본 연구의 목적은 유류로 오염된 토양으로부터 분리된 고효율 분해균주에 의한 xylene 분해특성을 조사하고 분해과정을 밝히는 것이다. P. putida BJ10에 의해 mineral salts medium (MSM)배지내에서 24시간 배양 후 제거율은 o, m, p-xylene 각각 94, 90, 98%였으며 3% 이하의 대조군과 명확한 차이를 보였다. 또한 유류로 오염된 토양내에서의 9일 경과 후 xylene 제거율은 유류 분해균주 주입구에서 66%였으며 무처리 일반토양에서 32%, 멸균 토양에서 8%로서 P. putida BJ10에 의한 유효성을 확인할 수 있었다. 또한 시간경과에 따른 대사산물을 분석한 결과 o-xylene의 분해 경로에서는 6시간 경과 후 3-methylcatechol, 24시간 경과 후 o-toluic acid 가 분해산물로서 검출되어 최종산물로서의 o-toluic acid 가 확인되었으며 중간산물의 변환과정은 기존 발표된 연구들과 다소 다른 결과를 나타내었다.
본 연구의 목적은 유류로 오염된 토양으로부터 분리된 고효율 분해균주에 의한 xylene 분해특성을 조사하고 분해과정을 밝히는 것이다. P. putida BJ10에 의해 mineral salts medium (MSM)배지내에서 24시간 배양 후 제거율은 o, m, p-xylene 각각 94, 90, 98%였으며 3% 이하의 대조군과 명확한 차이를 보였다. 또한 유류로 오염된 토양내에서의 9일 경과 후 xylene 제거율은 유류 분해균주 주입구에서 66%였으며 무처리 일반토양에서 32%, 멸균 토양에서 8%로서 P. putida BJ10에 의한 유효성을 확인할 수 있었다. 또한 시간경과에 따른 대사산물을 분석한 결과 o-xylene의 분해 경로에서는 6시간 경과 후 3-methylcatechol, 24시간 경과 후 o-toluic acid 가 분해산물로서 검출되어 최종산물로서의 o-toluic acid 가 확인되었으며 중간산물의 변환과정은 기존 발표된 연구들과 다소 다른 결과를 나타내었다.
The purpose of this study is to investigate the biodegradation characteristics of the xylene by BTEX-degrading bacteria, Pseudomonas putida BJ10, isolated from oil-contaminated soil and bio-degradation pathway of the xylene. The removal efficiencies of o, m, p-xylene in mineral salts medium (MSM) by...
The purpose of this study is to investigate the biodegradation characteristics of the xylene by BTEX-degrading bacteria, Pseudomonas putida BJ10, isolated from oil-contaminated soil and bio-degradation pathway of the xylene. The removal efficiencies of o, m, p-xylene in mineral salts medium (MSM) by P. putida BJ10 were 94, 90 and 98%, respectively for 24 hours. It shows clear difference compared with the control groups which were below 3%. The removal efficiencies of BTEX by P. putida BJ10 in gasoline-contaminated soil were 66% for 9 days. They were clearly distinguished from the control groups (control and sterilized soil) which were 32 and 8%. 3-methylcatechol and o-toluic acid were detected after 6 and 24 hours during the o-xylene biodegradation pathway. Therefore, we confirmed o-toluic acid as the final metabolite. And intermediate-products were somewhat different with previously published studies of the transformation pathway from o-xylene to 3-methylcatechol.
The purpose of this study is to investigate the biodegradation characteristics of the xylene by BTEX-degrading bacteria, Pseudomonas putida BJ10, isolated from oil-contaminated soil and bio-degradation pathway of the xylene. The removal efficiencies of o, m, p-xylene in mineral salts medium (MSM) by P. putida BJ10 were 94, 90 and 98%, respectively for 24 hours. It shows clear difference compared with the control groups which were below 3%. The removal efficiencies of BTEX by P. putida BJ10 in gasoline-contaminated soil were 66% for 9 days. They were clearly distinguished from the control groups (control and sterilized soil) which were 32 and 8%. 3-methylcatechol and o-toluic acid were detected after 6 and 24 hours during the o-xylene biodegradation pathway. Therefore, we confirmed o-toluic acid as the final metabolite. And intermediate-products were somewhat different with previously published studies of the transformation pathway from o-xylene to 3-methylcatechol.
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문제 정의
(99%) ;1486 bp, API 20NE kit 테스트 결과 Pseudomonas sp. (95%), 지방산 분석(Fatty acid analysis) 결과 Pseudomonas putida biotype A (38.7%)로 동정된 균주를 이용하여 현장 적용 가능성을 알아보고자 하였다.
BTEX 분해효과가 높은 것으로 조사된 균주 Pseudomonas putida BJ10에 의한 분해경로를 알아보기 위하여 시간경과에 따른 xylene 분해산물을 조사하였다.
유류분해균주인 P. putida BJ10에 의한 xylene 분해에 대한 대사과정을 알아보고자 시간경과에 따른 대사산물을 분석해 보았다. o-xylene의 분해 경로에서는 6시간 경과 후 3-methylcatechol, 24시간 경과 후 o-toluic acid가 분해산물로 검출되었다(Fig.
이러한 여러 영향요인들을 고려하여 본 연구에서는 유류로 오염된 토양으로부터 분해균주를 분리하여 그 효과를 알아보고 그 분해특성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
0, 6, 24 hr 단위로 ethylacetate 10 mL로 추출 후 GC-MSD, GC-TOFMS (LECO)로 분석하였으며 필요한 경우 N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide 또는 methylboronic acid 로 Trimethylsilylation 또는 Methane boronation 후 건조하였고 n-hexane 200 µL에 재용해 후 HP-5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm) 컬럼을 이용하여 유속은 1 mL He/min, on-column splitless injection, scan mode, oven temperature 60℃ 2 min 머무름 후 250℃까지 5℃/min로 승온조작 후 250℃ 에서 12 min 머무름 조건으로 분석하였다.
28 ± 2℃에서 7일간 배양 후 순수분리를 위해 Nutrient agar와 사전실험을 통해 균의 성장도가 가장 높게 나타났던 농도인 500 mg/L의 기질이 포함된 1.8% agar를 제작하여 멸균된 백금이를 증식배양된 균액에 담근 후 plate에 선을 그리면서 균액을 희석시켜 균들의 분리를 유도하였다.
o, m, p-xylene 각각의 농도저감 및 탄소원으로서의 이용 여부를 확인하기 위해 추출용매로서 ethylacetate를 10 mL 사용하였으며 농축후 n-hexane 2 mL에 재용해시켜 GC-FID (Agilent 6890) 및 GC-MSD (Agilent 7673N)로 분석하였다.
8% agar를 제작하여 멸균된 백금이를 증식배양된 균액에 담근 후 plate에 선을 그리면서 균액을 희석시켜 균들의 분리를 유도하였다. streak, spread plate method를 이용하여 plate에 균을 접종한 후 매일 colony의 형성을 관찰하여 형성된 colony를 액체배지에 접종하여 배양하여 다음과 같이 성장률 시험을 하였다.
각 균주의 배양액 100 µL를 접종 후 초기의 흡광도를 측정하고 1일 마다 흡광도(600 nm)를 측정(Genequant pro, Amersham bioscience, USA)하였다.
균주의 성장률을 측정하기 위하여 밀폐가 가능한 20 mL tube에 MSM을 10 mL 넣은 후 10 µL microsyringe (Hamilton, U.S.A)를 이용하여 배지에 o, m, p-xylene을 각각 10 mg/L로 오염시켰다.
시험대상 토양 1 kg에 1 g의 비율로 균주를 혼합하였으며 휘발유는 토양 kg 당 200 mL 첨가 후 고르게 혼합하였으며 대조군으로서 120℃에서 12 hr 열건조된 멸균토양(sterilized soil)과 분해 균주를 주입하지 않은 무처리 일반 토양(control)에 대한 실험을 병행하여 그 결과를 비교하고자 하였으며 실험에 사용된 토양의 이화학적 특성은 Table 1과 같다.
유류(xylene)로 오염시킨 토양에 유류오염 토양으로부터 분리, 배양되어 탄화수소를 먹이로 하는 분해미생물(Hydrocarbon-degrading bacteria)을 이용하여 xylene의 분해 특성을 알아보기 위해 시간경과에 따른 토양 내 xylene 함량변화를 조사하였으며 그 결과는 Fig. 2와 같다.
유류로 오염된 토양으로부터 분리된 고효율 분해균주 P. putida BJ10에 의한 유류성분의 분해효과를 확인하고 대사경로를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
유류 분해미생물을 분리하기 위하여 인천소재 A 주유소의 지하에서 BTEX에 오염된 토양을 채취하였으며 100 mL의 minal salts medium (MSM)이 포함된 500 mL bottle에 일정량의 BTEX를 넣은 후 1.0 g (wet weight)의 토양을 넣어 주었다. 28 ± 2℃에서 7일간 배양 후 순수분리를 위해 Nutrient agar와 사전실험을 통해 균의 성장도가 가장 높게 나타났던 농도인 500 mg/L의 기질이 포함된 1.
이론/모형
배양액 중 o, m, p-xylene의 함량분석은 토양오염공정시험기준10)에 따랐으며 실험에 이용된 토양의 이화학적 특성 중 영양성분에 대한 분석은 EPA method301511)에 따랐다.
성능/효과
1) P. putida BJ10에 의해 MSM 배지내에서 24시간 배양 후 제거율은 o, m, p-xylene 각각 94, 90, 98%였으며 3% 이하의 대조군과 명확한 차이를 보였다.
2) 분해균주의 유효성을 확인하기 위해 멸균 토양, 무처리 일반토양 그리고 분해균주 주입 토양을 비교한 결과 xylene 제거율은 분해 미생물 주입 66%, 대조군 32% 그리고 멸균 토양 8%였으며 분해균주에 의한 유효성검정 결과 6일 이후부터 9일차까지 유의확률(Significant, 2-tailed) 0.000 (p < 0.05)로서 통계적으로 유의한 차이를 보였다.
3) 시간경과에 따른 대사산물을 분석한 결과 o-xylene의 분해 경로에서는 6시간 경과 후 3-methylcatechol, 24시간 경과 후 o-toluic acid가 분해산물로 검출되었다.
분해균주에 의한 유효성을 확인하기 위해 분해균주를 주입하지 않은 무처리 일반배지(control)내 xylene 함량과 비교한 결과 o, m, p-xylene 모두 분해 미생물 주입실험 결과와 대조군간에 유효한 차이를 확인할 수 있었다. 각각 10 mg/L의 o, m, p-xylene은 유류분해균주인 P. putida BJ10에 의해 24시간 배양 후 0.6, 0.9, 0.1 mg/L로 저감되어 제거율은 각각 94, 90, 98%로 조사되었으나 분해균주 무처리 구간에서는 24시간 배양 전후 유효한 저감효과가 관찰되지 않았다.
또한 토양내 주입된 분해균주에 의한 xylene 분해효과가 통계적으로 유의한 여부를 알아보기 위해 통계 페키지(SPSS)에 의한 유효성검정(독립표본 t검정) 결과 Table 2에서와 같이 경과일 6일 이후부터 9일차까지 유의확률 0.000 (p < 0.05, Significant, 2-tailed)으로서 통계적으로 유의한 차이를 보였다.
분해균주에 의한 유효성을 확인하기 위해 멸균 토양(sterilized soil)과 분해균주를 주입하지 않은 무처리 일반토양(control) 그리고 분해균주를 주입한 토양(mixed bacteria) 세 가지를 비교한 결과 혼합 분해 미생물 주입실험 결과 xylene의 제거율은 66%, 대조군 32% 그리고 멸균토양이 8%로서 분해균주에 의한 xylene의 제거효율이 높게 나타났다. 또한 토양내 주입된 분해균주에 의한 xylene 분해효과가 통계적으로 유의한 여부를 알아보기 위해 통계 페키지(SPSS)에 의한 유효성검정(독립표본 t검정) 결과 Table 2에서와 같이 경과일 6일 이후부터 9일차까지 유의확률 0.
분해균주에 의한 유효성을 확인하기 위해 분해균주를 주입하지 않은 무처리 일반배지(control)내 xylene 함량과 비교한 결과 o, m, p-xylene 모두 분해 미생물 주입실험 결과와 대조군간에 유효한 차이를 확인할 수 있었다. 각각 10 mg/L의 o, m, p-xylene은 유류분해균주인 P.
본 실험에서는 중간산물 및 최종산물로서 기존에 알려진 대사산물들은 24시간의 배양기간 동안 검출되지 않았다. 하지만 p-xylene과 m-xylene의 농도저감(제거율)은 98, 90%로 확인되었으며 GC-MSD로 분석결과 배양기간 중 대사산물의 TIC(Total ion chromatogram)를 분석한 결과 알려져 있지 않은 미지의 물질이 생성되는 것으로 보여지며 수정된 유도체화 방법(Derivatization Method)의 적용과 변형된 검출방법을 적용해야 할 것으로 생각된다.
후속연구
그러나 이러한 난분해성 물질들을 분해할 수 있는 미생물들이 자연계에 존재하고 있으며 이들을 분리하여 효율을 최대화한다면 경제적이며 효과적으로 처리할 수 있다.2,3) 따라서 이러한 오염물질들에 대해 분해능이 우수한 미생물을 분리하여 오염된 현장에 효과적으로 적용될 때 오염물질은 유용한 탄소원으로 이용될 수 있을 것이다.
결과적으로 초기에는 xylene의 휘발을 방지하기 위한 조치가 필요하지만 휘발기능이 줄어드는 일정기간 후 적절한 산소 공급 과정을 부과함으로서 더 높은 xylene 분해효율을 얻을 수 있을 것이다.
이상의 결과로 볼 때 토양내에서의 더 나은 제거 효율을 유지하기 위해 토성에 따른 적정 공기공급 외에 대사 과정에서 생성되는 독성 부산물에 대한 제어, 미생물에 필요한 토양 수분함량의 유지, 그리고 유기, 무기 영양성분의 적절한 혼합 등이 고려되어야 하며 xylene 대사과정의 조사를 위한 더 나은 분석방법과 세밀한 조사가 필요한 것으로 나타났다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
가솔린은 어디에 대표적인 물질인가?
가솔린은 원유생산물의 대표적인 물질로서 다양한 탄화수소로 구성되며 연료로서 요구되는 성능과 환경 규제기준에 따라 정제시 그 성분함량이 조정된다. 가솔린의 18% (wt.
방향족 탄화수소들은 무슨 물질들인가?
특히 이들 방향족 탄화수소들은 난분해성 물질들로서 장시간 자연계에 남아서 유해한 요인으로 작용할 수 있다. 그러나 이러한 난분해성 물질들을 분해할 수 있는 미생물들이 자연계에 존재하고 있으며 이들을 분리하여 효율을 최대화한다면 경제적이며 효과적으로 처리할 수 있다.
방향족 탄화수소를 가장 효율적으로 분해하는 방법은?
특히 이들 방향족 탄화수소들은 난분해성 물질들로서 장시간 자연계에 남아서 유해한 요인으로 작용할 수 있다. 그러나 이러한 난분해성 물질들을 분해할 수 있는 미생물들이 자연계에 존재하고 있으며 이들을 분리하여 효율을 최대화한다면 경제적이며 효과적으로 처리할 수 있다.2,3) 따라서 이러한 오염물질들에 대해 분해능이 우수한 미생물을 분리하여 오염된 현장에 효과적으로 적용될 때 오염물질은 유용한 탄소원으로 이용될 수 있을 것이다.
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