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문제 정의
- 본 연구는 한외여과법을 이용하여 알러지 원인 PLA2를 제거하고 그 외 유효성분인 apamin, melittin의 함량변화를 확인하고 유지할 수 있는 한외여과 조건을 찾고자 하였다. 한외여과효과에 영향을 미치는 압력과 수용액의 농도, filter의 분획분자량을 달리하여 다양한 조건에서 함량변화를 보았다.
제안 방법
- 건조된 정제봉독(PBV)을 증류수에 10 mg/mL, 2 mg/mL, 1 mg/mL 되도록 각각의 농도에 맞추어 녹인 후 불순물을 제거하기 위해 0.45 µm (Sartosius, USA) syringe filters를 이용하여 여과하였다.
- 1 따라서 봉독약침요법을 임상에 사용할 때에는 안전을 위하여 알러지 발생원인 성분을 원천 적으로 차단하여야한다. 본 연구에서는 PL A2를 완전히 제거하고 주성분이 melittin과 apamin으로 구성되는 분리정제봉독을 얻기 위하여 한외여과법을 사용하였다. 한외여과에서의 압력, 농도, 분자크기를 조절하여, PL A2 분리에 대한 최적조건을 구하였으며, high performance liguid chromatography (HPLC)와 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE)로 확인하였다.
- 봉독의 apamin, PLA2, melittin 정량분석을 위해 waters의 HPLC system을 이용하였으며. column은 온도를 25 ℃로 설정하였다.
- 한외여과효과에 영향을 미치는 압력과 수용액의 농도, filter의 분획분자량을 달리하여 다양한 조건에서 함량변화를 보았다. 봉독의 유효성분 들이 가지는 분자량을 통해 filter의 분획분자량을 5,000 Dalton, 10,000 Dalton, 30,000 Dalton으로 결정하고 한외여과기에 제한되는 최대압력(75 psi)과 filter의 효율, 수명을 고려하여 압력을 20, 30, 40 psi로 선정하였다. 실제 실험을 통하여 압력이 높다고 해서 높은 함량을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
- 45 µm (Sartosius, USA) syringe filters를 이용하여 여과하였다. 불순물과 PL A2 여과 제거를 위하여 여과막 기공크기를 실제 성분의 분자 크기(Tabel 1)와 비교하여 선택하였다. 봉독의 유효성 분이 변성되지 않고 효과를 유지하기 위해 온도를 0~4 ℃를 유지한 상태에서 증류수에 적신 한외여과막필터를 한외여과기내에 넣고 조립하고 교반하면서 소량의 증류수를 넣는다.
- 시료의 각 성분 함량은 standard의 calibration curve 와 각 성분의 면적을 산출하여 아래 계산식 (1)을 통해 함량을 계산하였다.
- SDS PAGE power supply 통하여 staking gel에서 60V로 약 30 min동안 작동시키고, separating gel에서 120V로 약 60-90 min동안 작동시킨다. 시료의 성분은 power supply에서 흘려주는 전류를 따라 gel에서 분자량 별로 분리되고, coomassie brilliant bule G-250 염료와 destaining solution으로 염색/탈색 후 band를 확인하여 봉독의 알레르기 유발물질인 hyaluronidase, PL A2 등의 물질이 분리되었는지 확인하였다.
- 여과한 후 봉독을 녹인 수용액을 한외여과기에 넣고, 20,30,40 psi로 압력을 각각 다르게 여과하였다. 여과 후 동결건조하고 HPLC를 이용하여 함량을 분석하였다.
- 봉독의 유효성 분이 변성되지 않고 효과를 유지하기 위해 온도를 0~4 ℃를 유지한 상태에서 증류수에 적신 한외여과막필터를 한외여과기내에 넣고 조립하고 교반하면서 소량의 증류수를 넣는다. 여과한 후 봉독을 녹인 수용액을 한외여과기에 넣고, 20,30,40 psi로 압력을 각각 다르게 여과하였다. 여과 후 동결건조하고 HPLC를 이용하여 함량을 분석하였다.
- column은 온도를 25 ℃로 설정하였다. 이동상으로는 0.2% TFA water(A)와 0.22% TFA acetonitrile(B)를 100:0 비율로 시작하여 20분간 서서히 50:50으로 용매비율을 변화시킨 후 30분간 서서히 다시 100:0 비율로 변화시켜 사용하였다. 1.
- 정제봉독(PBV)의 대표적인 3 가지 주요 유효성분인 apamin, PL A2, melittin의 지표물질인 apamin(0.5mg, 순도 ≥ 99.5%), phospholipase A2 (1 mg, 순도 ≥ 90.72%), melittin (5 mg, 순도 ≥ 92.0%)을 증류수 10 mL에 용해시키고 20, 30, 40 mL씩을 측정하고, 시료의 농도는 1.0 mg/mL로 정확히 만들어 측정하여 표준곡선정량 분석법으로 분석하였다.
- 정제봉독의 주요 유효성분인 apamin, PL A2, melittin의 정량을 분석하기 위해 정확성을 검증하기 위해 지표물질을 20, 30, 40 µL로 loading하여 크로마토그램(Fig. 1)과 calibration curve(X축: amout, Y축: Peak area)(Fig. 2)를 작성하였다.
- 증류수를 이용하여 10 mg/mL, 2 mg/mL, 1 mg/mL 각각의 농도에 맞추어 녹인 봉독액을 압력과 분획분자량(cut off size)를 달리하여 한외여과하고 동결건조 후 정확성이 검증된 HPLC를 이용하여 함량을 측정하였다. 그 결과 phospholipase A2의 경우 5,000 Dalton, 10,000 Dalton에서 제거가 되었으며 30,000 Dalton에서는 제거 되지 않았다.
- 크로마토그램을 통해 봉독의 주요 3 가지 유효성분의 머무름시간(apamin: 10.7 min, PLA2: 16.4 min, melittin: 21.9 min)8과 peak를 확인하고 실험의 재연성을 확인하였다(Fig. 1).
- 본 연구에서는 PL A2를 완전히 제거하고 주성분이 melittin과 apamin으로 구성되는 분리정제봉독을 얻기 위하여 한외여과법을 사용하였다. 한외여과에서의 압력, 농도, 분자크기를 조절하여, PL A2 분리에 대한 최적조건을 구하였으며, high performance liguid chromatography (HPLC)와 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE)로 확인하였다.
- 를 제거하고 그 외 유효성분인 apamin, melittin의 함량변화를 확인하고 유지할 수 있는 한외여과 조건을 찾고자 하였다. 한외여과효과에 영향을 미치는 압력과 수용액의 농도, filter의 분획분자량을 달리하여 다양한 조건에서 함량변화를 보았다. 봉독의 유효성분 들이 가지는 분자량을 통해 filter의 분획분자량을 5,000 Dalton, 10,000 Dalton, 30,000 Dalton으로 결정하고 한외여과기에 제한되는 최대압력(75 psi)과 filter의 효율, 수명을 고려하여 압력을 20, 30, 40 psi로 선정하였다.
대상 데이터
- SDS-PAGE 실험에는 30% acrylamide/bis solution (Bio-Rad, USA), Tris-HCl (Tech&I, BTH-9180-500M), SDS (Bio-Rad), APS (Bio-Rad), TEMED (Bio-Rad)을 구입하여 gel을만들었고, coomassie brilliant blue G-250 (Bio-Rad)와 destaining solution (Bio-Rad)을 사용하였다. Presision plus protein dual xtra standards (Bio-Rad)을 구입하여 marker로 사용하였다. 0.
- SDS-PAGE 실험에는 30% acrylamide/bis solution (Bio-Rad, USA), Tris-HCl (Tech&I, BTH-9180-500M), SDS (Bio-Rad), APS (Bio-Rad), TEMED (Bio-Rad)을 구입하여 gel을만들었고, coomassie brilliant blue G-250 (Bio-Rad)와 destaining solution (Bio-Rad)을 사용하였다.
- 분석을 위한 HPLC 분석장비는 Waters 1525 µ binary HPLC pump, Waters 486 detector, Waters 717 plus autosampler와 column은 Jupiter 4u proteo 90Å (Phenomenex, USA)을 사용하였다. SDS-PAGE 실험에는 Mini protean tetra cell and power pac supply (Bio-rad, 165-8025)를 구입하여 사용하였다.
- 국내에서 사육중인 서양종 꿀벌(Apis mellifera L.)의 봉독을 봉독채집장치 ((주)청진바이오텍, 한국)를 사용하여 채집하고 봉독의 간이정제방법2을 통해 불순물을 제거한 후 -56 ℃에서 -75 ℃의 온도로 동결 건조하여 분말형태인 순수 봉독(PBV)을 사용하였다.
- 분석을 위한 HPLC 분석장비는 Waters 1525 µ binary HPLC pump, Waters 486 detector, Waters 717 plus autosampler와 column은 Jupiter 4u proteo 90Å (Phenomenex, USA)을 사용하였다.
- 한외여과기(ultrafiltration)는 millpore (amicon Stirred Cell Model 8200)제품을 사용하였으며 기기에 사용된 membrane filter는 millpore (ultracel ultrafiltration discs 5,000 Dalton, 10,000 Dalton, 30,000 Dalton)제품을 사용하였다. 초정밀저울은 XP 105 (Mettler toledo, USA) 모델을 사용하였다.
- 함량분석에 사용된 봉독의 지표물질은 멜리틴 (melittin; from bee venom, Sigma-Aldrich), 아파민 (apamin; from bee venom, Sigma-Aldrich), 포스포리파 아제 A2 (PL A2; from bee venom, Sigma-Aldrich)을 구입하여 추가 정제과정 없이 사용하였고, 용매로는 acetonitrile (이하 AN; Sigma-Aldrich), trifluoroacetic acid (이하 TFA; Sigma-Aldrich)를 사용하였다. SDS-PAGE 실험에는 30% acrylamide/bis solution (Bio-Rad, USA), Tris-HCl (Tech&I, BTH-9180-500M), SDS (Bio-Rad), APS (Bio-Rad), TEMED (Bio-Rad)을 구입하여 gel을만들었고, coomassie brilliant blue G-250 (Bio-Rad)와 destaining solution (Bio-Rad)을 사용하였다.
데이터처리
- 검정곡선은 apamin, PL A2, melittin 각각의 주입량 대비 peak 면적비를 산출하여 계산하였고 상관계수를 이용하여 높은 정확도를 검증하였다.
이론/모형
- Laemmli의 SDS-PAGE 방법(1970)3,7을 이용하였으며, 20%의 gel 조성을 만들고 고정된 glass plate에 약 10 mL 정도 분주한 후 평형을 맞추기 위해 물을 약 1~2 mL정도 분주하여 separating gel을 굳히고, 위에 분주한 물을 제거하고 staking gel 조성물 약 5 mL을 분주 후, gel이 굳기 전에 comb를 끼워 굳히고 staking gel까지 굳으면 comb를 제거하여 SDS PAGE gel을 완성시킨다(Table 3).
- 한외여과기(ultrafiltration)는 millpore (amicon Stirred Cell Model 8200)제품을 사용하였으며 기기에 사용된 membrane filter는 millpore (ultracel ultrafiltration discs 5,000 Dalton, 10,000 Dalton, 30,000 Dalton)제품을 사용하였다. 초정밀저울은 XP 105 (Mettler toledo, USA) 모델을 사용하였다. 분석을 위한 HPLC 분석장비는 Waters 1525 µ binary HPLC pump, Waters 486 detector, Waters 717 plus autosampler와 column은 Jupiter 4u proteo 90Å (Phenomenex, USA)을 사용하였다.
성능/효과
- 봉독에서 가장 효과적인 성분인 melittin은 5,000 Dalton 분획분자량의 membrane filter를 사용했을 때 봉독액의 농도가 낮아질수록 함량이 올라가지만 희석농도, 압력이 달라져도 통과율과 함량이 정제봉독에 비해 30%미만으로 나타났다. 10,000 Dalton에서도 농도가 낮아질수록 함량이 증가하였으나 30,000 Dalton의 경우에는 농도가 높을수록 함량이 증가함을 보였다. 압력변화에서도 20 psi를 가해주었을 때 가장 높은 함량을 보였는데(Fig.
- band를 확인할 수 있었다. 20 psi 압력을 가해주고 1 mg/mL 농도에서 10,000 Dalton filter 사용한 조건에서는 PLA2 band가 나타나지 않음을 확인하였다.
- 4 min에서 20 psi 압력을 가해주고 10 mg/mL 농도에서 30,000 Dalton filter를 사용한 조건에서 정제봉독에 비해 낮은 PLA2 peak를 확인할 수 있었다. 20 psi 압력을 가해주고 1 mg/mL 농도에서 10,000 Dalton filter 사용한 조건에서는 PLA2 peak가 나타나지 않음을 확인하였다. 또한 두 조건 모두 melittin과 apamin은 정제봉독의 수준을 유지하고 있음을 알 수 있다.
- 5를 통해 알 수 있듯이 20 psi의 압력으로 10 mg/mL의 농도에서 30,000 Dalton membrane filter를 사용한 경우 여러 가지 조건 중에서도 가장 높은 melittin의 함량을 나타내었지만 phospholipase A2가 완전히 제거되지 않고 2% 이하 함유하였다. 20 psi의 압력으로 1 mg/mL의 농도에서 10,000 Dalton membrane filter를 사용한 경우에는 1mg/mL의 농도에서 10,000 Dalton membrane filter를 사용한 조건에 비해 melittin 함량이 3% 낮았으나 phospholipase A가 제거되었음을 알 수 있었으며 이를 HPLC와 SDS-PAGE를 통해 확인하였다(Fig. 6, Fig. 7).
- SDS-PAGE를 이용한 결과 봉독의 주요 3 가지 유효 성분의 standard와 정제봉독, 두 가지 조건을 함께 비교하였을 때 HPLC와 마찬가지로 20 psi 압력을 가해 주고 10 mg/mL 농도에서 30,000 Dalton filter를 사용한 조건에서 정제봉독에 비해 옅은 PLA2 band를 확인할 수 있었다. 20 psi 압력을 가해주고 1 mg/mL 농도에서 10,000 Dalton filter 사용한 조건에서는 PLA2 band가 나타나지 않음을 확인하였다.
- 이는 PLA2의 분자량이 13,000 Dalton으로 5,000 Dalton, 10,000 Dalton에 비해 cut-off pore size가 큰 30,000 Dalton에서 완전히 걸러지지 않고 일부 유출되기 때문으로 보인다. 또한 압력에 따라 정제봉독을 녹인 수용액의 농도에 상관없이 30 psi에서 함량이 낮고 20 psi, 40 psi에서 높은 일정한 패턴을 보였다(Fig. 3). 낮은 함량을 보인 30 psi의 경우 같은 교반속도에서 20 psi 보다 높은 압력인 30 psi를 가하게 되면 막 표면의 밀도가 높아지는 농도분극현상 8에 의해 PL A2가 유출되지 않았기 때문으로 보인다.
- 봉독에서 가장 효과적인 성분인 melittin은 5,000 Dalton 분획분자량의 membrane filter를 사용했을 때 봉독액의 농도가 낮아질수록 함량이 올라가지만 희석농도, 압력이 달라져도 통과율과 함량이 정제봉독에 비해 30%미만으로 나타났다. 10,000 Dalton에서도 농도가 낮아질수록 함량이 증가하였으나 30,000 Dalton의 경우에는 농도가 높을수록 함량이 증가함을 보였다.
- 봉독의 유효성분 들이 가지는 분자량을 통해 filter의 분획분자량을 5,000 Dalton, 10,000 Dalton, 30,000 Dalton으로 결정하고 한외여과기에 제한되는 최대압력(75 psi)과 filter의 효율, 수명을 고려하여 압력을 20, 30, 40 psi로 선정하였다. 실제 실험을 통하여 압력이 높다고 해서 높은 함량을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 정제봉 독을 녹인 수용액의 경우 1 mg/mL 보다 저 농도로 한외여과하게 되면 물의 비중이 많아져 동결 건조시에 어려움이 발생하게 되고 10 mg/mL 이상으로 고농도가 되면 용액의 전도도가 높아져 단백질이 침전되는 현상과 단백질 성분간의 결합으로 분자량의 크기가 증가하는 현상이 나타기 때문에 1 mg/mL, 2 mg/mL, 10 mg/mL의 농도로 결정하였다.
- 위에서 크로마토그램을 통해 봉독의 주요 3가지 유효성분의 머무름시간(apamin: 10.7 min, PLA2: 16.4 min, melittin: 21.9 min)과 peak를 확인한 결과를 바탕으로 PLA2의 머무름 시간인 16.4 min에서 20 psi 압력을 가해주고 10 mg/mL 농도에서 30,000 Dalton filter를 사용한 조건에서 정제봉독에 비해 낮은 PLA2 peak를 확인할 수 있었다. 20 psi 압력을 가해주고 1 mg/mL 농도에서 10,000 Dalton filter 사용한 조건에서는 PLA2 peak가 나타나지 않음을 확인하였다.
- 위의 다양한 조건 변화를 통해 PLA2가 제거되고 정제봉독의 apamin과 melittin 함량(50-60%)이 비슷한 조건(20 psi의 압력으로 1 mg/mL의 농도에서 10,000 Dalton 막필터를 사용한 조건)을 찾을 수 있었다.
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