동양달팽이(Nesiohelix samarangae)의 arginine kinase 유전자 분석 및 발현 패턴에 관한 연구 Identification, sequence characterization and expression analysis of the arginine kinase gene in response to laminarin challenge from the Oriental land snail, Nesiohelix samarangae원문보기
동양달팽이의 arginine kinase 유전자는 염기서열 1065개로 이루어져있으며 355개의 아미노산으로 이루어져 있으며, BLAST 결과를 토대로 유사도가 높은 25개의 참고 서열과 동양달팽이의 arginine kinase의 아미노산 서열을 MEGA5 프로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행한 결과, 연체동물문에 속하는 복족강 (5종), 두족강 (5종), 이매패강 (4종) 등에 속하는 생물들이 같은 군으로 묶였으며, 절지동물문 곤충강 에 속하는 나비목 (2종), 벌목 (1종), 노린재목 (2종) 등에 속하는 생물들이 같은 군으로 묶이고, 갑각강 (5종), 거미강 (1종) 에 속하는 생물들이 묶이는 것을 알 수 있었다. Psipred 소프트웨어를 통해 2D 구조를 비교 분석한 결과도 multiple align 및 phylodendrogram 결과와 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었다. 시간에 따른 arginine kinase의 발현양상을 확인한 결과 control에 비하여 6시간에서 약 1.2배 정도 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 12시간이 지나면 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. EST를 통해 밝혀진 N. samarangae 의 Ark 서열은 근연종들의 서열과 일치함을 알 수 있었으며, 본 연구 결과를 통해 무척추동물에서의 선천성 면역 관련 유전자 연구에 동양달팽이가 좋은 모델이 될 수 있음을 제시하고 있다.
동양달팽이의 arginine kinase 유전자는 염기서열 1065개로 이루어져있으며 355개의 아미노산으로 이루어져 있으며, BLAST 결과를 토대로 유사도가 높은 25개의 참고 서열과 동양달팽이의 arginine kinase의 아미노산 서열을 MEGA5 프로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행한 결과, 연체동물문에 속하는 복족강 (5종), 두족강 (5종), 이매패강 (4종) 등에 속하는 생물들이 같은 군으로 묶였으며, 절지동물문 곤충강 에 속하는 나비목 (2종), 벌목 (1종), 노린재목 (2종) 등에 속하는 생물들이 같은 군으로 묶이고, 갑각강 (5종), 거미강 (1종) 에 속하는 생물들이 묶이는 것을 알 수 있었다. Psipred 소프트웨어를 통해 2D 구조를 비교 분석한 결과도 multiple align 및 phylodendrogram 결과와 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었다. 시간에 따른 arginine kinase의 발현양상을 확인한 결과 control에 비하여 6시간에서 약 1.2배 정도 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 12시간이 지나면 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. EST를 통해 밝혀진 N. samarangae 의 Ark 서열은 근연종들의 서열과 일치함을 알 수 있었으며, 본 연구 결과를 통해 무척추동물에서의 선천성 면역 관련 유전자 연구에 동양달팽이가 좋은 모델이 될 수 있음을 제시하고 있다.
Arginine kinase (ArK) is known to play an important role in most invertebrates the level of ATP by phosphorylation of phosphagens in cell and immuninty in living organisms. ArK has been identified in many kinds of organisms ranging from invertebrate to vertebrate. However, no ArK gene has been clone...
Arginine kinase (ArK) is known to play an important role in most invertebrates the level of ATP by phosphorylation of phosphagens in cell and immuninty in living organisms. ArK has been identified in many kinds of organisms ranging from invertebrate to vertebrate. However, no ArK gene has been cloned and investigated from N. samarangae. This leads us to identify ArK cDNA (NsArK) from the expressed sequence tag (EST) sequencing of N. samarangae. Sequence analysis indicated that the coding region of 1,065 bp contains 355 amino acid residues. Molecular phylogenetic analysis shows that NsArK had very high similarities with mollusca and arthropoda. In an attempt to investigate a potential role of NsArK in the digestive gland of N. samarangae, expression patterns were analyzed. RT-PCR analsysis shows that NsArK mRNA is induced in the rane of 1.2 fold at 6 hr by laminarin when compared with the control. The immunnologial and physiological role of NsArK remains to be further investigated in N. samarangae.
Arginine kinase (ArK) is known to play an important role in most invertebrates the level of ATP by phosphorylation of phosphagens in cell and immuninty in living organisms. ArK has been identified in many kinds of organisms ranging from invertebrate to vertebrate. However, no ArK gene has been cloned and investigated from N. samarangae. This leads us to identify ArK cDNA (NsArK) from the expressed sequence tag (EST) sequencing of N. samarangae. Sequence analysis indicated that the coding region of 1,065 bp contains 355 amino acid residues. Molecular phylogenetic analysis shows that NsArK had very high similarities with mollusca and arthropoda. In an attempt to investigate a potential role of NsArK in the digestive gland of N. samarangae, expression patterns were analyzed. RT-PCR analsysis shows that NsArK mRNA is induced in the rane of 1.2 fold at 6 hr by laminarin when compared with the control. The immunnologial and physiological role of NsArK remains to be further investigated in N. samarangae.
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문제 정의
그 결과, 증가하거나 감소한 유전자들이 동정되었고, 그 중에서 laminarin을 처리하기 전에 비해 약 2배 정도 발현이 증가한 arginine kinase (ArK) 유전자를 본 연구의 대상으로 하여 유전자의 전체염기서열 및 아미노산 염기서열을 밝혔고, 아미노산의 서열을 토대로 하여 molecular phylodendrogram 을 작성하였으며 생물정보학 분석을 통해 단백질의 2차 및 3차 구조를 예측하였다. 그리고 laminarin 처리 후 시간별 발현량의 변화를 real time RT-PCR을 통해 확인하였고, 본 연구는 선천성면역 관련 연구의 기초자료로 활용하고자 수행되었다.
제안 방법
E. coli strain BM25.8을 이용하여 lambda TriplEx2 (linear form) 에서 pTriplEx2 (circular form) 으로 전환하였다. 그리고 LB agar plate (cabenicilline) 에 plating 하여 37℃ 에서 하루를 배양하였다.
정제된 mRNA를 oligo dT와 reverse transcriptase를 사용하여 cDNA를 합성한 후 Stratagene cDNA Library Construction Kit 사용하여 cDNA library를 구축하였다. LD-PCR 법과 primer extention 법 두 가지를 사용하여 double-strand cDNA를 합성한 후 Lambda TriplEx2 vector에 ligation 시킨 후 Gigapack Gold Ⅲ (Stratagene, LaJolla, Calif.) packaging system을 사용하여 packaging을 하였다.
Laminarin은 laminaran으로도 알려져 있으며, 갈조류의 저장 polysaccharide carbohydrate로 광합성을 통해 생성되기도 한다 (Maeda and Nishizawa, 1968). Laminarin 처리 시간에 따른 arginine kinase의 발현양상을 확인하기 위해 동양달팽이에 순수하게 정제된 수용액의 laminarin을 처리한 후, real time RT-PCR방법을 이용하여 동양달팽이의 digestive gland 조직에서 확인하였다. 그 결과 control과 비교하였을 때 6시간에서 약 1.
Laminarin 처리 전후 증감이 있는 후보 유전자군에서 arginine kinase로 동정된 서열 27개는 CAP3 소프트웨어 (Huang and Madan, 1999) 를 통하여 assembly 하여 contig file을 추출하였으며 GENSCAN 소프트웨어 (Burge and Karlin, 1997; Burge and Karlin, 1998) 를 사용하여 아미노산 서열을 추출하였다.
그리고 LB agar plate (cabenicilline) 에 plating 하여 37℃ 에서 하루를 배양하였다. NucleoGen Plasmid Purification Kit를 사용하여 Plasmid를 정제한 후에 Sequencing을 위해 자동염기서열분석기 (AB-3730XL, Applied biosystems) 를 사용하여 염기서열을 결정하였다.
본 연구에서는 무척추동물에서의 선천성 면역 연구의 모델로 연체동물인 동양달팽이 (Nesiohelix samarangae) 를 대상으로 면역유발 물질인 laminarin을 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군으로 나누어서 각각의 cDNA 라이브러리를 만들고, EST (expressed sequence tag) 염기서열을 분석하여 두 군으로부터 얻어진 서열들을 비교 발현 유전체학적인 연구 (comparative transcriptomics) 방법을 통하여 분석하였다. 그 결과, 증가하거나 감소한 유전자들이 동정되었고, 그 중에서 laminarin을 처리하기 전에 비해 약 2배 정도 발현이 증가한 arginine kinase (ArK) 유전자를 본 연구의 대상으로 하여 유전자의 전체염기서열 및 아미노산 염기서열을 밝혔고, 아미노산의 서열을 토대로 하여 molecular phylodendrogram 을 작성하였으며 생물정보학 분석을 통해 단백질의 2차 및 3차 구조를 예측하였다. 그리고 laminarin 처리 후 시간별 발현량의 변화를 real time RT-PCR을 통해 확인하였고, 본 연구는 선천성면역 관련 연구의 기초자료로 활용하고자 수행되었다.
다음으로 BLAST 결과를 토대로 유사도가 높은 51개의 참고 서열과 동양달팽이의 arginine kinase의 아미노산 서열을 MEGA5 프로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행하였다. 그 후 maximum parsimony method 와 maximum likelihood method를 통해 phylodendrogram을 도식화 한 결과 최종적으로 선택된 25개의 생물 종에 대하여 문단위로는 연체동물문과 절지동물문으로 나뉘어 지는 것을 확인할 수 있었다.
단백질의 2차 구조 분석을 위해 GENSCAN 프로그램을 이용하여 확보된 아미노산 서열을 Psipred 소프트웨어를 사용하여 2D 구조를 예측하였으며 (McGuffin et al., 2000), 3D-jigsaw 소프트웨어를 사용하여 단백질의 3차 구조를 comparative modeling 하였다.
대조군으로서 아무것도 처리하지 않은 동양달팽이를 사용하였고, 순수하게 정제된 수용성의 laminarin 100 μg 을 3시간, 6시간, 9시간, 12시간 간격으로 처리한 실험군으로 나누어서 실험을 하였다. 달팽이들을 해부하여 digestive gland로부터 Trizol reagent를 사용하여 total RNA를 추출하였다. cDNA는 RTase (Fermentas) 와 oligo dT를 사용하여 합성하였고, assembly된 contig서열로부터 primer를 design하여 사용하였다 (arginine kinase 유전자; Left primer 5'-CATTCGTTCAGGCAGTGAGA-3', Right primer 5'-GCCTCAACTGTCGTCCTTTC-3').
대조군으로서 아무것도 처리하지 않은 동양달팽이를 사용하였고, 순수하게 정제된 수용성의 laminarin 100 μg 을 3시간, 6시간, 9시간, 12시간 간격으로 처리한 실험군으로 나누어서 실험을 하였다.
동양달팽이의 cDNA library를 구축한 후 random sequencing 을 통해 분석된 서열들 중 laminarin 처리 후 증가한 유전자인 arginine kinase의 서열을 추출한 후 BLASTx 검색을 통해 유사 서열들을 확보하여 분석하였다. Arginine kinase (ArK) 유전자의 서열 중에서 코딩 영역은 총 1065 bp 이고, 355개의 아미노산으로 이루어져 있었으며 염기서열의 G·C 함량은 39.
동양달팽이의 cDNA library를 구축한 후 random sequencing 을 통해 확보되어진 chromatogram 파일은 phred score 20 조건하에 base calling 을 수행하였으며 cross_match 프로그램을 통해 사용되어진 pTriplEx2 vector 서열을 masking 하였고 Emboss package (Rice et al., 2000) 의 trimmest 프로그램을 통해 poly-A tail 을 제거한 clean mFASTA 형태의 염기서열을 작성하였다 (Ewing and Green, 1998; Ewing et al., 1998). 연체동물 전용 서열데이터베이스 (mollusks sequence database; http://bioinfo.
본 연구에서는 무척추동물에서의 선천성 면역 연구의 모델로 연체동물인 동양달팽이 (Nesiohelix samarangae) 를 대상으로 면역유발 물질인 laminarin을 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군으로 나누어서 각각의 cDNA 라이브러리를 만들고, EST (expressed sequence tag) 염기서열을 분석하여 두 군으로부터 얻어진 서열들을 비교 발현 유전체학적인 연구 (comparative transcriptomics) 방법을 통하여 분석하였다. 그 결과, 증가하거나 감소한 유전자들이 동정되었고, 그 중에서 laminarin을 처리하기 전에 비해 약 2배 정도 발현이 증가한 arginine kinase (ArK) 유전자를 본 연구의 대상으로 하여 유전자의 전체염기서열 및 아미노산 염기서열을 밝혔고, 아미노산의 서열을 토대로 하여 molecular phylodendrogram 을 작성하였으며 생물정보학 분석을 통해 단백질의 2차 및 3차 구조를 예측하였다.
데이터베이스를 query로 하고, blastp (E-value; 1e-5) 검색을 사용하여 annotation을 실시하였다. 연체동물 전용 BLAST 서버의 아미노산 데이터 베이스를 활용하여 분석결과 homology가 가장 높은 아미노산 서열을 선택하여 연체동물문 및 절지동물문에 속하는 생물들에서 관련 참고서열을 추출하였다 (Braun et al., 2001). 추출된 참고서열들을 MEGA5 프로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행하였다 (Edgar, 2004; Edgar, 2004).
, 1998). 연체동물 전용 서열데이터베이스 (mollusks sequence database; http://bioinfo.sch.ac.kr/~mollusks) 및 NR 데이터베이스를 이용한 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 검색을 통한 annotation 을 실시하였다. 이 결과 laminarin 처리 전후 증감이 있는 후보 유전자군을 확보하였다.
염기서열 분석을 통하여 동정된 아미노산 서열을 연체동물 전용 BLAST 서버의 아미노산 데이터 베이스 (mollusks sequence database; http://bioinfo.sch.ac.kr/~mollusks) 를 활용하여 연체동물 문에 속하는 생물들에서 관련 참고서열을 추출하였다. 데이터베이스를 query로 하고, blastp (E-value; 1e-5) 검색을 사용하여 annotation을 실시하였다.
유전자발현의 양상을 연구하기 위해 대조군으로서 아무것도 처리하지 않은 동양달팽이와 실험군으로서 순수하게 정제된 수용성의 PAMP (laminarin) 100 μl / ml을 3 시간 처리한 동양달팽이를 사용하여 cDNA library를 구축한 후 random sequencing 을 통해 분석하였다.
kr/~mollusks) 및 NR 데이터베이스를 이용한 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 검색을 통한 annotation 을 실시하였다. 이 결과 laminarin 처리 전후 증감이 있는 후보 유전자군을 확보하였다.
그림 3 에서와 같이 ą-Helix 구조는 서열상에서 12영역으로 예측되었으며 ß-pleated sheet 구조는 서열상에서 6영역에서 존재하고 있음을 알 수 있었다. 이러한 2차 구조 결과를 토대로 comparative modeling 방법을 이용한 3d-jigsaw 프로그램을 이용하여 단백질 3차 구조를 예측해 보았다 (Fig. 4).
74104) 를 사용하여 total mRNA를 순수하게 정제하였다. 정제된 mRNA를 oligo dT와 reverse transcriptase를 사용하여 cDNA를 합성한 후 Stratagene cDNA Library Construction Kit 사용하여 cDNA library를 구축하였다. LD-PCR 법과 primer extention 법 두 가지를 사용하여 double-strand cDNA를 합성한 후 Lambda TriplEx2 vector에 ligation 시킨 후 Gigapack Gold Ⅲ (Stratagene, LaJolla, Calif.
해부 현미경하에서 동양달팽이의 소화관 부분을 제거한 뒤, 아무것도 처리하지 않은 동양달팽이와 laminarin을 처리한 각각의 동양달팽이로부터 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Cat. No. 74104) 를 사용하여 total mRNA를 순수하게 정제하였다. 정제된 mRNA를 oligo dT와 reverse transcriptase를 사용하여 cDNA를 합성한 후 Stratagene cDNA Library Construction Kit 사용하여 cDNA library를 구축하였다.
대상 데이터
All positions containing gaps and missing data were eliminated. There were a total of 332 positions in the final dataset. Evolutionary analyses were conducted in MEGA5 (Tamura et al.
cDNA는 RTase (Fermentas) 와 oligo dT를 사용하여 합성하였고, assembly된 contig서열로부터 primer를 design하여 사용하였다 (arginine kinase 유전자; Left primer 5'-CATTCGTTCAGGCAGTGAGA-3', Right primer 5'-GCCTCAACTGTCGTCCTTTC-3').
실험에 사용된 동양달팽이 (Nesiohelix samarangae) 는 충남 태안군 근흥면 가의도리에서 채집되었고, 단기간 사육되었으며 mRNA 추출하기 72 시간 전부터 먹이를 주지 않았다. 유전자발현의 양상을 연구하기 위해 대조군으로서 아무것도 처리하지 않은 동양달팽이와 실험군으로서 순수하게 정제된 수용성의 PAMP (laminarin) 100 μl / ml을 3 시간 처리한 동양달팽이를 사용하여 cDNA library를 구축한 후 random sequencing 을 통해 분석하였다.
양성 대조군으로 house keeping유전자인 actin을 사용하였고 (actin 유전자; Left primer 5'-AAGGTTACGCACTCCCACAC-3', Right primer 5'-CAAGAAGGAAGGCTGGAACA-3'), iQ SYBR Green supermix와 CFX connect real time system (Bio-rad) 를 이용하여 실험하였다.
데이터처리
단백질의 2차 구조 분석을 위해 GENSCAN 프로그램을 이용하여 예측된 아미노산의 서열을 토대로 하여 Psipred 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 그림 3 에서와 같이 ą-Helix 구조는 서열상에서 12영역으로 예측되었으며 ß-pleated sheet 구조는 서열상에서 6영역에서 존재하고 있음을 알 수 있었다.
이론/모형
3286) is shown. Initial tree(s) for the heuristic search were obtained automatically by applying the Maximum Parsimony method. The tree is drawn to scale, with branch lengths measured in the number of substitutions per site.
The evolutionary history was inferred by using the Maximum Likelihood method based on the JTT matrix-based model (Jones et al., 1992). The tree with the highest log likelihood (-6724.
추출된 참고서열들을 MEGA5 프로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행하였다 (Edgar, 2004; Edgar, 2004). 그 후 maximum parsimony method 및 maximum likelihood method를 통해 phylodendrogram을 도식화하였다 (Jones et al., 1992; Tamura et al., 2011).
, 2001). 추출된 참고서열들을 MEGA5 프로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행하였다 (Edgar, 2004; Edgar, 2004). 그 후 maximum parsimony method 및 maximum likelihood method를 통해 phylodendrogram을 도식화하였다 (Jones et al.
성능/효과
Laminarin 처리 시간에 따른 arginine kinase의 발현양상을 확인하기 위해 동양달팽이에 순수하게 정제된 수용액의 laminarin을 처리한 후, real time RT-PCR방법을 이용하여 동양달팽이의 digestive gland 조직에서 확인하였다. 그 결과 control과 비교하였을 때 6시간에서 약 1.2배 정도 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 12시간이 지나면 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 5).
다음으로 BLAST 결과를 토대로 유사도가 높은 51개의 참고 서열과 동양달팽이의 arginine kinase의 아미노산 서열을 MEGA5 프로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행하였다. 그 후 maximum parsimony method 와 maximum likelihood method를 통해 phylodendrogram을 도식화 한 결과 최종적으로 선택된 25개의 생물 종에 대하여 문단위로는 연체동물문과 절지동물문으로 나뉘어 지는 것을 확인할 수 있었다. 연체동물문의 경우에는 복족강 (5종), 두족강 (5종), 이매패강 (4종) 등의 생물들이 같은 군으로 묶이었으며, 절지동물문의 경우 곤충강에 속하는 나비목 (2종), 벌목 (1종), 노린재목 (2종) 및 갑각강 (5종), 거미강 (1종) 에 속하는 생물들이 같은 군으로 묶이는 것을 확인할 수 있었다 (Table 1, Fig.
그 후 maximum parsimony method 와 maximum likelihood method를 통해 phylodendrogram을 도식화 한 결과 최종적으로 선택된 25개의 생물 종에 대하여 문단위로는 연체동물문과 절지동물문으로 나뉘어 지는 것을 확인할 수 있었다. 연체동물문의 경우에는 복족강 (5종), 두족강 (5종), 이매패강 (4종) 등의 생물들이 같은 군으로 묶이었으며, 절지동물문의 경우 곤충강에 속하는 나비목 (2종), 벌목 (1종), 노린재목 (2종) 및 갑각강 (5종), 거미강 (1종) 에 속하는 생물들이 같은 군으로 묶이는 것을 확인할 수 있었다 (Table 1, Fig. 2).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
동양달팽이의 유전자 중 하나는 무엇인가?
동양달팽이의 arginine kinase 유전자는 염기서열 1065개로 이루어져있으며 355개의 아미노산으로 이루어져 있으며, BLAST 결과를 토대로 유사도가 높은 25개의 참고 서열과 동양달팽이의 arginine kinase의 아미노산 서열을 MEGA5 프로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행한 결과, 연체동물문에 속하는 복족강 (5종), 두족강 (5종), 이매패강 (4종) 등에 속하는 생물들이 같은 군으로 묶였으며, 절지동물문 곤충강 에 속하는 나비목 (2종), 벌목 (1종), 노린재목 (2종) 등에 속하는 생물들이 같은 군으로 묶이고, 갑각강 (5종), 거미강 (1종) 에 속하는 생물들이 묶이는 것을 알 수 있었다. Psipred 소프트웨어를 통해 2D 구조를 비교 분석한 결과도 multiple align 및 phylodendrogram 결과와 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었다.
선천성 면역 관련 연구의 대상이 되어 온 곤충은 무엇인가?
, 2002), 최근에는 후천성 면역계가 없는 무척추동물을 대상으로 한 연구들이 활발하게 진행되고 있다. 특히 투구게 (horseshoe crab; Limulus polyphemus), 민물게 (freshwater crayfish), 멍게 (ascidians) 및 초파리 (Drosophila melanogaster), 쉬파리 (Sarcophaga peregrine), 누에나방 (Bombyx mori), 담배박각시나방 (Manduca sexta), 참검정풍뎅이 (Holotrichia diomphalia), 갈색거저리 (Tenebrio molitor) 등의 곤충들이 대상이 되어왔다 (Iwanaga and Lee, 2005).
arginine kinase 유전자의 구성은?
동양달팽이의 arginine kinase 유전자는 염기서열 1065개로 이루어져있으며 355개의 아미노산으로 이루어져 있으며, BLAST 결과를 토대로 유사도가 높은 25개의 참고 서열과 동양달팽이의 arginine kinase의 아미노산 서열을 MEGA5 프로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행한 결과, 연체동물문에 속하는 복족강 (5종), 두족강 (5종), 이매패강 (4종) 등에 속하는 생물들이 같은 군으로 묶였으며, 절지동물문 곤충강 에 속하는 나비목 (2종), 벌목 (1종), 노린재목 (2종) 등에 속하는 생물들이 같은 군으로 묶이고, 갑각강 (5종), 거미강 (1종) 에 속하는 생물들이 묶이는 것을 알 수 있었다. Psipred 소프트웨어를 통해 2D 구조를 비교 분석한 결과도 multiple align 및 phylodendrogram 결과와 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었다.
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