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문제 정의
- 최근 이러한 MMPs 억제에 관한 연구는 천연물과 유기합성물질 분야 등에서는 활발히 이루어지고 있으나 나노화합물에 대한 연구는 미비한 실정이다. 그러므로 본 연구는 나노화합물 중에서도 graphene에 대해 진행 되었다. 이러한 graphene은 원자 하나의 두께를 가지는 흑연(graphite)의 단층으로써 탄소구조체들 중 하나이다[22].
- 그러나 graphene이 암전이와 관련있는 matrix metalloproteinases (MMPs) 억제에 미치는 영향에 관한 연구보고는 현재까지 미비한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 graphene의 항산화 효능과 더불어 사람 섬유아육종세포를이용하여 세포독성과 암전이와 관련 있는 MMPs 억제 효능에 대한 연구가 수행되었다.
- 이러한 암에 관한 graphene의 알려진 결과로는 photothermal therapy를 이용한 암 치료방법이 알려져 있으나 MMP 억제를 통한 암 전이 억제에 관한 연구결과는 밝혀진 바가 없다[32]. 본 연구에서는 HT1080세포에서 분비되는 MMP-2 및 MMP-9의 활성에 대한 graphene의 효능을 조사하기 위하여 gelatin zymography 및 western blot 실험을 수행하였다. 두 실험 모두 PMS로 자극 시킨 후 MMPs의 활성과 발현에 대하여 조사되었다.
- ROS는 세포 구성 성분들인 지질, 단백질, 탄수화물 및 DNA와 반응하여 산화적 손상 및 효소활성을 변화시켜 뇌졸중 및 파킨슨씨 병과 같은 뇌 질환뿐만 아니라 심장질환, 동맥경화, 암 등과 같은 각종 질병을 일으키는 원인이 되고 노화를 촉진시킨다고 보고 되고 있다[15]. 이에 본 연구는 graphene의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH radical, lipid peroxidation, Superoxide anion 및 Reducing power, Hydroxyl radical에 의한 genomic DNA 산화에 대한 graphene의 항산화효과 연구를 수행 하였다. Hydroxyl radical은 생체 내에서 DNA와 반응하여 돌연변이 및 세포독성을 유발하여 세포에 손상을 준다[19].
제안 방법
- 1 μg의 DNA를 포함하는 20 μl의 반응혼합물을 1% agarose gel에서 100 V로 30 min 동안 전기영동 하였다.
- 50 μg의 총단백질을 함유하는 세포배양액을 1.5 mg/ml gelatin을 포함하는 비환원조건의 10% polyacrylamide gels를 이용하여 전기영동하였다.
- Band의 진하기는 MMPs의 활성에 비례하여 나타나는데 이는, LAS3000®image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 관찰하였다.
- DPPH radical assay는 Brand-Williams [13]의 실험방법을 변형하여 1,1-diphenyl-2-picryl- hydrazyl (DPPH) radical에 대한 graphene의 소거능력을 측정하였다[4]. 시험농도의 graphene을 DPPH 용액에 가하여 10 sec 동안 잘 혼합한 다음 실온에서 20 min 동안 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Gel은 1 mg/ml ethidium bromide로 염색하여 물로 세척하여 UV로 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- 실험에서 사용된 graphene은 graphene carboxylic acid를 이용하여 제조하였다. Graphene carboxylic acid (0.5 g), water (20 ml)와 NaOH (1 M aqueous solution, 1 ml)의 재료를 Cole-Parmer sonicator를 이용하여 200 W의 출력으로 30분간 sonicate 시켜 graphene을 제조하였다[10].
- In vitro 지질과산화에 대한 항산화활성응 측정하기 위하여 graphene를 1, 2, 4, 8, 16 및 32 μg/ml의 농도로 linolenic acid emulsion과 혼합한 후에 0.8 mM H2O2 및 0.8 mM FeSO4를 혼합한 용액을 5 hr 동안 반응 후 0.4% TBA를 첨가하고 95℃에서 2 hr 반응시킨 다음 실온에서 10 min 동안 반응시켰다.
- MMP-2 및 MMP-9 활성은 FBS를 첨가하지 않은 DMEM배지에서 배양한 HT1080 세포에 graphene을 처리한 후 실험을 수행하였다. 50 μg의 총단백질을 함유하는 세포배양액을 1.
- Western blot의 band는 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- 10 μg의 세포용출액을 10% Tris-HCl gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에 전 처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- 본 연구에서는 HT1080세포에서 분비되는 MMP-2 및 MMP-9의 활성에 대한 graphene의 효능을 조사하기 위하여 gelatin zymography 및 western blot 실험을 수행하였다. 두 실험 모두 PMS로 자극 시킨 후 MMPs의 활성과 발현에 대하여 조사되었다. 실험결과 gelatin zymography에서는 MMP-2 및 MMP-9 두 가지 효소활성에 대하여 억제효과가 있는 것으로 나타났다.
- 먼저 100 μl의 DNA 용액에 시험 농도의 graphene, 200 μM FeSO4, 1 mM H2O2 및 50 μg/ml genomic DNA를 첨가하였다.
- Graphene이 MMP-2 및 MMP-9의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 암전이에 널리 이용되는 사람 섬유아 육종세포인 HT1080 세포를 이용하였다. 먼저 MMPs의 분비를 자극시키기 위하여 세포 내에서 H2O2을 생성시키는 phenazine-methosulfate (PMS)와 protein kinase C의 강력한 activator인 phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)로 자극하였다. 그 다음 72 hr 동안 세포를 배양 후 세포배양 상등액을 이용하여 gelatin zymograhpy를 수행하였다.
- 사람 섬유아육종세포인 HT1080 세포로부터 분리한 genomic DNA를 이용하여 Fenton 반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 graphene의 보호효과를 조사하였다. 대조군의 genomic DNA는 Fig.
- 생체 내 산화적 스트레스와 관련되어 있는 DPPH radical, lipid peroxidation, superoxide anion의 소거능 및 환원력에 대하여 조사하였다. DPPH radical 소거법은 항산화 물질에 의한 DPPH radical의 흡광도 변화를 지표로 하여 산화억제 정도를 예측할 수 있다.
- 여기에 10% TCA (trichloroacetic acid) 용액을 1 ml 가하여 13,500× g에서 15 min 동안 원심분리 하여 상등액 1 ml에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ml을 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 환원력은 시료첨가군과 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다.
- 5에서 보여지는 바와 같이 MMP-2의 단백질 발현은 억제되지 않으나 MMP-9의 단백질 발현이 16 μg/ml 농도 이상의 graphene에 의하여 뚜렷하게 억제되는 것으로 나타나, graphene은 MMP-9의 단백질 발현을 억제시키는 것으로 판정되었다. 한편 graphene이 항산화 효소의 발현을 조절하는데 가장 중요한 전사인자인 Nrf2에 의하여 조절되는 SOD-1, SOD-2 및 glutathione reductase (GR)의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. Graphene은 32 μg/ml 이하의 농도에서 Nrf2의 발현을 증가 시켰으나 SOD-2의 발현은 감소시켰고 SOD-1와 GR의 단백질 발현 수준에서는 변화가 없는 것으로 나타났다.
대상 데이터
- Graphene이 MMP-2 및 MMP-9의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 암전이에 널리 이용되는 사람 섬유아 육종세포인 HT1080 세포를 이용하였다. 먼저 MMPs의 분비를 자극시키기 위하여 세포 내에서 H2O2을 생성시키는 phenazine-methosulfate (PMS)와 protein kinase C의 강력한 activator인 phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)로 자극하였다.
- 세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin/streptomycin/amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (USA)로부터 구입하였다. HT1080 세포는 American Type of Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. MTT 시약, gelatin, agarose, PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 기타시약은 Sigma Chemical Co.
- HT1080 세포는 American Type of Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. MTT 시약, gelatin, agarose, PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 기타시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. HT1080 세포는 5% CO2 및 37℃에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기에서 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine and 100 μg/ml penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.
- 세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin/streptomycin/amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (USA)로부터 구입하였다.
- 실험에서 사용된 graphene은 graphene carboxylic acid를 이용하여 제조하였다. Graphene carboxylic acid (0.
- 그 다음 15:1 비율의 n-butanol : pyridine 용액을 500 μl 첨가하고 1,000× g에서 10 min 동안 원심분리한 후 상등액을 532 nm에서 흡광도를 측정하여 지질과산화정도는 시료 첨가 전후의 흡광도비를 %값으로 환산하여 나타내었다. 양성대조군으로는 0.1% vitamin E를 사용하였다.
데이터처리
- Level of significance was identified statistically using Student’s t test.
- 각 시료농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s t test 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
- 각 실험은 3 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- Hydroxyl radical에 의한 DNA 손상을 전기영동법으로 분석을 위하여 Genomic DNA는 약간 변형된 표준 과정에 따라 HT1080 세포로부터 추출하였다[20]. Fenton반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 노출된 DNA 산화는 기존에 실험된 방법에 따라 수행되었다[21]. 먼저 100 μl의 DNA 용액에 시험 농도의 graphene, 200 μM FeSO4, 1 mM H2O2 및 50 μg/ml genomic DNA를 첨가하였다.
- Graphene의 MMP-2 및 MMP-9의 활성에 대한 억제 효과가 단백질 발현의 수준에서 조절되는지를 연구하기 위하여 Western blot을 시행하였다. Fig.
- Graphene이 세포 독성에 미치는 농도를 조사하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. HT1080 세포에 대한 graphene의 세포 독성을 측정한 결과, Fig.
- Hansen [12] 방법에 따라 HT1080 세포에 대한 graphene의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
- Superoxide anion 라디칼소거능은 Fidovich [9]의 방법 에 의해 정하였다. 각 시료 용액 0.
- 환원력 assay는 Oyaizu의 방법에 따라 측정하였다[25]. 시료 1 ml에 pH 6.
성능/효과
- Fig. 4A에서 보여지는 바와 같이 graphene의 PMS처리군에서는 16 μg/ml 이상의 농도에서 MMP-2와 MMP-9의 활성이 모두 감소되고, Fig. 4B에서 보여지는 바와 같이 PMA처리군에서는 8 μg/ml 이상의 농도에서 MMP-2와 MMP-9의 활성이 모두 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
- 그 다음 72 hr 동안 세포를 배양 후 세포배양 상등액을 이용하여 gelatin zymograhpy를 수행하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 PMS 및 PMA로 자극한 대조군은 자극제를 처리하지 않은 공시험군에 비하여 전체적으로 MMP-2 및 MMP-9 효소활성이 증가하는 것으로 나타났다. 특히, PMA처리군에서는 공시험군에 비하여 MMP-9의 효소활성이 현저하게 증가하였다.
- Fig. 5에서 보여지는 바와 같이 MMP-2의 단백질 발현은 억제되지 않으나 MMP-9의 단백질 발현이 16 μg/ml 농도 이상의 graphene에 의하여 뚜렷하게 억제되는 것으로 나타나, graphene은 MMP-9의 단백질 발현을 억제시키는 것으로 판정되었다.
- Graphene은 32 μg/ml 이하의 농도에서 Nrf2의 발현을 증가 시켰으나 SOD-2의 발현은 감소시켰고 SOD-1와 GR의 단백질 발현 수준에서는 변화가 없는 것으로 나타났다.
- HT1080 세포에 대한 graphene의 세포 독성을 측정한 결과, Fig. 1에서 보는 바와 같이 graphene 32 μg/ml 이하의 농도에서는 대조군과 비교하였을 때 어떠한 독성효과도 없는 것으로 나타났다.
- 그러나 graphene을 첨가한 군에서는 1 µg/ml 이상 농도의 graphene에서 genomic DNA의 산화적 손상이 유의성 있게 억제되었다. Hydroxyl radical에 의한 DNA의 산화적 손상은 농도에 비례하여 억제되는 것으로 나타났다.
- 먼저 hydroxyl radical에 의한 지질 과산화 확인을 위하여 기존에 알려진 친유성 항산화제인 1,000 μg/ml의 vitamin E의 지질과산화에 대한 억제효능을 평가하였으나 vitamin E는 효과를 보였으나 graphene은 효과가 없는 것으로 나타났다. Superoxide anion 소거능을 측정하는 실험인 Fig. 2C에서는 양성 대조군인 SOD에서는 뛰어난 효과가 나타났으며, 또한 graphene에서도 superoxide anion 소거능에 효과가 있는 것으로 나타났다. Fig.
- 본 연구에서 graphene은 DPPH radical 소거능, lipid peroxidation 및 reducing power에서는 효과를 나타내지 않았으나, superoxide anion의 소거능은 있는 것으로 나타났다. 더욱이 HT1080 세포로부터 genomic DNA를 분리하여 hydroxyl radical에 의하여 유발되는 DNA 산화에 대한 보호효과는 graphene의 농도에 비례하여 증가하여 산화적 스트레스로부터 DNA 보호 효과가 있는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 HeLa cells에서 cellular delivery 중 graphene이 DNA의 보효 효과를 가진다는 연구 결과와 일치하는 바가 있으며[18], 따라서 graphene은 과산화수소를 유의성있게 소거함으로써 DNA의산화를 막아 여러 가지 질병과 암으로부터 보호 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
- 먼저 hydroxyl radical에 의한 지질 과산화 확인을 위하여 기존에 알려진 친유성 항산화제인 1,000 μg/ml의 vitamin E의 지질과산화에 대한 억제효능을 평가하였으나 vitamin E는 효과를 보였으나 graphene은 효과가 없는 것으로 나타났다.
- Hydroxyl radical은 생체 내에서 DNA와 반응하여 돌연변이 및 세포독성을 유발하여 세포에 손상을 준다[19]. 본 연구에서 graphene은 DPPH radical 소거능, lipid peroxidation 및 reducing power에서는 효과를 나타내지 않았으나, superoxide anion의 소거능은 있는 것으로 나타났다. 더욱이 HT1080 세포로부터 genomic DNA를 분리하여 hydroxyl radical에 의하여 유발되는 DNA 산화에 대한 보호효과는 graphene의 농도에 비례하여 증가하여 산화적 스트레스로부터 DNA 보호 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
- 두 실험 모두 PMS로 자극 시킨 후 MMPs의 활성과 발현에 대하여 조사되었다. 실험결과 gelatin zymography에서는 MMP-2 및 MMP-9 두 가지 효소활성에 대하여 억제효과가 있는 것으로 나타났다. Western blot 분석에서는 graphene이 암전이와 관련있는 MMP-9의 발현을 감소시켰다.
- 더욱이 HT1080 세포로부터 genomic DNA를 분리하여 hydroxyl radical에 의하여 유발되는 DNA 산화에 대한 보호효과는 graphene의 농도에 비례하여 증가하여 산화적 스트레스로부터 DNA 보호 효과가 있는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 HeLa cells에서 cellular delivery 중 graphene이 DNA의 보효 효과를 가진다는 연구 결과와 일치하는 바가 있으며[18], 따라서 graphene은 과산화수소를 유의성있게 소거함으로써 DNA의산화를 막아 여러 가지 질병과 암으로부터 보호 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
- 이러한 graphene의 항산화력은 MMP-2, MMP-9의 활성억제에 관여하여 암전이를 억제시킬 가능성이 있다는 것을 알 수 있다. 이러한 본 연구에서 발견된 효능의 결과로 graphene이 하나의 암전이 작용기전을 억제할 수 있음을 알게 되었다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 graphene은 암 전이와 관련 있는 MMP-2 및 MMP-9의 활성과 발현을 억제하여 암 억제에 도움을 줄수 있는 하나의 우수한 산업화를 위한 생의학 응용소재로 이용될 수 있으리라 기대된다.
후속연구
- 이러한 본 연구에서 발견된 효능의 결과로 graphene이 하나의 암전이 작용기전을 억제할 수 있음을 알게 되었다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 graphene은 암 전이와 관련 있는 MMP-2 및 MMP-9의 활성과 발현을 억제하여 암 억제에 도움을 줄수 있는 하나의 우수한 산업화를 위한 생의학 응용소재로 이용될 수 있으리라 기대된다.
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