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문제 정의
- 하지만 이 방법의 단점은 핵생성과 결정생성 및 성장 이동시에 일어날 수도 있다는것과 닫힌계를 장시간 안전하게 보존하기 어렵다는 점이다. 이를 보완하기 위해 본 연구에서는 액적기반의 미세유체 시스템을 사용함으로써 이러한 단점을 보완하였다. 그리고 현적법과는 달리 단백질 수용액과 침전제 수용액의 직접적인 액-액 반응으로 결정화를 수행하였다.
제안 방법
- Fig. 1에서보듯이 wafer 위에 flow-focusing을위한양각패턴을새기기 위해 먼저 wafer 위에 PR액을 덜어내고 패턴의 높이를 70 µm로 만들기위해 1950 rpm으로 30초간 spin coating을하고, photolithography 과정을 통해 반영구적으로 실리콘 몰드를 만들 수 있게 하는 마스터 웨이퍼를 제작하고, softlithography를 통해 패턴이 음각화 된 PDMS 몰드를 제작하였다.
- Fig. 9A에서 D는 pH 7.2에서 십자몰드 내부에 액적을 1개및 2개를 넣어 관찰한 결과이고, 한 몰드에는 부피가 큰 액적을 올려 관찰하였다(Fig. 9C). 1개의 액적이 들어 있는 몰드에서는 2시간 후에 처음으로 결정을 관찰할 수 있었고, 결정이 형성됨에 따라 액적의 부피가 감소했음을 알 수 있었다.
- Wafer에 부은 PR액의 수분제거를 위한 가열교반기는 NDK-1K (ASONE, Japan)을 이용했으며, 패턴부분 이외의 UV가조사되지않은 PR을 제거하는 현상과정을 GLIPS-G (Global lab, Korea)를 사용했다. PDMS 표면의 O2 플라즈마처리는 PLASMA CLEANER (HARRICK PLASMA, USA)로 수행하였다.
- Si-wafer 위의패턴의 높이를 조절하기 위해 spin 1200D (MIDAS, England)로 spin coating을 하였고, 양각패턴 형성을 위한 UV 조사기(aligner)로는 MDA-400M-06 (MIDAS, England)를 사용했다. Wafer에 부은 PR액의 수분제거를 위한 가열교반기는 NDK-1K (ASONE, Japan)을 이용했으며, 패턴부분 이외의 UV가조사되지않은 PR을 제거하는 현상과정을 GLIPS-G (Global lab, Korea)를 사용했다.
- Si-wafer 위의패턴의 높이를 조절하기 위해 spin 1200D (MIDAS, England)로 spin coating을 하였고, 양각패턴 형성을 위한 UV 조사기(aligner)로는 MDA-400M-06 (MIDAS, England)를 사용했다. Wafer에 부은 PR액의 수분제거를 위한 가열교반기는 NDK-1K (ASONE, Japan)을 이용했으며, 패턴부분 이외의 UV가조사되지않은 PR을 제거하는 현상과정을 GLIPS-G (Global lab, Korea)를 사용했다. PDMS 표면의 O2 플라즈마처리는 PLASMA CLEANER (HARRICK PLASMA, USA)로 수행하였다.
- 4 µl/min으로 하여 동시에 주입하였다. 관찰 및 이미지 촬영은 광학현미경에 연결된 컴퓨터를 통해 수행하였다.
- 0 ml 부피의 주사기에 담아 펌프(Harvard, USA)를 통해 반응기에 주입했고, 액적형성 및 결정화 과정은 PC에 연결된 광학 현미경(Nikon, Japan)으로 관찰하였다. 관찰 중 얻은 이미지는 Image-pro plus (Media cybernetics, CA, USA) 프로그램을 통해 분석하였다.
- 액적의 안정성을 위해 페트리디쉬의 바닥과 각각 몰드의 내부에도 오일을 채웠다. 그 후, 오일의 증발을 막기 위해 페트리디쉬는 뚜껑을 덮고, 십자몰드는 커버 글라스로 덮고 결정화과정을 관찰하였다.
- 이를 보완하기 위해 본 연구에서는 액적기반의 미세유체 시스템을 사용함으로써 이러한 단점을 보완하였다. 그리고 현적법과는 달리 단백질 수용액과 침전제 수용액의 직접적인 액-액 반응으로 결정화를 수행하였다.
- 5 cm 페트리 디쉬 내부와 액적을 고정시킬 수 있는 웰 몰드 내에 액적을 넣어 관찰함으로써 장치 외부에서 관찰하는 오프칩 (off-chip) 방법을 이용하였다. 따라서 액적생성 및 액적관찰로 분류되는 두 단계의 실험을 통해 수행하였다.
- 최근까지 액적 기반의 미세유체 장치를 통해 수행된 단백질결정화 연구는 주로 T-junction 방법에 의한 것이었다. 또한 장치의 외부에 유리모세관을 연결하여 액적을 유리모세관 내에 넣음으로써 온칩(on-chip)의 방법으로 결정을 관찰하였다. 이로써 현적법의 단점 인장 시간 관찰 및 급진적인 반응의 문제는 해결할 수 있었으나 단백질 결정의 핵생성 및 결정의 성장과정을 시간에 따라 관찰하지 못했다.
- 라이소자임 단백질 결정화실험에 현적법 또는 미세유체 시스템의 온칩방법과는 다르게 액적기반의 미세유체 시스템 중 오프칩방법을 적용시켜 액적의 pH가 4.8일때와 7.2일때의 결정생성을 비교하였다.
- 액-액 반응을 위한 분산상 라이소자임(Sigma Aldrich, USA) 수용액과 염화나트륨(Duksan, Korea) 수용액을 3차 증류수로 제조했다. 라이소자임결정화 실험을 위해 pH 4.8, 7.2인 완충용액으로 제조하기 위하여 0.1 M 아세트산 나트륨(Duksan, Korea) 용액을 만들고 염화수소(Oriental Chemical Industries, Korea)로 적정하였다. 라이소자임 완충용액의 농도는 0.
- 2의 수용액으로 만들어 페트리디쉬와 몰드 내에서 관찰하여 결과를 비교하였다. 먼저 pH 4.8 용액으로만든 액적을 페트리디쉬와 몰드에 각각 보관하여 차이를 비교하였다. 외부에 연결된 tube로 페트리디쉬에 옮긴 결과 Fig.
- 먼저 액적생성을 위해 Fig. 3와 같은 flow-focusing 장치의 inlet 3에 연속상인 미네랄오일을 연결하고, inlet 1과 2에는 각각 분산상인라이소자임 완충용액과 염화나트륨 완충용액을 연결하였다. 오일유속은 0.
- 본 실험에서는 150 µm 직경의 액적을 생성하기 위해 inlet 3과 inlet 1,2의 유속비율을 5:4, 유속은 0.5:0.4 µl/ min으로 하였다.
- 샘플은 1.0 ml 부피의 주사기에 담아 펌프(Harvard, USA)를 통해 반응기에 주입했고, 액적형성 및 결정화 과정은 PC에 연결된 광학 현미경(Nikon, Japan)으로 관찰하였다. 관찰 중 얻은 이미지는 Image-pro plus (Media cybernetics, CA, USA) 프로그램을 통해 분석하였다.
- 액적을 pH 4.8과 7.2의 수용액으로 만들어 페트리디쉬와 몰드 내에서 관찰하여 결과를 비교하였다. 먼저 pH 4.
- 유로 내에 지배적으로 흐르는 연속상이 소수성이기 때문에 유로내벽을 소수성화 시킴으로써 생성되는 액적의 안정성을 높일 수 있다. 이를 위해 채널이 없는 평평한 PDMS를 따로 제작하여 채널이 있는 PDMS 몰드와 평평한 PDMS를 O2 플라즈마 처리를 통해 표면의 친수성으로의 일시적인 개질을 이용하여 접합시키고, 다시 소수 성으로 되돌리기 위해 약 24시간 정도 상온에 보관하였다.
대상 데이터
- 미세유체 장치를 만들기 위해 Si-wafer (K1 solution, Korea)와 wafer 위에 양각패턴을 새기기 위해 사용한 PR (photoresist)은 SU-8 (NIPPON KAYAKU, Japan)과 SU-8 developer (NIPPON KAYAKU, Japan)를 사용했고, PDMS (polydimethylsiloxane)으로 이루어지는 반응기(chip) 및 웰 몰드를 제조하기 위해 SYLGARD® 184 silicone elastomer base (Dow Corning, USA)와 SYLGARD® 184 silicone elastomer curing agent (Dow Corning, USA)를 사용하였다.
- 사용한 단백질은 라이소자임(lysozyme)이며, 침전제(salt)는 NaCl을 사용하였다. 라이소자임은 난백 단백질의 일종이며, 난백 중 함유량이 0.
- 액-액 반응을 위한 분산상 라이소자임(Sigma Aldrich, USA) 수용액과 염화나트륨(Duksan, Korea) 수용액을 3차 증류수로 제조했다. 라이소자임결정화 실험을 위해 pH 4.
- 025 wt%, 염화나트륨 완충용액의 농도는 10 wt%로 제조하였다[17]. 연속상은 SPAN80(Sigma Aldrich, USA)을 2 wt% 섞은 미네랄오일(Sigma Aldrich, USA)를 사용하였다[18].
이론/모형
- 본 연구에서는 기계적인 제어가 용이한 액적기반 시스템을 활용하였다. 액적은 기능성 콜로이드 입자로써 의학, 나노기술, 바이오기술 등을 위해 다양하게 설계되고 있고[9], 여러 가지 기능을 삽입할 수 있는 다중 액적생성기술도 개발되었다[10].
- 이 문제들을 해결하기 위해 우선 액적을 T-junction보다 더 안정하게 생성하기 위해 flow-focusing 방법으로 water-in-oil 액적을 만든 후, 직경 3.5 cm 페트리 디쉬 내부와 액적을 고정시킬 수 있는 웰 몰드 내에 액적을 넣어 관찰함으로써 장치 외부에서 관찰하는 오프칩 (off-chip) 방법을 이용하였다. 따라서 액적생성 및 액적관찰로 분류되는 두 단계의 실험을 통해 수행하였다.
성능/효과
- 9C). 1개의 액적이 들어 있는 몰드에서는 2시간 후에 처음으로 결정을 관찰할 수 있었고, 결정이 형성됨에 따라 액적의 부피가 감소했음을 알 수 있었다. 결정형태는 Fig.
- 8A와 같이 모든 액적이 계면활성제의 영향으로 붙어 있었다. 붙어있는 수많은 액적 중 한 부분을 3시간 단위로 관찰한결과, pH가 4.8일 때와는 달리 Fig. 8B의 원형표시와 같이 결정을 3시간 만에 관찰할 수 있었고, 사각형으로 표시한 작은 결정을 포함한 액적도 있었다. 결정형태는 침상형(needle structure)이 었고, 계면에 가까운 곳에서 형성됨을 알 수 있었다.
- 요약하면 Fig. 6과 Fig. 7에서는 pH 4.8일 때 판상형 또는 다면체의 결정이 형성되고, 인접한 액적의 영향을 받아 부피가 증가한 액적 내부에서는 다수의 결정이 형성됨을 알 수 있었다. 또한, 라이소자임 결정은 액적의 중심보다는 표면 근처에서 생성되었다.
- 그리고 큰 액적내부에서 역시 작은 결정형태를 볼 수 있었다. 이로 인해 액적의 크기가 클 때, 액적 내부에 단백질과 침전제의 농도가 변하여 크기가 작을 때보다 결정형성에 용이하고, 다수의 결정이 생성됨을 알 수 있었다. 결정모형의 대부분은 판상형(platelike structure)이었다.
- 페트리디쉬 내부에서 관찰한 결과, 서로 떨어져 있는 액적과 액적이 인접하여 옆 액적에 영향을 주는 현상이 관찰되었다. 두 경우에서 형성된 결정이 크기는 비슷했으나 큰 액적에서 더 많은 결정이 형성되었다.
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