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문제 정의
- 따라서 본 실험을 통해 시스플라틴으로 유발된 급성신부전에서 면역염색과 Western blot을 통해 Klotho와 급성신부전의 진행에 관여하는 사이토카인인 TNFα, NF-κB, TWEAK의 발현 위치 및 부위별 발현 양상에 대해 알아보고자 한다.
- 과량의 시스플라틴은 세뇨관 세포에 직접 손상을 입혀 산화스트레스를 유발하고 활성산소를 증가시켜 세포사멸을 일으키며 연쇄적인 염증 반응에 인한 콩팥 손상으로 신부전을 발생시키는 것으로 알려졌다 [1, 12]. 본 실험에서는 혈중요소질소과 크레아티닌의 농도를 측정하여 콩팥 기능의 저하 여부를 확인하였다. 혈중요소질소와 크레아티닌은 콩팥의 상태를 나타내는 지표로, 혈중요소질소는 7~21 mg/dL, 크레아티닌은 0.
제안 방법
- ApoTag Peroxidase In situ Apoptosis Detection kit(Millipore, USA)를 이용하여 TUNEL 염색을 하였다. 조직 절편은 자일렌을 통해 polyester wax를 제거하였고, 단계 농도별 알코올을 이용하여 함수시킨 후 proteinase-K(20 μg/ mL; Millipore, USA)를 15분간 처리하여 PBS로 2회 씻어낸 후 equilibration buffer를 10초간, working-strength TdTenzyme을 37℃에서 1시간 동안 처리하였다.
- Klotho의 발현을 면역조직화학염색과 Western blot을 통하여 발현 부위별 차이를 알아보았다. 면역염색 상에서 정상 콩팥의 Klotho는 주로 겉질 부위에서 발현하며, 먼쪽곱슬세관(distal convoluted tubule)과 연결세관(connecting tubule)에서 발현하는 것을 확인하였고 속속질 부위의 집합관 세포(collecting duct)에서도 발현됨을 확인하였다(Fig.
- 전사된 막(membrane)은 5% skim milk (TBS-T)로 비특이성 단백질을 차단하였고 각각의 1차 항체 TNF-α(1 : 500), TWEAK(1 : 300), NF-κB(1 : 1000), Klotho(1 : 500)를 4℃에서 하루 동안 처리하였다. TBS-T로 세척을 한 막에 2차 항체(anti-mouse IgG, anti-rabbit IgG)를 1시간 처리한 뒤, 항체와 결합한 막을 chemiluminescence system (Bio-Rad Laboratories, USA)으로 측정, Image Lab software(Bio-Rad Laboratories)로 분석하였다.
- The levels of plasma blood urea nitrogen and Creatinine concentration after cisplatin injection (5 mg/kg). The rats (n = 6/ group) were sacrificed 5 (5D) and 10 days (10D) after cisplatin (5 mg/kg) intraperitoneal injection. Values are expressed as mean ± SEM of 3~4 independent experiments, *p < 0.
- The levels of plasma blood urea nitrogen and Creatinine concentration after cisplatin injection (5 mg/kg). The rats (n = 6/ group) were sacrificed 5 (5D) and 10 days (10D) after cisplatin (5 mg/kg) intraperitoneal injection. Values are expressed as mean ± SEM of 3~4 independent experiments, *p < 0.
- 또한 시스플라틴 투여 후 5일째의 조직에서 병리 조직학적인 변화와 함께 자가사멸한 세포를 H&E와 TUNEL 염색을 통해서 확인하였다.
- 추후 stopwash buffer를 10분간 처리하여 반응을 멈추고, PBS로 씻어낸 뒤 anti-digoxigenin-peroxidase로 30분간 처리 후 3,3’-diaminobenzidin(DAB)을 이용해 발색하였다. 발현의 분석은 광학현미경(Nikon eclipse 80i; Nikon, Japan)을 이용하여 100배 확대한 후 조직의 겉질(cortex), 바깥속질(outer medullar), 속속질(inner medullar)에서 각각 염색된 세포 수 대 총 세포 수의 비율을 계산하여 측정하였다.
- 부검에 앞서 래트의 마취를 위해 Tiletamine과 Zolazepam의 합제(30 mg/kg; Virbac, Carros, FRA)를 복강 투여한 후 복대동맥을 통한 PBS 관류로 방혈을 마친 후 periodate lyine paraformaldehyde(PLP)로 5분간 관류하여 콩팥을 고정하였다. 적출된 콩팥을 1~2 mm의 시상 절편으로 잘라 4℃ PLP에서 하루 동안 후 고정 뒤 조직 탈수과정을 거쳐 polyester wax로 포매한 후 microtome을 이용하여 5 μm로 박절하여 슬라이드 절편을 만들어 면역염색과 H&E 염색에 사용하였다.
- 래트의 미정맥을 통해 채혈한 후 4℃에서 30분간 거치한 후 2,000 × g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 분리했다. 수거한 혈청을 자동혈청분석기를 이용하여 혈청 내의 혈중 요소질소 수치와 크레아티닌 수치를 분석하였다(IDEXX Laboratories, USA).
- 적출된 콩팥을 1~2 mm의 시상 절편으로 잘라 4℃ PLP에서 하루 동안 후 고정 뒤 조직 탈수과정을 거쳐 polyester wax로 포매한 후 microtome을 이용하여 5 μm로 박절하여 슬라이드 절편을 만들어 면역염색과 H&E 염색에 사용하였다.
- 전사된 막(membrane)은 5% skim milk (TBS-T)로 비특이성 단백질을 차단하였고 각각의 1차 항체 TNF-α(1 : 500), TWEAK(1 : 300), NF-κB(1 : 1000), Klotho(1 : 500)를 4℃에서 하루 동안 처리하였다.
- 조직 절편은 자일렌을 통해 polyester wax를 제거하였고, 단계 농도별 알코올을 이용하여 함수시킨 후 proteinase-K(20 μg/ mL; Millipore, USA)를 15분간 처리하여 PBS로 2회 씻어낸 후 equilibration buffer를 10초간, working-strength TdTenzyme을 37℃에서 1시간 동안 처리하였다.
- 순화과정을 거친 래트는 군당 6마리씩 세 개의 군으로 나누었다. 첫 번째 군은 대조군으로 증류수를 복강 내 투여한 후 5일 뒤에 부검을 하였고, 두 번째와 세 번째 군은 시스플라틴(5 mg/ kg; Sigma, USA)을 복강 내 주입한 각각 5일과 10일 뒤에 부검을 하였다. 모든 실험은 충남대학교 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 수행되었다.
- TWEAK(1 : 50; Abcam), NF-κB(1 : 300; Abcam)를 4℃에서 하루 동안 처리하였다. 추후 2차 항체(anti-mouse IgG, anti-rabbit IgG; Abcam) 처리 과정을 거친 뒤 DAB로 발색하고 봉입 과정을 거쳐 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.
대상 데이터
- 1% sodium dodecyl sulfate, with a protease inhibitor cocktail)를 통해 만들어진 단백질 샘플은 Bradford assay로 정량하여 실험에 사용하였다. 단백질 샘플은 6~15%의 SDS-polyacrylamide gels을 사용하였고, nitrocellulose membrane을 이용하여 전사하였다. 전사된 막(membrane)은 5% skim milk (TBS-T)로 비특이성 단백질을 차단하였고 각각의 1차 항체 TNF-α(1 : 500), TWEAK(1 : 300), NF-κB(1 : 1000), Klotho(1 : 500)를 4℃에서 하루 동안 처리하였다.
- 본 실험에서는 4주령 된 SPF Sprague-Dawley 수컷 래트(오리엔트바이오, 대한민국) 18마리를 1주간 순화한 후 사용하였으며, 적절한 온도, 습도 (22 ± 2℃, 55 ± 5%, 12시간 광주기) 하에 사료와 식수는 자유롭게 제공되었으며 모든 동물은 충남대학교 실험동물센터에서 사육되었다.
- 콩팥 부위별 분석을 위하여 적출한 콩팥을 겉질, 바깥속질, 속속질의 부위별로 나눈 조직 샘플을 이용하여, 용해 buffer(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, with 150 mM sodium chloride, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate 및 0.1% sodium dodecyl sulfate, with a protease inhibitor cocktail)를 통해 만들어진 단백질 샘플은 Bradford assay로 정량하여 실험에 사용하였다. 단백질 샘플은 6~15%의 SDS-polyacrylamide gels을 사용하였고, nitrocellulose membrane을 이용하여 전사하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 mean values ± standard error of the mean(SEM)으로 나타내었으며 통계 분석은 Dunnet-test를 따르는 one-way ANOVA를 사용하였다.
성능/효과
- 10일째에서는 5일째보다 발현이 감소했다. TWEAK은 대조군의 시스플라틴 투여 5일째와 투여 10일째의 발현에서 차이는 보이지 않았으나, 토리쪽곱슬세관의 핵에서 대조군보다는 발현이 증가했으며(Fig. 6), Western blot결과에서도 사이토카인의 발현은 시스플라틴 투여 후 5일째에 증가하며 10일째에는 감소하는 양상을 보였다. 세부 부위별로 살펴보면 NF-κB는 시스플라틴 투여 5일째의 전 부위에서 많이 증가했고, TNF-α는 시스플라틴 투여 5일째 군에서 겉질보다 바깥속질과 속속질에서 증가하였고 10일째에 비교적 감소하는 것으로 나타났다.
- 2). 대조군의 콩팥 조직은 정상의 조밀한 세포질과 함께 정상의 형태를 보였으나, 시스플라틴 투여 후 5일이 지난 콩팥에서 겉질과 바깥속질 부위에서 세뇨관의 팽창, 표피의 박리, 사멸 세포 등을 관찰할 수 있으며, 속속질에서는 내강의 폐색이 나타났다. 이러한 형태적 변화는 시스플라틴 투여 후 10일이 경과한 조직에서는 5일의 조직에 비해 적게 관찰되었다.
- 본 실험을 통해서 면역염색과 Western blot을 통한 단백질 발현 양상을 관찰한 결과, Klotho 발현은 사이토카인의 발현 양상과 반대의 경향을 나타낸다는 이전의 연구와 일치하는 것을 확인하였다. 또한 면역염색상에서 시스플라틴의 특징적인 손상 부위인 바깥속질 바깥줄무늬의 토리쪽곱슬세관 토리쪽3분절 부위(s3 segment of proximal tubule in the outer stripe of outer medulla)에서 염증성 사이토카인의 발현이 가장 활발함을 확인하였으며, 염증성 사이토카인은 Klotho의 발현이 감소한 5일째에 증가하고 손상이 수복된 것으로 추정되는 10일째에는 그 발현이 감소하였다. TWEAK는 TNF와 기능적인 측면은 유사하지만 TNF에 비해 상대적으로 더 넓게 발현되는 것으로 알려졌다 [2].
- 면역 염색에서 NF-κB는 시스플라틴 투여 후 5일이 된 콩팥의 토리쪽곱슬세관(proximal convoluted tubule)의 핵에서 그 염색상을 관찰할 수 있었으며 TNF-α는 대조군에서 토리쪽곱슬 세관의 세포질의 기저막(basal membrane)에서 발현이 나타났다.
- Klotho의 발현을 면역조직화학염색과 Western blot을 통하여 발현 부위별 차이를 알아보았다. 면역염색 상에서 정상 콩팥의 Klotho는 주로 겉질 부위에서 발현하며, 먼쪽곱슬세관(distal convoluted tubule)과 연결세관(connecting tubule)에서 발현하는 것을 확인하였고 속속질 부위의 집합관 세포(collecting duct)에서도 발현됨을 확인하였다(Fig. 4). 이러한 발현은 시스플라틴 투여 후 5일째에 대조군과 비교하면 겉질 부위의 먼쪽곱슬세관과 연결세관에서 감소하며 속질 부위의 집합관 세포에서도 감소하는 것을 확인하였다.
- Klotho는 정상적으로 콩팥의 세뇨관 세포에서 발현된다고 알려졌으며 정상 콩팥의 먼쪽곱슬세관에서 높게 발현하고, 토리쪽곱슬세관에서는 상대적으로 낮게 발현하는 것으로 보고된 바 있다[6]. 본 실험에서 면역염색실험 결과, Klotho의 발현은 겉질의 연결세관, 먼쪽곱슬세관 및 토리 일부에서도 나타남을 확인하였으며, 바깥속질과 속속질의 집합관 세포에서도 발현이 나타났다. 하지만 Western blot의 결과상 속속질 부위의 Klotho의 발현은 시스플라틴 투여 후에도 감소하지 않았다.
- 콩팥 손상으로 인하여 사구체 여과율과 콩팥 혈류가 감소하면 혈중요소질소와 혈청 크레아티닌의 수치는 증가하게 된다. 본 실험에서 시스플라틴 투여 후 5일이 경과한 군의 혈중요소질소과 크레아티닌의 수치는 대조군과 비교했을 때 각각 7배가량 증가하였다. 또한 시스플라틴 투여 후 5일째의 조직에서 병리 조직학적인 변화와 함께 자가사멸한 세포를 H&E와 TUNEL 염색을 통해서 확인하였다.
- 또한, 염증으로 인한 콩팥의 손상 시 TWEAK와 TNF-α가 NF-κB를 통해 콩팥의 Klotho를 감소시킨다는 연구가 보고된 바 있다 [13]. 본 실험을 통해서 면역염색과 Western blot을 통한 단백질 발현 양상을 관찰한 결과, Klotho 발현은 사이토카인의 발현 양상과 반대의 경향을 나타낸다는 이전의 연구와 일치하는 것을 확인하였다. 또한 면역염색상에서 시스플라틴의 특징적인 손상 부위인 바깥속질 바깥줄무늬의 토리쪽곱슬세관 토리쪽3분절 부위(s3 segment of proximal tubule in the outer stripe of outer medulla)에서 염증성 사이토카인의 발현이 가장 활발함을 확인하였으며, 염증성 사이토카인은 Klotho의 발현이 감소한 5일째에 증가하고 손상이 수복된 것으로 추정되는 10일째에는 그 발현이 감소하였다.
- 본 실험에서 5일째에 증가한 TWEAK의 발현은 10일째 군에서도 그 발현이 지속되었다. 본 연구를 통해, 시스플라틴에 의한 콩팥 손상 시 발생하는 염증 반응과 Klotho 발현 양상은 관련이 있으며, 손상이 생긴 후 수복됨에 따라 손상 부위에서의 Klotho 발현이 부위별로 복구되는 것을 확인하였다. 추후 Klotho의 발현 기전에 대한 추가 연구를 통해 콩팥 손상에 따른 방어기전으로서 Klotho의 새로운 시각을 제공할 수 있을 것이다.
- 세부 부위별로 살펴보면 NF-κB는 시스플라틴 투여 5일째의 전 부위에서 많이 증가했고, TNF-α는 시스플라틴 투여 5일째 군에서 겉질보다 바깥속질과 속속질에서 증가하였고 10일째에 비교적 감소하는 것으로 나타났다.
- 시스플라틴 투여 후 5일이 경과한 군의 혈중요소질소와 혈청 크레아티닌의 수치는 72.50 ± 26.1 mg/dL과 7.78 ± 0.91 mg/dL, 10일이 경과한 군에서는 39.38 ± 22.58 mg/dL과 3.46 ± 1.37 mg/dL로 대조군과 비교했을 때 유의성 있게 증가했으나, 시스플라틴 투여 후 10일째에는 5일째와 비교하여 약 50%의 수치가 감소해서 대조군과 비교하여 유의성이 있을 뿐 5일째와는 통계학적 유의성이 관찰되지 않았다.
- 4). 이러한 발현은 시스플라틴 투여 후 5일째에 대조군과 비교하면 겉질 부위의 먼쪽곱슬세관과 연결세관에서 감소하며 속질 부위의 집합관 세포에서도 감소하는 것을 확인하였다. 핵에 집중되어 있던 염색상이 옅어짐을 관찰할 수 있었고 시스플라틴 투여 10일 후의 조직에서는 5일째의 조직에서 감소했던 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- 세부 부위별로 살펴보면 NF-κB는 시스플라틴 투여 5일째의 전 부위에서 많이 증가했고, TNF-α는 시스플라틴 투여 5일째 군에서 겉질보다 바깥속질과 속속질에서 증가하였고 10일째에 비교적 감소하는 것으로 나타났다. 하지만, TWEAK의 발현은 시스플라틴 투여 5일째에 전 부위에서 증가하였으며, 증가한 발현양상은 시스플라틴을 투여한 뒤 5일과 10일이 지난 콩팥에서 유의성이 관찰되지 않았다(Fig. 5).
- 이러한 발현은 시스플라틴 투여 후 5일째에 대조군과 비교하면 겉질 부위의 먼쪽곱슬세관과 연결세관에서 감소하며 속질 부위의 집합관 세포에서도 감소하는 것을 확인하였다. 핵에 집중되어 있던 염색상이 옅어짐을 관찰할 수 있었고 시스플라틴 투여 10일 후의 조직에서는 5일째의 조직에서 감소했던 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. Western blot에서도 부위에 따른 차이는 있었지만 시스플라틴 투여 후에 Klotho의 발현이 감소했음을 확인할 수 있었다(Fig.
후속연구
- 본 연구를 통해, 시스플라틴에 의한 콩팥 손상 시 발생하는 염증 반응과 Klotho 발현 양상은 관련이 있으며, 손상이 생긴 후 수복됨에 따라 손상 부위에서의 Klotho 발현이 부위별로 복구되는 것을 확인하였다. 추후 Klotho의 발현 기전에 대한 추가 연구를 통해 콩팥 손상에 따른 방어기전으로서 Klotho의 새로운 시각을 제공할 수 있을 것이다.
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