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문제 정의
- 반면에, 엽록소 형광을 이용한 분석은 광합성 기구 중에서도 광계Ⅱ의 반응을 조사하기 위한 비파괴적이고 객관적으로 신뢰할 수 있는 측정 방법이다 (Strasser와 Strasser, 1995). 따라서 본 연구에서는 토양과 담수 생태계에 서식하는 소식 물체이면서 부유성 선태식물인 은행이끼(Ricciocarpos natans (L.) Corda)를 대상으로 카드뮴에 대한 엽록소 형광 이미지, O-J-I-P 분석 및 항산화효소의 활성 등의 분석을 수행하여, 카드뮴 독성을 조기에 진단하기 위한 환경지표종으로서의 가치와 엽록소형광 변수들의 환경지표로서의 활용 가능성을 살펴보았다.
- 본 연구는 선태식물이면서 부유성 소식물체인 은행이끼(Ricciocarpos natans (L.) Corda)의 카드뮴에 대한 반응을 엽록소형광 이미지분석과 O-J-I-P 분석을 통하여 조사하고 엽록소형광 변수들의 환경지표로서의 활용가능성을 살펴보았다. Fv/Fm 이미지는 카드뮴 처리 후 48시간이 경과하면서부터 변하기 시작하였다.
- 엽록소형광 이미지는 잎 조직 내 광합성 능력의 공간적인 분포를 모니터링하는데 이용할 수 있으며, 특히 암적응 후의 Fv/Fm 이미지를 통해 육안으로는 볼 수 없는 잎 내부의 생리적 피해정도를 확인할 수 있다(Nedbal과 Whitmarsh, 2004). 본 연구에서는 식물의 카드뮴에 대한 내성 여부와 생리적 특성을 파악하기 위해 은행이끼를 대상으로 카드뮴의 농도를 달리하여 1일 간격으로 5일 동안 배양하면서 처리시간별로 Fv/Fm 이미지의 변화를 조사하였다(Fig. 1). 그 결과, 10 μM 카드뮴에서는 배양기간 동안 카드뮴 독성을 뚜렷하게 관찰할 수 없었다.
제안 방법
- O-J-I-P 곡선의 분석으로 8개의 기본적 형광변수 (Fo, Fm, Fv/Fo, VJ, VI, Mo, Sm, N)들을 산출하였으며, 이를 토대로 다시 구조적 변수 (structural parameters: RC/CS, ΦPO, ΨO, ΦEO 등)와 기능적 변수 (functional parameters: ABS/CS, TRo/CS, ETo/CS, DIo/CS 등) 들을 산출하였다 (Table 1).
- Peroxidase활성은 Rao 등(1996)의 방법을 변형하여 검출하였다. 전기영동이 끝난 겔을 10 mM H2O2를 함유하는 50 mM potassium phosphate 완충용액(pH 7.
- Plants were incubated in liquid medium containing different CdCl2 concentration (0, 10, 50 and 100 μM CdCl2) for 3 days.
- 그리고, ΦPSⅡ (quantum efficiency of PSⅡ), QP (photochemical quenching), QN (non-photochemical quenching), Rfd (variable chl fluorescence decrease ratio) 등의 이미지도 함께 제시하였다.
- O-J-I-P 곡선의 분석으로 8개의 기본적 형광변수 (Fo, Fm, Fv/Fo, VJ, VI, Mo, Sm, N)들을 산출하였으며, 이를 토대로 다시 구조적 변수 (structural parameters: RC/CS, ΦPO, ΨO, ΦEO 등)와 기능적 변수 (functional parameters: ABS/CS, TRo/CS, ETo/CS, DIo/CS 등) 들을 산출하였다 (Table 1). 그리고, 측정된 형광변수 들을 토대로 광계Ⅱ에서의 에너지 흐름의 변화를 pipeline model로 제시하였다.
- 활성산소에 대한 식물의 방어기작은 활성산소의 형성을 억제하거나 생성된 활성산소를 제거하는 것인데, peroxidase, catalase, superoxide dismutase 등의 효소에 의한 방어 기작과 ascorbate, carotenoid 등의 항산화물질에 의한 방어기작으로 구분할 수 있다(Alscher와 Hess, 1993; Inze와 Van Montagu, 1995). 본 연구에서는 카드뮴 스트레스에 대한 은행이끼의 항산화 반응을 알아보기 위하여 peroxidase와 catalase 등 항산화효소의 활성 패턴을 전기영동으로 조사하여 비교하였다(Fig. 3과 4). Peroxidase isoenzyme은 전체적으로 6개의 밴드가 검출되었으며, 이들 isoenzyme들은 카드뮴 농도가 증가함에 따라 그 활성이 점차 감소하는 양상을 보였으나, 카드뮴에 의해 특이적으로 유도되는 isoenzyme은 관찰되지 않았다(Fig.
- 식물체가 빛, 온도, 수분 또는 화학적 스트레스 등에 의해 영향을 받았을 때, O-J-I-P 곡선의 양상은 변하게 된다. 일정한 배양환경에서 생육하고 있는 은행이끼를 대상으로 카드뮴의 농도를 달리하여 처리한 후 O-J-I-P 곡선(Fig. 5)과 이를 토대로 산출한 형광변수들을 제시하였다 (Fig. 6과 Table 2). O-J-I-P 곡선에서 카드뮴 농도가 증가할수록 J, I, P값이 크게 감소하고 있으며, 특히 10 μM 이하의 저농도의 카드뮴 하에서도 형광세기가 감소하였다 (Fig.
- 전기영동은 Laemmli(1970)의 방법을 변형하여 native gel 조건에서 실시하였다. 전기영동 시료는 효소액을 동량의 시료용 완충용액(125 mM Tris-HCl, pH 6.
- 전기영동이 끝난 겔을 10 mM H2O2를 함유하는 50 mM potassium phosphate 완충용액(pH 7.8)에 10분 동안 담근 후 1.4 mM 3,3´-diaminobenzidine tetrahydrochloride 용액에 담가 어두운 곳에서 반응시켜 나타나는 밴드를 조사하였다.
- Catalase활성의 검출은 Woodbury 등 (1971)의 ferricyanide 염색법을 사용하여 실시하였다. 전기영동이 끝난 겔을 3.27 mM H2O2가 들어있는 증류수에 넣어 암상태에서 10분간 반응시킨 후 3.7 mM ferric chloride-3 mM potassium ferricyanide 용액에 넣어 5～10분간 반응시켜 나타나는 밴드를 조사하였다.
- 즉, 15분간 광을 차단하여 암적응시킨 식물의 잎에 1,500 μmole/㎡/sec의 saturation light와 100 μmole/㎡/sec의 actinic light를 조사하고 quenching analysis 로 엽록소형광을 유도하였다.
- 즉, 15분간 광을 차단하여 암적응시킨 식물의 잎에 1,500 μmole/㎡/sec의 광량을 1초간 조사하여 O-J-I-P 곡선을 유도하였다.
- 카드뮴의 영향을 알아보기 위하여 배양액에 최종 농도가 0, 10, 50, 100 μM이 되도록 카드뮴을 첨가하여 동일한 광조건 하에서 5일간 배양하였으며, 모든 실험은 3회 반복하였다.
- 즉, 15분간 광을 차단하여 암적응시킨 식물의 잎에 1,500 μmole/㎡/sec의 saturation light와 100 μmole/㎡/sec의 actinic light를 조사하고 quenching analysis 로 엽록소형광을 유도하였다. 포화광을 쪼인 후 1,000㎳와 3,960 ㎳에서 방출되는 형광을 CCD 카메라로 포획하여 각각 Fo와 Fm의 형광이미지로 나타내었으며, 이로부터 Fv/Fm의 형광이미지를 산출하여 제시하였다. 그리고, ΦPSⅡ (quantum efficiency of PSⅡ), QP (photochemical quenching), QN (non-photochemical quenching), Rfd (variable chl fluorescence decrease ratio) 등의 이미지도 함께 제시하였다.
대상 데이터
- 배지는 KNO3(202 ㎎/ℓ), KH2PO4(50.3 ㎎/ℓ), K2HPO4(27.8 ㎎/ℓ), K2SO4(17.4 ㎎/ℓ), MgSO4·7H2O(49.6 ㎎/ℓ), CaCl2·2H2O(11.1 ㎎/ℓ), FeSO4·7H2O(6 ㎎/ℓ), H3BO3(5.72㎎/ℓ), MnCl2·4H2O(2.82 ㎎/ℓ), ZnSO4․7H2O(0.6㎎/ℓ), (NH4)Mo7O24·4H2O(0.043 ㎎/ℓ), CuCl2·2H2O(0.078 ㎎/ℓ), CoCl2·6H2O(0.054 ㎎/ℓ) 등을 함유하도록 조제하였다.
- 항온기에서 배양중인 은행이끼(Ricciocarpos natans(L.) Corda)를 대상으로 엽색이 균일한 상태의 식물체를 선별하여 실험재료로 사용하였다. 배양액은 Chollet(1993)의 방법에 의해 조제한 후, pH를 6.
이론/모형
- 4 mM 3,3´-diaminobenzidine tetrahydrochloride 용액에 담가 어두운 곳에서 반응시켜 나타나는 밴드를 조사하였다. Catalase활성의 검출은 Woodbury 등 (1971)의 ferricyanide 염색법을 사용하여 실시하였다. 전기영동이 끝난 겔을 3.
- O-J-I-P 곡선은 Plant Efficiency Analyzer (PEA; Hansatech Instrument Ltd., UK)를 이용하여 측정하였다 (Strasser와 Strasser, 1995). 즉, 15분간 광을 차단하여 암적응시킨 식물의 잎에 1,500 μmole/㎡/sec의 광량을 1초간 조사하여 O-J-I-P 곡선을 유도하였다.
- ) Corda)를 대상으로 엽색이 균일한 상태의 식물체를 선별하여 실험재료로 사용하였다. 배양액은 Chollet(1993)의 방법에 의해 조제한 후, pH를 6.5로 조정하고 멸균하여 사용하였다. 배지는 KNO3(202 ㎎/ℓ), KH2PO4(50.
- 형광이미지는 Nedbal 등 (2000)의 방법에 따라 Imaging Fluorometer (FluorCam 700MF, Photon System Instruments, Czech)를 이용하여 분석하였다. 즉, 15분간 광을 차단하여 암적응시킨 식물의 잎에 1,500 μmole/㎡/sec의 saturation light와 100 μmole/㎡/sec의 actinic light를 조사하고 quenching analysis 로 엽록소형광을 유도하였다.
성능/효과
- 3). Catalase는 단일 밴드로 검출되었으며 그 활성은 대조구에 비해 카드뮴 스트레스 하에서 다소 높은 것으로 나타났다(Fig. 4). 항산화효소들은 스트레스에 의해 생성되는 활성산소종을 제거하는 기능을 가지고 있으며, 저분자 항산화제와 마찬가지로 스트레스 하에서의 식물의 생존 또는 내성과 관련이 있다(Foyer 등, 1991).
- ETo/CS도 카드뮴 농도가 증가할수록 감소하여 광계Ⅱ에 포획된 에너지의 대부분이 전자전달로 사용되지 않고 버려지고 있음을 알 수 있으며, 50 μM과 100 μM 카드뮴 처리구에서 각각 77.3%와 48.5%로 크게 감소하였다.
- Fm, Fo와 Rfd도 Fv/Fm과 같이 고농도의 카드뮴에서 이미지가 뚜렷하게 변화하였으며, ΦPSⅡ와 QP는 고농도에서는 물론 10 μM의 저농도에서도 이미지의 변화를 뚜렷하게 관찰할 수 있었다.
- 이는 카드뮴에 의한 독성이 잎조직의 광계Ⅱ의 반응중심에 손상을 입힌 결과로 볼 수 있다. Fv/Fm 이미지는 처리 후 48시간이 경과하면서부터 카드뮴 영향이 뚜렷하게 나타나기 시작하였으며, 고농도의 카드뮴에 노출되었을 때에는 직접적으로 노출된 잎 가장자리에서부터 서서히 형광이미지가 변하고 있음을 확인할 수 있다. 그리고 카드뮴 농도에 의한 차이는 72시간이 경과되었을 때 뚜렷하게 나타났다.
- O-J-I-P 곡선의 패턴을 보면, 카드뮴 농도가 증가할수록 J, I, P 값이 큰 폭으로 떨어지고 있다. O-J-I-P 분석으로부터 산출된 형광변수들 중에 Fm, Fv/Fo, Sm, SFIabs, PIabs, ETo/CS 값의 감소와 Mo, Kn 값의 증가는 다른 형광변수들에 비해 뚜렷하게 나타났다. 카드뮴 스트레스에 의한 peroxidase와 catalase 등 항산화효소의 활성을 살펴보면, 카드뮴 농도가 증가할수록 peroxidase 활성은 감소하였으며, catalase 활성은 증가하는 패턴을 보였다.
- 1에서 보는 바와 같이 광계Ⅱ의 광합성효율, 즉 Fv/Fm의 감소를 야기한다. O-J-I-P 분석을 통해 산출된 형광변수들 중에서 Fo, Fm, Fv/Fo, Sm, N은 카드뮴 농도가 증가할수록 점차 감소하였고, Mo는 오히려 크게 증가하였다 (Fig. 6A). 특히, Fm, Fv/Fo, Sm 값의 감소와 Mo값의 증가는 다른 형광변수들에 비해 뚜렷하게 나타났다.
- 3과 4). Peroxidase isoenzyme은 전체적으로 6개의 밴드가 검출되었으며, 이들 isoenzyme들은 카드뮴 농도가 증가함에 따라 그 활성이 점차 감소하는 양상을 보였으나, 카드뮴에 의해 특이적으로 유도되는 isoenzyme은 관찰되지 않았다(Fig. 3). Catalase는 단일 밴드로 검출되었으며 그 활성은 대조구에 비해 카드뮴 스트레스 하에서 다소 높은 것으로 나타났다(Fig.
- 카드뮴 스트레스에 의한 peroxidase와 catalase 등 항산화효소의 활성을 살펴보면, 카드뮴 농도가 증가할수록 peroxidase 활성은 감소하였으며, catalase 활성은 증가하는 패턴을 보였다. 결론적으로 은행이끼는 카드뮴에 민감하게 반응하여 환경지표식물로 활용이 가능할 것으로 보이며, 스트레스 하에서 뚜렷하게 증가하거나 감소하는 형광변수들(Fm, Fv/Fo, Sm, SFIabs, PIabs, ETo/CS, Mo, Kn)을 이용하여 카드뮴 스트레스에 대한 식물의 생리적 상태를 정량적으로 진단할 수 있을 것으로 보인다.
- 광계Ⅱ의 에너지 흐름을 나타내는 변수들 중에 ABS/CS는 카드뮴에 의한 통계적으로 유의한 차이는 없으나, TRo/CS와 ETo/CS는 카드뮴 농도의 증가에 따라 뚜렷하게 감소하였으며, DIo/CS는 100 μM 카드뮴 처리구에서 증가하였다 (Table 2).
- 그 결과, 10 μM 카드뮴에서는 배양기간 동안 카드뮴 독성을 뚜렷하게 관찰할 수 없었다.
- 또한 활력도를 나타내는 변수들 중에 Ψo, ΦEO, PIabs, PIabs, RC/ABS 등 5개의 형광변수는 카드뮴 농도의 증가에 따라 크게 감소하였으며, Kn은 뚜렷하게 증가하였다 (Fig. 6B).
- ) 등에서도 카드뮴에 의한 잎이나 뿌리의 발달 저해, 생체량이나 건체량의 감소 등이 보고된 바 있다(Abu-Muriefah, 2008; Mahmood 등, 2007; Zheng 등, 2010). 본 연구에서 은행이끼도 카드뮴 스트레스가 잎의 황백화 현상을 야기할 뿐만 아니라 뿌리 조직에도 영향을 미쳐 식물의 생육을 저해하였다. 그러나 저농도에서 카드뮴의 독성을 육안으로 판별하기에는 어려움이 있으며 고농도에서도 다소 긴 시간이 소요되었다.
- )에서 카드뮴 내성 세포에서는 peroxidase 활성이 증가하고 catalase 활성이 감소하는데 반해, 감수성 세포에서는 반대로 peroxidase 활성이 감소하고 catalase 활성이 증가하는 것으로 보고되었다(Gzyl 등, 2009). 본 연구에서도 은행이끼는 카드뮴 농도가 증가함에 따라 peroxidase 활성은 점차 감소하고 catalase 활성은 다소 증가하여 카드뮴의 영향을 받고 있음을 알 수 있다. 이는 은행이 끼가 카드뮴에 의해 산화적 스트레스를 받고 있으며 그로 인해 잎조직의 세포사멸이 일어나 점차 황백화가 일어나는 것으로 해석할 수 있다.
- 2). 이러한 결과로부터 형광이미지의 분석은 황백화 현상 등 가시적인 징후가 발현되기 전에 카드뮴 독성을 신속하게 평가할 수 있고 동시에 시각적으로 확인이 가능하여 스트레스에 대한 식물 징후의 조기 진단에 유용하게 활용될 수 있음을 보여주고 있다. 이들 변수들의 변화는 옥수수(Zea mays L.
- 이상의 연구결과로부터 은행이끼는 현재 지표식물로 널리 활용되고 있는 개구리밥(Spirodela polyrhiza (L.) Schleid.)이나 좀개구리밥 등과 마찬가지로 크기가 작고 배양환경을 인위적으로 조절하기가 쉬울 뿐만 아니라 카드뮴의 영향을 받기 때문에 실험실에서 카드뮴 독성을 진단하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 보인다.
- 즉, 50 μM과 100 μM의 카드뮴 처리구에서 RC/CS가 대조구에 비해 각각 69.8%와 61.0%로 감소하였다.
- O-J-I-P 분석으로부터 산출된 형광변수들 중에 Fm, Fv/Fo, Sm, SFIabs, PIabs, ETo/CS 값의 감소와 Mo, Kn 값의 증가는 다른 형광변수들에 비해 뚜렷하게 나타났다. 카드뮴 스트레스에 의한 peroxidase와 catalase 등 항산화효소의 활성을 살펴보면, 카드뮴 농도가 증가할수록 peroxidase 활성은 감소하였으며, catalase 활성은 증가하는 패턴을 보였다. 결론적으로 은행이끼는 카드뮴에 민감하게 반응하여 환경지표식물로 활용이 가능할 것으로 보이며, 스트레스 하에서 뚜렷하게 증가하거나 감소하는 형광변수들(Fm, Fv/Fo, Sm, SFIabs, PIabs, ETo/CS, Mo, Kn)을 이용하여 카드뮴 스트레스에 대한 식물의 생리적 상태를 정량적으로 진단할 수 있을 것으로 보인다.
후속연구
- ) Schleid.)이나 좀개구리밥 등과 마찬가지로 크기가 작고 배양환경을 인위적으로 조절하기가 쉬울 뿐만 아니라 카드뮴의 영향을 받기 때문에 실험실에서 카드뮴 독성을 진단하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 보인다. 그리고 형광이미지의 분석은 황백화 현상 등 가시적인 징후가 발현되기 전에 신속하게 카드뮴 독성을 평가할 수 있고 시각적 표시가 가능하나 객관적 평가에 한계가 있음을 알 수 있다.
- 그러나, Fm, Fo와 Rfd 등은 고농도의 카드뮴에서는 진단이 용이하지만 10 μM 이하의 저농도에서는 그 독성을 판별하는데 어려움이 있을 것으로 보이며, ΦPSⅡ와 QP는 10 μM 이하의 낮은 농도에서도 카드뮴 스트레스에 민감하여 그 독성을 조기에 진단하는 데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 보인다.
- 그리고 형광이미지의 분석은 황백화 현상 등 가시적인 징후가 발현되기 전에 신속하게 카드뮴 독성을 평가할 수 있고 시각적 표시가 가능하나 객관적 평가에 한계가 있음을 알 수 있다. 그렇지만 O-J-I-P분석을 통해 산출된 Fm, Fv/Fo, Sm, SFIabs, PIabs, ETo/CS, Mo와 Kn 등은 카드뮴 스트레스 하에서 뚜렷하게 변화하여 카드뮴 스트레스에 대한 식물의 생리적 상태를 정량적으로 진단하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 보인다.
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