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문제 정의
- 따라서 본 연구의 목적은 섬유소재에 적합한 효소 고정화 기술을 도입하기 위하여 고정화 담체로 지금까지 연구된 바 없는 키토산 부직포를, 가교제는 GA를 이용하여 트립신을 고정화하는 것이다. 또한 본 연구를 통해 연구 및 개발이 활발히 진행되고 있는 창상피복재 분야에 효소 고정화를 이용한 창상피복재의 개발 가능성을 확인함으로서 기초 연구자료를 제시하고자 한다.
- 따라서 본 연구의 목적은 섬유소재에 적합한 효소 고정화 기술을 도입하기 위하여 고정화 담체로 지금까지 연구된 바 없는 키토산 부직포를, 가교제는 GA를 이용하여 트립신을 고정화하는 것이다. 또한 본 연구를 통해 연구 및 개발이 활발히 진행되고 있는 창상피복재 분야에 효소 고정화를 이용한 창상피복재의 개발 가능성을 확인함으로서 기초 연구자료를 제시하고자 한다. 이를 위하여, 첫째, 키토산 부직포와 트립신 반응 시 최적 조건은 pH, 온도, 트립신 농도, 처리 시간 등의 반응 조건에 따라 트립신의 활성을 평가하여 설정하였다.
- 또한 대부분의 효소는 강한 산성과 염기성 조건에서 변성으로 인해 안정성이 낮아진다. 본 실험에서는 트립신의 최적 pH인 pH 8.0 부근(pH 7.0 ~9.0)에서 트립신의 활성을 평가하였다. [Fig.
- 넷째, 분광학적 분석과 표면 관찰을 통해서 키토산 부직포에 GA 가교 및 트립신 고정화의 여부를 확인하였다. 본 연구를 바탕으로 창상피복재로 주목받고 있는 키토산 부직포 담체에 트립신을 고정화함으로써 앞으로 용도가 확대될 기능성 섬유소재의 개발 가능성을 확인하였다.
- 본 연구를 통해, 키토산 부직포 담체에 GA를 이용한 트립신의 고정화가 효과적이므로 효소 고정화를 이용한 창상피복재의 개발 가능성을 확인하였다. 또한 후속 연구로 GA 가교한 키토산 부직포의 최적의 트립신 고정화 조건 설정 및 고정화된 트립신의 안정성 평가 등이 필요한 것으로 판단된다.
가설 설정
- 9. SEM micrographs (×5,000) of (a) untreated chitosan nonwoven and (b) trypsin immobilized chitosan nonwoven.
제안 방법
- GA와 키토산 부직포의 최적 가교 조건에서 GA와 키토산 부직포를 반응시킨 후, GA 가교한 키토산 부직포를 트립신과 키토산 부직포의 최적 반응 조건으로 트립신을 고정화시켰다. 반응하지 않은 잔여 GA를 제거하기 위해 GA 가교한 해당 버퍼로 10분간 1회 수세하고, 고정화되지 않은 트립신이 검출되지 않을 때까지 증류수로 여러 번 수세한 후, 4℃에서 1시간 보관한 다음 위와 동일한 조건의 기질과 10분간 반응시켜 고정화된 트립신의 활성을 측정하였다.
- 고정화된 트립신의 활성을 자유 트립신의 활성과 비교·평가하였으며, 이상의 실험을 통해 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 셋째, 최적의 고정화 방법은 앞에서 설정한 최적 조건에서 선가교 및 후가교 방법으로 트립신을 고정화한 후, 고정화된 트립신의 활성 평가를 바탕으로 GA 가교 순서를 정하여 설정하였다. 넷째, 분광학적 분석과 표면 관찰을 통해서 키토산 부직포에 GA 가교 및 트립신 고정화의 여부를 확인하였다. 본 연구를 바탕으로 창상피복재로 주목받고 있는 키토산 부직포 담체에 트립신을 고정화함으로써 앞으로 용도가 확대될 기능성 섬유소재의 개발 가능성을 확인하였다.
- 이를 위하여, 첫째, 키토산 부직포와 트립신 반응 시 최적 조건은 pH, 온도, 트립신 농도, 처리 시간 등의 반응 조건에 따라 트립신의 활성을 평가하여 설정하였다. 둘째, 키토산 부직포에 GA로 가교 시 최적 조건은 pH, GA 농도, 가교 시간에 따른 가교 정도 및 고정화된 트립신의 활성을 평가하여 설정하였다. 셋째, 최적의 고정화 방법은 앞에서 설정한 최적 조건에서 선가교 및 후가교 방법으로 트립신을 고정화한 후, 고정화된 트립신의 활성 평가를 바탕으로 GA 가교 순서를 정하여 설정하였다.
- 시간은 반응 60분이 지나면 트립신의 불안정성으로 자가분해 되어 활성이 감소함을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 키토산 부직포와 트립신 반응 시 pH 8.5, 온도 37℃, 트립신 농도 15%(o.w.f), 처리 시간 60분을 최적 반응 조건으로 설정하였다.
- 따라서 C=N 결합을 통해 키토산 부직포에 GA 가교 및 트립신 고정화가 효과적으로 이루어짐을 확인하였다. 또한 GA 가교된 키토산 부직포에 트립신이 고정화 되었는지의 여부는 표면 관찰을 통해 확인하였다.
- 반응 조건에 따라 GA 가교한 키토산 부직포의 GA 가교 정도는 키토산 부직포를 반응성 염료 RR222로 염색하여 측정하였다. 조건별로 GA 가교한 키토산 부직포를 0.
- GA와 키토산 부직포의 최적 가교 조건에서 GA와 키토산 부직포를 반응시킨 후, GA 가교한 키토산 부직포를 트립신과 키토산 부직포의 최적 반응 조건으로 트립신을 고정화시켰다. 반응하지 않은 잔여 GA를 제거하기 위해 GA 가교한 해당 버퍼로 10분간 1회 수세하고, 고정화되지 않은 트립신이 검출되지 않을 때까지 증류수로 여러 번 수세한 후, 4℃에서 1시간 보관한 다음 위와 동일한 조건의 기질과 10분간 반응시켜 고정화된 트립신의 활성을 측정하였다.
- 트립신과 키토산 부직포의 최적 반응 조건에서 트립신과 키토산 부직포를 반응시킨 후, 트립신 흡착된 키토산 부직포를 GA와 키토산 부직포의 최적 가교 조건으로 GA로 가교시켰다. 반응하지 않은 잔여 GA를 제거하기 위해 버퍼로 10분간 1회 수세하고, 고정화되지 않은 트립신이 검출되지 않을 때까지 증류수로 여러 번 수세한 후, 4℃에서 1시간 보관한 다음 위와 동일한 방법으로 고정화된 트립신의 활성을 측정하였다.
- 본 연구는 인체 적합성 생체 고분자 소재로 각광 받고 있는 키토산 부직포에 GA로 가교 후, 트립신을 고정화하였다. 키토산 부직포와 트립신의 최적 반응 조건, 키토산 부직포에 GA 가교 시 최적 가교 조건을 설정하고, GA 가교 순서에 따른 두 가지 방법으로 트립신을 고정화하였다.
- 둘째, 키토산 부직포에 GA로 가교 시 최적 조건은 pH, GA 농도, 가교 시간에 따른 가교 정도 및 고정화된 트립신의 활성을 평가하여 설정하였다. 셋째, 최적의 고정화 방법은 앞에서 설정한 최적 조건에서 선가교 및 후가교 방법으로 트립신을 고정화한 후, 고정화된 트립신의 활성 평가를 바탕으로 GA 가교 순서를 정하여 설정하였다. 넷째, 분광학적 분석과 표면 관찰을 통해서 키토산 부직포에 GA 가교 및 트립신 고정화의 여부를 확인하였다.
- , 2005). 이 두 가지 방법 모두 앞 실험에서 설정한 트립신과 키토산 부직포의 최적 반응 조건 및 GA와 키토산 부직포의 최적 가교 조건으로 실험하였다.
- 또한 본 연구를 통해 연구 및 개발이 활발히 진행되고 있는 창상피복재 분야에 효소 고정화를 이용한 창상피복재의 개발 가능성을 확인함으로서 기초 연구자료를 제시하고자 한다. 이를 위하여, 첫째, 키토산 부직포와 트립신 반응 시 최적 조건은 pH, 온도, 트립신 농도, 처리 시간 등의 반응 조건에 따라 트립신의 활성을 평가하여 설정하였다. 둘째, 키토산 부직포에 GA로 가교 시 최적 조건은 pH, GA 농도, 가교 시간에 따른 가교 정도 및 고정화된 트립신의 활성을 평가하여 설정하였다.
- , 2002). 잔여 용액의 흡광도는 506nm에서 UV-Vis Spectrophotometer로 측정한 후, 흡진율로 환산하여 GA 가교 정도를 평가하였다.
- 본 연구는 인체 적합성 생체 고분자 소재로 각광 받고 있는 키토산 부직포에 GA로 가교 후, 트립신을 고정화하였다. 키토산 부직포와 트립신의 최적 반응 조건, 키토산 부직포에 GA 가교 시 최적 가교 조건을 설정하고, GA 가교 순서에 따른 두 가지 방법으로 트립신을 고정화하였다. 고정화된 트립신의 활성을 자유 트립신의 활성과 비교·평가하였으며, 이상의 실험을 통해 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 키토산 부직포의 가교는 0.15g의 키토산 부직포를 액비 1:50, 25mM의 버퍼용액에 넣고, pH(7.0~11.0), GA 농도(0.1~15%, v/v), 반응 시간(10~900분)을 변화시켜 110rpm으로 항온진탕수조에서 처리하였다. GA 가교한 키토산 부직포는 해당 버퍼로 10분간 1회, 증류수로 10분간 2회 수세하여 잔여 GA를 제거한 후, 상온에서 건조하였다(Betancor et al.
- f)의 트립신과 25℃에서 24시간 동안 110rpm으로 항온진탕수 조에서 반응시켰다. 트립신 고정화한 키토산 부직포는 증류수로 여러 번 수세하여 고정화되지 않은 잔여 트립신을 제거한 후, 효소의 변성이 적은 4℃에서(Nikolic et al., 2010) 1시간 보관 후 고정화된 트립신의 활성을 측정하였다(Manrich et al., 2008). 트립신 고정화된 키토산 부직포를 pH 8.
- 트립신과 키토산 부직포의 최적 반응 조건에서 트립신과 키토산 부직포를 반응시킨 후, 트립신 흡착된 키토산 부직포를 GA와 키토산 부직포의 최적 가교 조건으로 GA로 가교시켰다. 반응하지 않은 잔여 GA를 제거하기 위해 버퍼로 10분간 1회 수세하고, 고정화되지 않은 트립신이 검출되지 않을 때까지 증류수로 여러 번 수세한 후, 4℃에서 1시간 보관한 다음 위와 동일한 방법으로 고정화된 트립신의 활성을 측정하였다.
- 트립신과 키토산 부직포의 활성은 0.5g의 키토산 부직포를 액비 1:50, 25mM의 버퍼용액에 넣고, pH(7.0~ 9.0), 온도(30~60℃), 트립신 농도(1~100%, o.w.f), 반응 시간(10~240분)을 변화시켜 110rpm으로 항온진탕수조 (Shaking water bath, BS-31, JEIO TECH Co., Korea)에서 처리하였다. 트립신과 키토산 부직포의 활성 정도는 브래드포드 법에 의해 반응한 상층액을 UV-Vis Spectro- photometer(M-3100, SCINCO CO.
- 3]은 트립신과 키토산 부직포의 최적 반응 조건을 설정하기 위하여, 반응 용액의 pH 및 온도, 트립신 농도, 처리 시간을 변화시켜 처리한 결과이다. 트립신의 최적 반응 조건은 효소 처리 후 잔여 용액을 브래드포드 시약과 반응시킨 후 595nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다.
- 표면 형태는 주사 전자 현미경(JSM-7600F, JEOL KOREA LTD., Japan)을 사용하여 비교, 관찰하였다.
- 표면의 분광학적 분석은 적외선 분광광도계(FT/IR 670Plus, Jasco Inc., USA)를 사용하여 비교, 관찰하였다.
대상 데이터
- , Japan)를 사용하였다. GA 가교한 키토산 부직포의 가교 정도를 평가하기 위해 반응성 염료 Sunfix Scarlet S2G 150%(C.I. Reactive Red 222, Oh Young Industrial Co., Korea)를 사용하였다. 트립신 활성 측정을 위해 트립신의 기질인 N a -Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride(이하 L-BAPA, Sigma Chemicals Co.
- , Korea)를 사용하였다. 트립신 활성 측정을 위해 트립신의 기질인 N a -Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride(이하 L-BAPA, Sigma Chemicals Co., USA), 디메틸설폭시화물(이하 DMSO, dimethyl sulfoxide, Sigma Chemicals Co., USA), 염화칼슘(calcium chloride, Kanto Chemical Co., Japan)을 사용하였다.
- , Korea)을 사용하였다. 트립신과 키토산 부직포의 활성 측정을 위해 브래드포드 시약(Sigma Chemicals Co., USA)을, 가교제로 25% 글루타알데하이드(이하 GA, Glutaraldehyde, Junsei Chemical Co., Japan)를 사용하였다. GA 가교한 키토산 부직포의 가교 정도를 평가하기 위해 반응성 염료 Sunfix Scarlet S2G 150%(C.
- 효소 및 글루타알데하이드 처리 시 pH를 일정하게 유지하기 위하여 버퍼용액을 제조해서 사용하였으며, 버퍼로 Trizma base(Sigma Chemicals Co., USA)와 Trizma HCl(Sigma Chemicals Co., USA), 인산수소나트륨(sodium phosphate monobasic, Sigma Chemicals Co., USA)과 인산일수소나트륨(sodium phosphate dibasic, Sigma Chemicals Co., USA), 탄산나트륨(sodium carbonate, Duksan Pure Chemicals Co., Korea)과 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, Duksan Pure Chemicals Co., Korea)을 사용하였다. 트립신과 키토산 부직포의 활성 측정을 위해 브래드포드 시약(Sigma Chemicals Co.
이론/모형
- , Korea)에서 처리하였다. 트립신과 키토산 부직포의 활성 정도는 브래드포드 법에 의해 반응한 상층액을 UV-Vis Spectro- photometer(M-3100, SCINCO CO., Korea)를 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- [Fig. 5(a)]에 나타난 바와 같이 반응성 염료에 의한 흡진율은 GA 농도 0.1~3%까지는 선형적으로 크게 감소하다가 3~15%에서는 약 10% 정도로 완만하게 감소하였다. 이는 GA 농도 3% 이상부터는 중합된 GA 분자들이 키토산 부직포의 아미노기에 포화상태로 결합하였기 때문이다.
- [Fig. 5(b)]에 나타난 바와 같이 키토산 부직포에 가교시 키는 GA의 농도가 증가함에 따라 고정화된 트립신의 활성은 선형적으로 증가하였으며, GA 농도 3%에서 최대 활성을 나타내고, 그 이상의 농도에서는 약간 감소하여 일정 수준을 유지하였다. GA 농도는 가교 결합 정도에 영향을 주는 중요한 요소로, GA 농도 2% 이하에서 트립신과 GA의 가교 결합이 충분히 이루어지지 않아 고정화된 트립신의 활성이 낮게 나타난 것으로 판단된다(Migneault et al.
- [Fig. 7]에 나타난 바와 같이 고정화된 트립신의 활성은 GA 선가교의 방법이 GA 후가교의 방법보다 월등히 높았다. GA 선가교로 고정화한 트립신의 활성이 더 우수한 원인 중 하나는 고정화에 따른 효소의 화학적 변형과 관련이 있다.
- , 2009). 따라서 C=N 결합을 통해 키토산 부직포에 GA 가교 및 트립신 고정화가 효과적으로 이루어짐을 확인하였다. 또한 GA 가교된 키토산 부직포에 트립신이 고정화 되었는지의 여부는 표면 관찰을 통해 확인하였다.
- , 2012) 최적 GA 가교 시의 pH로 적절치 않다고 판단하였다. 따라서 고정화된 트립신 활성 측정 결과에 따른 최적 GA 가교 pH는 10.0이다.
- 또한 키토산 부직포 역시 GA의 알데하이드기와 공유 결합하는 아미노기를 가지고 있기 때문에 GA 선가교 방법이 더 안정적이며 반응이 일어나기 쉬운 것으로 판단된다. 따라서 키토산 부직포에 GA를 이용한 트립신 고정화 시 GA 선가교의 방법이 GA 후가교의 방법보다 더 우수함을 확인하였다.
- , 2003). 따라서 표면 관찰 결과를 통해, 키토산 부직포에 트립신이 고정화됨을 확인하였다.
- (2006)의 연구와 유사한 결과이다. 본 실험 결과, pH 7.0, 8.0에서 GA 가교한 키토산 부직포는 노란 갈색에 가까운 색 변화를 보였으며, 위 조건에서 GA 가교한 키토산 부직포에 고정화된 트립신의 활성은 매우 낮았다. 이는 담체의 색이 갈색에 가까워질수록 GA 반응이 잘 일어나지 않았기 때문에 담체로 쓸 수 없다는 Betancor et al.
- , 2005). 본 연구에서도 GA 후가교로 고정화한 트립신은 거의 활성이 없는 것으로 나타났다. 이는 키토산 부직포와 트립신 간의 이온적 흡착이 잘 일어나지 않아 트립신이 고정화되지 않은 것으로 판단된다.
- 최적 반응 조건에서 GA 가교 순서에 따라 트립신을 고정화한 결과, GA 선가교 방법이 GA 후가교 방법보다 트립신 고정화에 더 효과적이며, GA 선가교 방법으로 고정화된 트립신의 활성은 자유 트립신의 약 40%이다. 분광학적 분석과 표면 관찰을 통해 키토산 부직포에 GA가 가교되었고, 트립신이 고정화되었음을 확인하였다.
- 또한 농도는 최적 농도 이상에서 과농도로 인한 응집으로 트립신 활성의 상대적인 증가율이 감소하였다(Lee & Song, 2010). 시간은 반응 60분이 지나면 트립신의 불안정성으로 자가분해 되어 활성이 감소함을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 키토산 부직포와 트립신 반응 시 pH 8.
- 이상, 키토산 부직포와 반응시킨 자유 트립신의 안정성을 평가한 결과, 자유 트립신의 최적 pH는 8.5이며, pH와 관계없이 45℃ 이상의 온도에서 점차적으로 활성이 저하되다가 60℃에서는 거의 사활되었다. 또한 농도는 최적 농도 이상에서 과농도로 인한 응집으로 트립신 활성의 상대적인 증가율이 감소하였다(Lee & Song, 2010).
- 이상의 결과를 바탕으로 GA 최적 가교 조건은 pH 10.0, GA 농도 3%(v/v), 가교 시간 2시간이다.
- 자유 트립신과 고정화 트립신의 활성을 비교해보면, 고정화 트립신의 활성이 자유 트립신 활성의 약 40%를 나타냈다. 이는 효소를 담체에 공유결합으로 고정화할때 효소의 고차 구조나 활성 중심이 일부 파괴될 수 있고, 물리적 구속에 의해 효소의 원활한 이동이 제한되어 기질과의 반응 속도가 저하되기 때문이다(Ann, 1993; Joung, 2008; Li et al.
- 이는 반응 초기 30분 동안 GA가 담체의 아미노기와 빠르게 반응한다는 Monsan(1978)의 연구결과와 일치하며, 본 연구결과에서도 미처리한 키토산 부직포에 비해 30분 동안 GA를 가교한 키토산 부직포의 흡진율이 100%에서 약 38%로 급격히 감소한 것을 확인하였다. 즉, 같은 양의 GA를 다른 가교 시간 조건에서 처리한 키토산 부직포에 반응성 염료를 흡착시킨 결과는 2시간 동안 GA를 가교한 키토산 부직 포가 가장 낮은 흡진율을 보였다. 따라서 최적 GA 가교 시간은 2시간이다.
- 5, 37℃ 조건에서 최대 흡광도 값을 나타냈고, 45℃ 이하의 온도에서는 pH에 의한 흡광도 차이가 크고 그 이상의 온도에서는 pH에 의한 흡광도 차이가 작았다. 즉, 트립신은 키토산 부직포와 반응 시 45℃ 이하의 온도에서는 pH의 영향을 많이 받고, 그 이상의 온도에서는 pH보다는 온도에 의해 영향을 많이 받음을 확인하였다. 브래드포드 시약은 단백질의 양전하를 띤 염기성 아미노산인 아르기닌, 리신, 히스티딘 잔기와 결합하여 푸른색을 띠며 595nm로 스펙트럼 이동을 보이는 데(Bradford, 1976), 45℃ 이상의 온도에서 온도가 높아짐에 따라 흡광도 값이 매우 작아지는 결과를 통해 위 온도에서 트립신은 그 구조가 변성되거나 부분적으로 사활되어 키토산 부직포 및 브래드포드 시약과 반응하지 못한 것으로 판단된다.
- 0, GA 농도 3%(v/v), 2시간이다. 최적 반응 조건에서 GA 가교 순서에 따라 트립신을 고정화한 결과, GA 선가교 방법이 GA 후가교 방법보다 트립신 고정화에 더 효과적이며, GA 선가교 방법으로 고정화된 트립신의 활성은 자유 트립신의 약 40%이다. 분광학적 분석과 표면 관찰을 통해 키토산 부직포에 GA가 가교되었고, 트립신이 고정화되었음을 확인하였다.
후속연구
- 본 연구를 통해, 키토산 부직포 담체에 GA를 이용한 트립신의 고정화가 효과적이므로 효소 고정화를 이용한 창상피복재의 개발 가능성을 확인하였다. 또한 후속 연구로 GA 가교한 키토산 부직포의 최적의 트립신 고정화 조건 설정 및 고정화된 트립신의 안정성 평가 등이 필요한 것으로 판단된다. 이러한 결과는 향후 키토산 부직포에 용균효소, 소염효소 등의 효소를 고정화하여 염증 완화, 지혈, 상처 치유의 다양한 기능을 가진 의료용 섬유소재 개발 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 또한 후속 연구로 GA 가교한 키토산 부직포의 최적의 트립신 고정화 조건 설정 및 고정화된 트립신의 안정성 평가 등이 필요한 것으로 판단된다. 이러한 결과는 향후 키토산 부직포에 용균효소, 소염효소 등의 효소를 고정화하여 염증 완화, 지혈, 상처 치유의 다양한 기능을 가진 의료용 섬유소재 개발 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
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