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문제 정의
- 본 연구에서는 굴의 계획적인 인공종묘생산 및 우량형질의 정자 보존을 위하여 냉동보존 시 적정 CPA 및 농도를 탐색하고자, CPA 종류 및 농도별 독성 및 냉동보존 효과를 파악하고 해동 후 정자의 세포 손상을 조사하였다.
제안 방법
- 굴 정자의 CPA 종류 및 농도별 독성평가 분석을 위하여 CPA는 DMSO, EG, glycerol, methanol, 농도는 CPA의 최종농도가 각각 5, 10, 15, 20%가 되도록 하였다. CPA 종류 및 농도별 굴 정자의 독성평가를 위하여 각각의 CPA가 농도별로 첨가된 희석액에 정액을 100 : 1 넣고 정자의 생존율 및 운동성을 0, 20, 40, 60분 간격으로 측정하였다. 정자의 생존율 측정은 각각의 실험구별 정액을 5% eosin-10% nigrosin (Blom, 1950; Fribourgh, 1966) 에 염색한 다음, 정자의 염색 정도에 따라 생존 여부를 판별하였으며, 광학현미경으로 각각 3회 반복 측정하여 전체 정자수에 대한 살아있는 정자수의 비율로 생존율을 산정하였다.
- CPA 종류 및 농도별 해동 정자의 세포 손상 정도를 파악하기 위하여 냉동보존 중인 굴 정자를 25℃의 항온수조에 30초 간 급속 해동한 후, 유리섬유 여과지 (pore size 0.45 μm) 위에 흡착 시킨 다음 주사전자현미경 (scanning electron microscope, SEM) 관찰을 위한 전처리를 하였다.
- 5 mL straw에 봉입한 이후 각 straw를 액체질소 증기 (- 76℃)로 3분간 1차 냉각 한 후, 액체질소 (- 196℃) 로 급속 냉각하였다. CPA 종류 및 농도별로 냉동된 정액 straw를 액체질소에 보존 한 30일째에 25℃의 항온수조에 30초간 급속 해동한 후 정자의 생존율 및 운동성을 측정ㆍ비교하였다.
- CPA 종류 및 농도에 따른 굴 정자의 냉동보존 효과를 비교하기 위하여 희석액으로 여과해수, CPA는 DMSO, EG, glycerol 및 methanol를 사용하였으며, 농도는 각각 5, 10, 15 및 20%로 하였다. CPA가 농도별로 첨가된 희석액에 정액을 4 : 1의 비율로 희석하여 3분간 평형시간을 준 다음, 0.
- Methanol을 사용하여 냉동보존 한 굴 정자는 15, 20%에서는 세포 손상이 적었으나, 5% methanol로 냉동보존 한 굴 정자는 5% glycerol로 냉동보존 한 굴 정자와 비슷한 경향을 보였다. CPA별 해동 후 굴 정자의 핵의 변형과 꼬리 절단 등 세포 손상은 glycerol이 가장 심각하였으며, methanol, EG, DMSO 순으로 세포 손상이 적었다. 각각의 CPA 농도별 굴 정자의 해동 후 세포 손상은 모든 CPA에서 5% 농도가 가장 많았으며, 10, 20, 15% 순으로 세포 손상이 적었다.
- 굴 정자의 CPA 종류 및 농도별 독성평가 분석을 위하여 CPA는 DMSO, EG, glycerol, methanol, 농도는 CPA의 최종농도가 각각 5, 10, 15, 20%가 되도록 하였다. CPA 종류 및 농도별 굴 정자의 독성평가를 위하여 각각의 CPA가 농도별로 첨가된 희석액에 정액을 100 : 1 넣고 정자의 생존율 및 운동성을 0, 20, 40, 60분 간격으로 측정하였다.
- 5) 로 20분 동안 2-3회 수세하였다. 그 다음 샘플들을 경화시키기 위해 1% osmium tetroxide (OSO4, Sigama) 로 1-2시간 고정한 후, 0.1 M 인산완충액으로 20분 동안 2-3회 세척하고, ethanol을 이용하여 70%부터 100%까지 각각 30분 동안 단계별로 탈수하였다. 이후 표본들은 amyl acetate로 30분씩 2회 치환하고, CO2 가스로 임계 건조 한 다음, 60초 동안 금이온 증착하여 SEM (S-3000N, Hitachi, Japan) 으로 관찰하였다.
- 1 M 인산완충액으로 20분 동안 2-3회 세척하고, ethanol을 이용하여 70%부터 100%까지 각각 30분 동안 단계별로 탈수하였다. 이후 표본들은 amyl acetate로 30분씩 2회 치환하고, CO2 가스로 임계 건조 한 다음, 60초 동안 금이온 증착하여 SEM (S-3000N, Hitachi, Japan) 으로 관찰하였다.
- CPA 종류 및 농도별 굴 정자의 독성평가를 위하여 각각의 CPA가 농도별로 첨가된 희석액에 정액을 100 : 1 넣고 정자의 생존율 및 운동성을 0, 20, 40, 60분 간격으로 측정하였다. 정자의 생존율 측정은 각각의 실험구별 정액을 5% eosin-10% nigrosin (Blom, 1950; Fribourgh, 1966) 에 염색한 다음, 정자의 염색 정도에 따라 생존 여부를 판별하였으며, 광학현미경으로 각각 3회 반복 측정하여 전체 정자수에 대한 살아있는 정자수의 비율로 생존율을 산정하였다. 정자의 운동성은 정자운동성 관찰용 slide glass (Teflon Printed Glass Slide; 21 wells; diameter of each well, 4 mm; Funakoshi Co.
- , Japan) 위에 정액을 2 μL씩 분주하여 cover slide 없이 광학현미경으로 관찰하였다. 정자의 운동성은 Table 1의 운동지수에 따라 점수를 부여하고, 각각의 운동점수와 운동정자의 비율에 따라 Strussmann et al. (1994) 의 방법을 변형하여 정자활성지수 (sperm activity index, SAI) 로 나타내었다.
- 정자의 운동성은 정자운동성 관찰용 slide glass (Teflon Printed Glass Slide; 21 wells; diameter of each well, 4 mm; Funakoshi Co., Japan) 위에 정액을 2 μL씩 분주하여 cover slide 없이 광학현미경으로 관찰하였다.
대상 데이터
- 그러나 종마다 적정 희석액의 종류와 농도가 달라 인공해수 (artificial seawater, ASW), 인공정장 (artificial seminal plasma, ASP), glucose, Ringer's solution, MFRS (marine fish Ringer's solution), sucrose 등 여러 가지 희석액을 농도를 달리하여 사용하고 있다. 본 연구에서 굴 정자의 운동지속시간을 측정하기 위하여 여과해수를 사용한 결과, 1시간 이상 생존율과 운동성에 변화가 없어 희석액으로 여과 해수를 사용하였다.
- 실험에 사용한 굴은 경상남도 거제시 둔덕면 학산리에 위치한 굴 인공종묘배양장에서 모패로 사용 중인 2년생 굴 (각장 90.9 ± 2.5 mm, 전중 62.3 ± 3.0 g, 30마리) 을 부산 기장군 국립수산과학원 양식관리과 사육실로 수송하여 사용하였다.
- 이후 채취한 정액 중 일부를 10 μm 하우징 필터로 여과한 여과해수 (33 psu)에 정액을 희석하여 정자의 생존율이 99% 이상으로, 운동성이 매우 활발한 정액만 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 측정값은 평균±표준오차로 나타내었으며, 유의차는 SPSS-통계패키지 (version 12.0) 를 이용하여 one-way ANOVA-test (Duncan's multiple range test) 에 의해 검정하였다 (P ＜ 0.05).
성능/효과
- 0%로 감소하였다. 15 및 20% methanol에 침지한 굴 정자는 침지 20분까지 100%의 생존율을 나타냈으나, 침지 40분부터 생존율이 유의하게 감소하였으며 (P ＜0.05), CPA 농도가 높을수록 생존율은 크게 감소하였다.
- DMSO를 사용하여 냉동보존 한 굴 정자의 해동 후 세포 손상은 모든 농도에서 거의 관찰되지 않았다. 15, 20% EG를 사용하여 냉동보존 한 굴 정자의 해동 후 세포 손상은 거의 관찰되지 않은 반면, 5, 10% EG로 냉동보존 한 굴 정자는 해동 후 핵의 변형과 꼬리 절단이 일부 관찰되었다. Glycerol을 사용하여 냉동보존 한 굴 정자의 해동 후 세포 손상은 모든 농도에서 관찰되었으며, 5% glycerol로 냉동보존 한 정자는 대부분 핵과 꼬리가 절단되어 있었다.
- 05). 20% methanol에 침지한 굴 정자는 침지 20분까지 SAI가 3.0으로 높았으나, 침지 40분부터 감소하여 침지 60분에는 SAI가 2.0으로 유의하게 감소하였다 (P ＜0.05).
- 5% methanol에 침지한 굴 정자는 침지 60분까지 100%의 생존율을 보였으며, 10%에 침지한 굴 정자는 침지 40분까지 100%의 생존율을 나타내다가 침지 60분에 생존율이 96.0 ± 2.0%로 감소하였다.
- 05). 5% methanol에 침지한 굴 정자는 침지 60분까지 SAI가 3.0으로 높았으며, 10 및 15% methanol에 침지한 굴 정자의 SAI는 침지 40분부터 감소하였으나 유의한 차이는 없었다 (P ＞ 0.05). 20% methanol에 침지한 굴 정자는 침지 20분까지 SAI가 3.
- 2에 나타낸 바와 같다. 5, 10, 15 및 20%의 DMSO, EG 및 glycerol에 침지한 굴 정자는 침지 60분까지 모두 100%의 생존율을 보였다. 5% methanol에 침지한 굴 정자는 침지 60분까지 100%의 생존율을 보였으며, 10%에 침지한 굴 정자는 침지 40분까지 100%의 생존율을 나타내다가 침지 60분에 생존율이 96.
- CPA 종류 및 농도별 냉동보존 굴 정자의 해동 후 생존율은 Fig. 4에 나타난 바와 같이 DMSO로 냉동보존 한 굴 정자의 생존율이 모든 농도에서 50% 이상의 생존율을 나타내었다. 특히 15% DMSO로 냉동보존 한 굴 정자의 해동 후 생존율은 84.
- CPA 종류 및 농도별 독성평가 전, 굴 정자의 운동지속시간을 측정하기 위하여 여과해수에 정액을 희석하여 생존율과 운동성을 측정한 결과, Fig. 1에서 보는 바와 같이 1시간 이상 생존율과 운동성은 변화가 없었다.
- 15, 20% EG를 사용하여 냉동보존 한 굴 정자의 해동 후 세포 손상은 거의 관찰되지 않은 반면, 5, 10% EG로 냉동보존 한 굴 정자는 해동 후 핵의 변형과 꼬리 절단이 일부 관찰되었다. Glycerol을 사용하여 냉동보존 한 굴 정자의 해동 후 세포 손상은 모든 농도에서 관찰되었으며, 5% glycerol로 냉동보존 한 정자는 대부분 핵과 꼬리가 절단되어 있었다. Methanol을 사용하여 냉동보존 한 굴 정자는 15, 20%에서는 세포 손상이 적었으나, 5% methanol로 냉동보존 한 굴 정자는 5% glycerol로 냉동보존 한 굴 정자와 비슷한 경향을 보였다.
- 5 이하로 매우 낮았다. SEM을 이용하여 CPA 종류 및 농도별로 30일간 냉동보존 한 정자의 해동 후 상태를 관찰한 결과, DMSO를 사용하여 냉동보존 한 정자는 핵의 변형 및 꼬리 절단 등 세포 손상이 적었다. 그러나 glycerol과 methanol을 사용하여 냉동보존 한 정자는 CPA의 농도가 낮을수록 세포 손상이 많이 관찰되어, 본 연구의 CPA 종류 및 농도별 해동 정자의 생존율 및 운동성 결과와 일치하였다.
- CPA별 해동 후 굴 정자의 핵의 변형과 꼬리 절단 등 세포 손상은 glycerol이 가장 심각하였으며, methanol, EG, DMSO 순으로 세포 손상이 적었다. 각각의 CPA 농도별 굴 정자의 해동 후 세포 손상은 모든 CPA에서 5% 농도가 가장 많았으며, 10, 20, 15% 순으로 세포 손상이 적었다.
- SEM을 이용하여 CPA 종류 및 농도별로 30일간 냉동보존 한 정자의 해동 후 상태를 관찰한 결과, DMSO를 사용하여 냉동보존 한 정자는 핵의 변형 및 꼬리 절단 등 세포 손상이 적었다. 그러나 glycerol과 methanol을 사용하여 냉동보존 한 정자는 CPA의 농도가 낮을수록 세포 손상이 많이 관찰되어, 본 연구의 CPA 종류 및 농도별 해동 정자의 생존율 및 운동성 결과와 일치하였다. 따라서 굴 정자의 냉동보존 시 희석액을 여과해수로 사용할 경우, 정자의 세포 손상을 최소화하고 생존율과 운동성을 최적으로 유지하는 CPA 및 농도는 15% DMSO로 판단된다.
- 그러나 현재 사용하고 있는 CPA는 각각의 독성을 가지고 있으며, 이러한 독성이 종마다 작용하는 특이성을 가지고 있기 때문에 적합한 CPA 종류 선택 및 농도 탐색은 매우 중요하다. 본 연구에서 CPA의 독성이 굴 정자의 생존율 및 운동성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 독성평가를 실시한 결과, DMSO, EG 및 glycerol의 독성은 굴 정자의 생존율 및 운동성에 큰 영향을 미치지 않았다. 그러나 고농도의 methanol에 노출시킨 굴 정자는 노출시간이 길어질수록 생존율과 운동성이 급격히 감소하는 경향을 보여 methanol의 독성이 굴 정자에 영향을 미치는 것으로 판단된다.
- (2012) 은 버지니아 굴, Crassostrea virginica 정자의 냉동보존 연구에서 C-F HBSS를 희석액으로 사용하여 10% DMSO로 냉동보존 한 정자의 운동성과 수정률이 각각 34%, 77%로 10% methanol이나 10% PG보다 좋았다고 보고하였다. 본 연구에서 여과해수를 희석액으로 사용하여 15% DMSO로 냉동보존 한 굴 정자의 해동 후 생존율과 SAI는 각각 84.4%, 2.5로 매우 높은 것으로 나타났다. 그러나 glycerol과 methanol을 사용하여 냉동보존 한 굴 정자의 해동 후 생존율과 SAI는 모두 20% 미만, 0.
- 0 이상 이었다. 특히 15% DMSO로 냉동보존 한 굴 정자의 해동 후 SAI는 2.5로 다른 농도 보다 유의하게 높았다 (P ＜ 0.05). EG로 냉동보존 한 굴 정자의 해동 후 SAI는 모든 농도에서 1.
- 특히 15% DMSO로 냉동보존 한 굴 정자의 해동 후 생존율은 84.4±4.0%로 다른 농도 보다 유의하게 높았다 (P ＜ 0.05).
후속연구
- 이러한 결과의 차이는 희석액으로 사용한 용액의 종류에 의해 나타난 것으로 추정된다. 그러나 단순히 희석액의 종류에 의해 이런 결과가 나타난 것으로 판단하기에는 정자냉동보존 시 평형시간, 냉동률 및 해동온도 등 변수가 많으므로, 굴 정자의 냉동보존 시 적정 희석액, CPA, 평형시간, 냉동률 및 해동온도 등 여러 가지 요인에 대해 보다 세부적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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