO2, 100% 습도가 유지되는 항온기에서 배양하고 4일 후 평가하였다. 균을 접종하고 12시간 후 각각 표준자를 이용하여 clear zone의 지름으로 표현되는 억제 범위를 측정하여 균이 자라지 않은 clear zone을 관찰하였다. 디스크는 각 시료 당 3개씩 검사하여 억제 범위의 평균값과 표준편차를 구하였다.
- 용매 대조를 위하여 매 시험마다 DMSO 적용군을 두어 결과를 비교하였다. 본 실험에서는 균이 접종된 배지에 멸균된 디스크(지름 0.7 mm)를 배치하고, 이후 10% CO2, 100% 습도가 유지되는 항온기에서 배양하고 4일 후 평가하였다. 균을 접종하고 12시간 후 각각 표준자를 이용하여 clear zone의 지름으로 표현되는 억제 범위를 측정하여 균이 자라지 않은 clear zone을 관찰하였다.
- 시료로 사용된 각각의 천연물 추출물들은 dimethl sulfoxide(DMSO; Sigma-Aldrich, USA)로 300 mg/mL 농도로 녹여 5 µL 용량을 시험에 적용하였다. 용매 대조를 위하여 매 시험마다 DMSO 적용군을 두어 결과를 비교하였다. 본 실험에서는 균이 접종된 배지에 멸균된 디스크(지름 0.
- 익산시 대학한약국으로부터 구입한 건조된 각각의 천연물들을 분쇄기(DA700; 대성아트론, 한국)로 입자 크기가 30메시 이하가 되도록 분쇄하여 천연물 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 각각의 천연물 분말(1 kg) 질량의 3배(v/w)에 해당하는 증류수를 포함하는 70% 에틸알콜 수용액을 가하여 100℃에서 3시간 동안 환류 냉각 추출한 후 추출물을 거어즈로 1차 여과하고 3,000× g에서 3분간 원심 분리하였다.
대상 데이터
- 배양된 H. pylori를 멸균된 PBS (pH 7.2)가 들어있는 튜브에 모은 후, 1 mL 당 2.0 ×109 colony-forming unit(CFU)의 균 수를 포함하게 준비하여 실험에 사용하였다.
- 시료로 사용된 각각의 천연물 추출물들은 dimethl sulfoxide(DMSO; Sigma-Aldrich, USA)로 300 mg/mL 농도로 녹여 5 µL 용량을 시험에 적용하였다.
- 연구에 사용된 천연물 종류는 Table 1과 같이 74종을 사용하였다. 익산시 대학한약국으로부터 구입한 건조된 각각의 천연물들을 분쇄기(DA700; 대성아트론, 한국)로 입자 크기가 30메시 이하가 되도록 분쇄하여 천연물 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 각각의 천연물 분말(1 kg) 질량의 3배(v/w)에 해당하는 증류수를 포함하는 70% 에틸알콜 수용액을 가하여 100℃에서 3시간 동안 환류 냉각 추출한 후 추출물을 거어즈로 1차 여과하고 3,000× g에서 3분간 원심 분리하였다.
데이터처리
- 균을 접종하고 12시간 후 각각 표준자를 이용하여 clear zone의 지름으로 표현되는 억제 범위를 측정하여 균이 자라지 않은 clear zone을 관찰하였다. 디스크는 각 시료 당 3개씩 검사하여 억제 범위의 평균값과 표준편차를 구하였다. 결과의 평가는 항생제 디스크 각각의 clear zone 형성을 관찰하고 형성된 clear zone의 지름을 측정하여 지름이 클수록 항균 효과가 높은 것으로 판정하였다.
성능/효과
- H. pylori 세균 배양 플레이트에 적용하고 대조 항생제 디스크들과 천연물 추출물(Table 1)을 적용한 후 37℃ incubator에서 추가 배양하면서 적용 디스크 주변 clear zone의 지름 크기를 측정한 결과 각각의 디스크 주변에 H. pylori 세균이 증식하지 못하는 clear zone을 관찰할 수 있었다. 실험결과 Table 2와 같이 적용 후 12시간째 DMSO의 경우 clear zone크기를 관찰할 수 없었고 대조군으로 사용된 gentamycin의 경우 10.
- 본 연구에서는 항균효능이 기대되는 천연물 추출물의 antiH. pylori 효능을 연구를 수행한 결과 천연물 추출물은 H. pylori 감염에 대하여 항균효능이 있는 것으로 in vitro 실험을 통하여 확인하였다. 항생제 내성 문제가 없으며 섭취에 안전성이 높은 천연물 유래 H.
- 디스크는 각 시료 당 3개씩 검사하여 억제 범위의 평균값과 표준편차를 구하였다. 결과의 평가는 항생제 디스크 각각의 clear zone 형성을 관찰하고 형성된 clear zone의 지름을 측정하여 지름이 클수록 항균 효과가 높은 것으로 판정하였다.
- 실험결과 Table 2와 같이 적용 후 12시간째 DMSO의 경우 clear zone크기를 관찰할 수 없었고 대조군으로 사용된 gentamycin의 경우 10.5 ± 0.58 mm, ganamycin 9.5 ± 0.58 mm, enrofloxacin 15.3 ± 1.15 mm이었으며, 천연추출물 중 효과가 좋은 것은 치자(Gardeniae Fructus), 계피(Cinnamomi Cortex), 파극(Morindae Radix), 홍화(Carthami Flos), 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 후박(Magnoliae Cortex), 목단피(Moutan Cortex Radicis), 당약(Swertiae Herba), 익모초(Leonuri Herba), 오배자(Galla Rhois), 고목(Picrasmae Lignum), 천련자 (Meliae Fructus), 영실(Rosae Fructus)과 같은 13종이었다(Table 2).
후속연구
- pylori 항균물질로서 천연물 추출물이 in vitro 실험에서 anti-H. pylori 효능이 확인되었기 때문에 향후 H. pylori 치료제 개발의 우수한 후보물질로서 이용될 수 있을 것으로 판단되었다.
- 국내에서는 Park 등 [12]이 AMO, tripotassiom dictrato, BIS, MET을 이용한 병용투여를 통해 50% 내외의 치료효과를 얻었다고 보고하였다. 그러나 이러한 항균제 치료는 이에 사용되는 항생제에 대한 내성이 나타나고, 재발가능성이 내재한다는 면에서 계속적인 연구가 필요하다. 한편 천연물을 이용한 H.
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