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문제 정의
- 따라서 이러한 저해 요인들을 항산화제인 L-cysteine을 동결 보존액에 첨가하였을 때 과도한 ROS의 발생을 억제해줌으로써 융해 후 정액의 질(생존율, 운동성, 원형질막의 온전 및 첨체의 온전성) 및 체외 수정 또는 인공 수정 능력을 향상시킬 수 있을 것으로 추측된다. 따라서 본 연구는 한우 정액의 동결 시 항산화제인 L-cysteine 첨가가 정자의 성상과 체외발달 능력(분할율 및 퇴행율)에 미치는 영향을 검토하고자 수행되었다.
- 본 연구는 소 정액 동결 보존에 있어 L-cysteine을 동결 보존액에 첨가하였을 때 정자의 성상과 체외 발달 능력에 대한 효과를 분석하기 위해 수행되었다. 정자는 ROS를 제거할 수 있는 항산화 효과를 갖고 있는 세포질의 구성 요소가 한정적이다.
- 본 연구는 한우 정액의 동결 보존 시 L-cysteine 첨가가 융해 후 정자의 수정 능력과 체외 수정 후 난자의 발생 능력에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과, 정자의 생존율은 10 mM과 20 mM에서 다른 처리구에 비해 유의적으로 높은 생존율을 나타냈다(P<0.
제안 방법
- 1차 동결 보존액으로 처리한 정액은 4 ℃에서 보존하였으며, 2차 동결 보존액 또한 20% egg-yolk가 첨가된 Triladyl을 원심 분리하여 상층액을 사용하였으며, 이때 L-cysteine을 각각 0 mM, 5 mM, 10 mM 및 20 mM의 농도로 첨가한 뒤 동결에 사용하였다. 1차 동결 보존액으로 처리한 정액은 2차 동결 보존액을 첨가했을 때 정자의 최종 농도가 2×107 spermatozoa/ml가 되도록 희석하였다.
- 1% BSA가 첨가된 DM-heparin 배양액으로 3회 세척 후 15개의 난자를 50 μl 소적으로 옮겼다. L-cysteine을 각각 0, 5, 10 및 20 mM으로 처리한 동결 정액을 38.5℃의 항온 수조에서 45초간 융해 후 1 ml의 BTS를 첨가하여 1,500 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 정자의 농도가 2×106 cells/ml가 되도록 체외 수정 배양액인 DM-caffeine과 혼합하여 체외 배양 소적에 50 μl씩 분주 후 5% CO2, 38.
- 5 ℃에서 10분간 재차 배양하였다. 그 후 1,500 rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 뒤 1 ml의 PBS 첨가 후 Flow cytometry(BD, FACS Calibur)를 이용하여 분석하였다.
- 정액 100 μl에 BTS 1 ml와 FITC-PNA를 1 μl를 넣고 10분간 배양 후 1 μl PI를 첨가 후 재차 10분간 배양하였다. 그 후 원심 분리(1,500 rpm, 5 min)하여 상층액을 제거한 뒤 1 ml의 PBS를 첨가하여 Flow cytometry(BD, FACS Calibur)를 이용하여 분석하였다.
- 5 ℃에서 10분간 재차 배양하였다. 그 후, 1500 rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 뒤 1 ml PBS를 첨가한 다음 Flow cytometry(BD, FACS Calibur)를 이용하여 분석하였다.
- 본 연구에서도 이와 같은 점에 초점을 맞춰 정자의 생존율, 첨체의 온전성, 미토콘드리아의 정상성, 정자 내 H2O2 발현 및 난자의 체외 발달율 검사를 실시하였다. 그 결과, 동결 보존액에 10 mM 및 20 mM L-cysteine의 농도로 처리 후 동결- 융해한 정자에서 다른 처리군에 비해 유의적으로 높은 생존율을 나타냈다.
- 생존율 검사는 LIVE/DEAD®sperm viability kit(Invitrogen)을 이용하였으며, 이를 위해 2 μM SYBR14와 2.4 μM Propidium Iodide(PI) stock solution을 준비하였다.
- 성숙 배양 20∼22시간에서 난구 세포가 확장된 난자를 회수하여 체외수정 배양액인 0.1% BSA가 첨가된 DM-heparin 배양액으로 3회 세척 후 15개의 난자를 50 μl 소적으로 옮겼다.
- 수정된 난자를 회수하여 수정란에 붙어있는 난구 세포와 정자를 제거 후 10% FBS가 첨가된 CR1aa 배양액으로 3회 세척 후 100 μl의 배양액에 옮겨 체외 발육을 위해 5% CO2, 38.5 ℃의 조건하에서 배양 48시간 후 분할율 및 퇴행율을 조사하였다.
- 정자의 농도가 2×106 cells/ml가 되도록 체외 수정 배양액인 DM-caffeine과 혼합하여 체외 배양 소적에 50 μl씩 분주 후 5% CO2, 38.5 ℃의 조건하에서 15∼18시간 배양하면서 수정하였다.
- 정자의 동결 보존액에 0 mM, 5 mM, 10 mM 및 20 mM의 L-cysteine을 첨가하여 동결-융해 후 SYBR14/PI로 형광 염색하여 flow cytometry를 통해 분석한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 그 결과, 10 mM과 20 mM의 L-cysteine을 처리한 경우, 정자의 생존율이 각각 64.
- 정자의 동결 보존액에 L-cysteine을 농도별 첨가하여 정자의 동결-융해 후 Rhodamin123/PI로 형광 염색하여 flow cytometry를 통해 정자 내 미토콘드리아 보존율을 분석하였다(Fig. 3). 그 결과, L-cysteine 처리에 따른 미토콘드리아의 보존율은 10 mM과 20 mM에서 각각 57.
- 정자의 동결 보존액에 L-cysteine을 농도별로 첨가하여 동결-융해 후 Carboxy-DCFDA/PI로 형광 염색하여 flow cytometry를 통해 정자 내 H2O2 발현을 분석하였다. 그 결과, Fig.
- 채취한 미성숙 난자 중 난구 세포가 3겹 이상 조밀하고 세포질이 균질한 것만을 선별하여 10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 TCM-199 배양액에 4회 세척 후 5% CO2, 38.5 ℃의 조건하에서 20∼22시간 성숙 배양하였다.
대상 데이터
- 도축장에서 회수된 난소의 난포로부터 18-gauge의 주사기를 이용하여 미성숙 난자를 채취하였다. 채취한 미성숙 난자 중 난구 세포가 3겹 이상 조밀하고 세포질이 균질한 것만을 선별하여 10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 TCM-199 배양액에 4회 세척 후 5% CO2, 38.
- 이를 위해 1 μM Carboxy-DCFDA와 2.4 μM PI stock solution을 준비하였다.
- 이를 위해 1 μM Rhodamin123과 2.4 μM PI stock solution을 준비하였다.
- 이를 위해 2μM FITC-PNA와 2.4μM PI stock solution을 준비하였다.
- 한우 정액은 국립축산과학원 대관령 한우 시험장에서 사육되고 있는 종모우의 정액을 이용하였다. 한우 시험장 내에서 직접 채취된 정액은 곧바로 1차 동결 보존액에 1차 희석한 후 2시간 이내에 실험실로 운반하여 본 연구에 이용하였다. 1차 동결 보존액은 20% egg-yolk가 첨가된 Triladyl®(KRUUS, Cat.
- 한우 정액은 국립축산과학원 대관령 한우 시험장에서 사육되고 있는 종모우의 정액을 이용하였다. 한우 시험장 내에서 직접 채취된 정액은 곧바로 1차 동결 보존액에 1차 희석한 후 2시간 이내에 실험실로 운반하여 본 연구에 이용하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 얻어진 결과는 SAS(Statistical Analysis System) 9.2를 이용하여 통계분석을 실시하였고, 처리구간 차이는 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 미토콘드리아 기능율 검사는 Rhodamine123(SIGMA, cat. no. R8004, USA)/PI 형광 염색법을 이용하여 평가하였다. 이를 위해 1 μM Rhodamin123과 2.
- 정자 내 H2O2 측정은 Carboxy-2`,7`-Dichlorofluorescin diacetate(carboxy-DCFDA)/PI 형광 염색법을 이용하여 평가하였다. 이를 위해 1 μM Carboxy-DCFDA와 2.
- 정자 첨체막의 온전성 검사는 Fluorescein isothiocy-anate-labeled peanut-agglutinin(FITC-PNA)/PI 형광 염색법을 이용하여 평가하였다. 이를 위해 2μM FITC-PNA와 2.
성능/효과
- 그 결과, 10 mM과 20 mM의 L-cysteine을 처리한 경우, 정자의 생존율이 각각 64.4%와 64.7%로 0 mM 처리구(54.2%)에 비하여 유의적으로 높은 생존율을 보였다(P<0.05).
- 발현을 분석하였다. 그 결과, Fig. 4에서 나타낸 바와 같이 L-cysteine의 농도별 처리에 따른 정자 내 H2O2 발현은 유의적인 차이는 인정되지 않았으나, 0 mM에 비하여 낮은 경향을 나타냈다.
- 그 결과, L-cysteine 처리에 따른 미토콘드리아의 보존율은 10 mM과 20 mM에서 각각 57.3%와 58.9%로서 0 mM(49.9%)과 5 mM(51.1%)에 비하여 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).
- 발현 및 난자의 체외 발달율 검사를 실시하였다. 그 결과, 동결 보존액에 10 mM 및 20 mM L-cysteine의 농도로 처리 후 동결- 융해한 정자에서 다른 처리군에 비해 유의적으로 높은 생존율을 나타냈다. 한편, 첨체 손상율에서 다른 그룹에 비해 10mM 및 20 mM L-cysteine 첨가 시 유의적으로 낮게 나타났다.
- 그 결과, 동결 보존액에 10 mM과 20 mM의 L-cysteine 첨가 시 정자의 첨체 손상율은 각각 16%와 15.9%로서 0 mM(20.4%)에 비하여 유의적으로 낮은 첨체 손상율을 보였다(P<0.05).
- 그 결과, 동결 보존액에 L-cysteine을 각각 0, 5, 10 및 20 mM 처리에 따른 동결 정액을 이용하여 수정 후 48시간에서 분할율을 관찰한 결과, 0 mM(82.8 ± 1.7%), 5 mM(85.7 ± 1.3%) 및 10 mM(81.8 ± 2.7%)를 처리한 그룹에서는 유의적 차이가 나타나지 않았으나, 20 mM (61.5 ± 6.8%)를 처리한 그룹에 비하여 유의적으로 높은 분할율을 나타냈다(P<0.05).
- 그 결과, 정자의 생존율은 10 mM과 20 mM에서 다른 처리구에 비해 유의적으로 높은 생존율을 나타냈다(P<0.05).
- 5 mM 첨가에 비하여 생존율 증가와 첨체 손상이 낮아진 결과와 유사하였다. 또한 L-cysteine의 농도가 높을수록 미토콘드리아 정상성 검사에서도 유의적으로 높아지는 것으로 나타냈다. 이와 같은 결과들은 L-cysteine에 의해 동결 보존 시 발생되는 ROS를 감소시켰다는 것을 의미할 수 있다.
- 또한 정자의 첨체 손상율도 10 mM과 20 mM에서 유의적으로 낮게 나타났으며(P<0.05), 정자의 미토콘드리아 정상성은 10 mM과 20 mM에서 다른 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타냈다(P<0.05).
- 또한 퇴행율을 관찰한 결과, 0 mM (17.2 ± 1.7%), 5 mM(14.3 ± 1.3%) 및 10 mM(18.2 ± 2.7%)을 처리한 그룹에서 유의적 차이가 나타나지 않았으나, 20mM(38.5 ± 6.8%)를 처리한 그룹과 대조하여 유의적으로 낮은 퇴행율을 나타냈다(P<0.05).
- 2003년 Ali 등의 연구에 의하면 고농도의 L-cysteine을 처리한 소 난자의 경우 오히려 배반포율이 감소하는 것으로 보고되었으며, 일정 수준의 ROS는 정자의 수정 능력 획득, 난자와 정자 사이의 융합 및 수정란의 배 발육에도 필요하다고 보고(Blondin 등, 1997)와 유사하지만, 본 연구에서 정액의 동결 보존 시 Lcysteine을 첨가하는 방법과 다르기 때문에 직접적인 비교는 어렵다. 본 연구에서 소 정액의 동결 보존 시 L-cysteine을 10mM, 20 mM의 농도로 첨가하는 것이 정자의 성상에 긍정적인 효과가 나타났으나, 분할율과 퇴행율의 경우 다른 처리구에 비해 20 mM L-cysteine 첨가한 동결 정액을 수정에 이용하였을 때 부정적인 효과가 나타났다. 이러한 결과는 1999년 Kang 등의 연구에서 생쥐 정액에 Superoxide dismutase (SOD)를 처리하였을 때 처리 농도가 높아짐에 따라 수정율이 저하되는 경향이 유사하였다.
후속연구
- 따라서 이러한 저해 요인들을 항산화제인 L-cysteine을 동결 보존액에 첨가하였을 때 과도한 ROS의 발생을 억제해줌으로써 융해 후 정액의 질(생존율, 운동성, 원형질막의 온전 및 첨체의 온전성) 및 체외 수정 또는 인공 수정 능력을 향상시킬 수 있을 것으로 추측된다. 따라서 본 연구는 한우 정액의 동결 시 항산화제인 L-cysteine 첨가가 정자의 성상과 체외발달 능력(분할율 및 퇴행율)에 미치는 영향을 검토하고자 수행되었다.
- 05). 앞으로 L-cysteine의 처리에 따른 배반포 발육능력에 대한 추가 연구를 통하여, 한우 정액의 동결 보존과 체외에서 난자의 수정 및 분할에 L-cysteine의 첨가에 의한 동결 정액 생산 시스템의 개발로 인공 수정 산업에 활용이 기대된다.
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